溶藻弧菌附著定植因子ACFA蛋白的原核表達(dá)、抗原性鑒定及生物信息學(xué)分析

劉 祥

(1. 陜西理工學(xué)院中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001；2. 陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001)

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溶藻弧菌附著定植因子ACFA蛋白的原核表達(dá)、抗原性鑒定及生物信息學(xué)分析

劉 祥

(1. 陜西理工學(xué)院中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001；2. 陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001)

溶藻弧菌附著定植因子ACFA蛋白具有很好的免疫原性，在疫苗上有應(yīng)用前景。本試驗(yàn)通過分子克隆獲得ACFA蛋白的表達(dá)菌株，利用SDS-PAGE切膠純化與尿素濃度梯度復(fù)性獲得ACFA蛋白，免疫小鼠制備抗血清，Western-blotting檢測發(fā)現(xiàn)ACFA蛋白具有很好的抗原性。利用在線軟件預(yù)測ACFA蛋白為親水的分泌型蛋白，存在多個(gè)酶切位點(diǎn)；采用TMHMM Server v.2.0程序預(yù)測ACFA無跨膜結(jié)構(gòu)并定位于細(xì)胞膜外；SOPMA服務(wù)器預(yù)測ACFA二級結(jié)構(gòu)中含無規(guī)則卷曲32.56 %，a-螺旋25.58 %，β-轉(zhuǎn)角6.05 %，β-片層35.81 %。通過SignalP 4.1軟件分析顯示，ACFA的1～18位氨基酸為信號肽序列。通過Swiss-Model程序預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)顯示，ACFA蛋白沒有配體。利用ABCpred和BepiPred方案，預(yù)測ACFA存在4個(gè)B細(xì)胞表位。運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法預(yù)測ACFA具有2個(gè)CTL表位。使用MHC-II類分子結(jié)合肽在線程序預(yù)測發(fā)現(xiàn)ACFA存在2個(gè)Th表位。

溶藻弧菌；ACFA蛋白；細(xì)胞表位；蛋白結(jié)構(gòu)；預(yù)測

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)為革蘭陰性菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)主要的病原菌之一，每年由于弧菌感染給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來巨大損失[1-2]；該菌也可導(dǎo)致人類的傷口感染與胃腸道疾??；是一種人與海洋動物共患病原菌[3-4]。當(dāng)前，大量使用抗生素是防治弧菌疾病的主要手段[5]，難以避免抗生素濫用所導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性提高、食品安全，以及環(huán)境污染等問題[6]。

附著定植因子A(Accessory colonization factor A, ACFA)是一種細(xì)菌致病菌毛調(diào)控蛋白[7]，可促進(jìn)細(xì)菌對小鼠腸道的粘附作用，同時(shí)提高菌體的毒性，是弧菌重要毒力蛋白之一[8]。研究發(fā)現(xiàn)ACFA蛋白C-端同源性較強(qiáng)，可能在蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、維持細(xì)菌穩(wěn)定性上起到重要作用[9-10]；此外，將ACFA蛋白免疫魚類，攻毒溶藻弧菌，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的抗體可耐受溶藻弧菌的感染[11]。因而，ACFA蛋白是研制亞單位疫苗很好的候選抗原[12]。

本研究對ACFA蛋白進(jìn)行了原核克隆、表達(dá)與純化，并制備了特異性較好的小鼠抗血清。而對ACFA蛋白理化性質(zhì)、有效抗原及表位的預(yù)測和篩選是疫苗研究的基礎(chǔ)。因而，本研究借助于生物學(xué)技術(shù)，采用多參數(shù)預(yù)測的方式，對ACFA蛋白的理化性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)，以及優(yōu)勢的B/T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測，為ACFA蛋白疫苗的研制，尤其是多肽表位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

溶藻弧菌、E.coliDH5a菌株、E.coliBL21菌株，以及pET-28a質(zhì)粒由本校生物化學(xué)菌種中心保存；T4-DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶，以及Taq酶由大連寶生物公司提供；Protein Marker、NDA Marker、IPTG、蛋白胨、酵母粉，以及引物合成均夠于西安沃爾森公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒夠于上海生物工程公司；二抗由Sigma公司提供；昆明鼠夠于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；其它試劑均為國產(chǎn)分析純，夠于漢中市興盛化學(xué)儀器公司。

1.2 ACFA重組蛋白的構(gòu)建

根據(jù)NCBI公布溶藻弧菌的acfA基因，登錄號為：CP006719.1.0設(shè)計(jì)引物：Primer 1: 5’- ACAGGATCCATGAACAAAACACTTCTT-3’；Primer 2: 5’- CCTCTCGAGTTAGAAGTAATAAGTTGTG-3’，下劃線為限制性內(nèi)酶位點(diǎn)BamH I和XhoI。PCR反應(yīng)體系(25 μl)包含：PCR緩沖液2.5 μl，基因組模板2.5 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，25 μmol/L引物各0.5 μl，Taq酶0.3 μl，補(bǔ)水至25 μl。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃變性3 min，30個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s)，72 ℃充分延伸10 min，最后4 ℃保溫。將PCR產(chǎn)物與pET-28a質(zhì)粒載體進(jìn)行BamH I和XhoI雙酶切后，連接酶鏈接入pET-28a質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化入E.coliDH5a克隆菌株，并對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測，進(jìn)一步的重組質(zhì)粒序列測定正確后，轉(zhuǎn)化E.coliBL21表達(dá)菌株[13]。

1.3 ACFA重組蛋白的原核表達(dá)檢測與純化

將過夜培養(yǎng)的重組蛋白菌株，以1∶100倍轉(zhuǎn)接入新鮮的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2.5 h后，加入適量的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，獲得的菌體通過SDS-PAGE蛋白電泳檢測重組蛋白表達(dá)情況。重組蛋白表達(dá)成功后，大量培養(yǎng)獲得菌體，并結(jié)合SDS-PAGE蛋白電泳切膠的方法，對ACFA蛋白進(jìn)行純化[14]。

采用尿素濃度梯度的方法復(fù)性純化的ACFA蛋白。主要步驟為：首先將ACFA蛋白溶解于8 mol/L尿素中，然后置于透析袋中，接著分別置于6、4、2 mol/L尿素中各4 h，最后置于 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)中4 h，獲得復(fù)性的ACFA蛋白，并將其進(jìn)行蛋白電泳，檢驗(yàn)濃度與純度[15]。

1.4 ACFA重組蛋白小鼠多克隆抗體制備

選取昆明鼠5只，每只免疫50 μg ACFA蛋白，第1次小鼠免疫采用弗氏完全佐劑，免疫14 d后，利用弗氏不完全佐劑進(jìn)行第2次小鼠免疫，7 d后進(jìn)行第3次免疫，最后小鼠眼部取血，并將血清置于4 ℃冰箱中析出，離心收集上清，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存[14]。

1.5 ACFA抗原性鑒定

利用Western blotting方法檢測ACFA蛋白抗原性。為消除重組蛋白自帶的組氨酸標(biāo)簽蛋白抗體的影響，采用溶藻弧菌的ACFA蛋白進(jìn)行試驗(yàn)。主要步驟為：收集溶藻弧菌，加入2×SDS loading buffer蛋白上樣緩沖液，沸水中煮樣5 min，SDS-PAGE蛋白電泳后，轉(zhuǎn)NC膜，加入1∶400與1∶800倍稀釋的小鼠ACFA重組蛋白抗血清，對照加入陰性抗血清，37 ℃孵育40 min，洗滌后，加入二抗，最后DAB顯色，檢測ACFA蛋白的抗原性[16]。

1.6 ACFA蛋白的生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)相關(guān)預(yù)測網(wǎng)站和軟件，分析ACFA蛋白的主要理化性質(zhì)。親水性預(yù)測網(wǎng)站：http://web.expasy.org/，ACFA蛋白生化指標(biāo)預(yù)測網(wǎng)站：http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/，酶切位點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站：http://web.expasy.org/-peptide cutter/。并通過Signal P4.1軟件預(yù)測信號肽，TMHMM Server v.2.0程序預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，SOPMA軟件預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，Swiss-Model模型預(yù)測三維結(jié)構(gòu)。B細(xì)胞抗原表位預(yù)測綜合了ABCpred與BepiPred 2種方法，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)抗原表位預(yù)測通過CTLpred程序，輔助T細(xì)胞(Th)表位預(yù)測使用在線服務(wù)網(wǎng)站：http://www.imtech.res.in/raghava/propred/。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACFA蛋白重組基因的構(gòu)建

利用PCR的方法從基因組中擴(kuò)增獲得約650 bp的片段大小，與ACFA基因的大小一致(圖1-A)。重組質(zhì)粒的雙酶切檢測獲得約650 bp片段，與目的基因大小一致(圖 1-B)；序列測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NCBI公布的基因序列相同，證明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

M：Protein marker；A：acfA基因的PCR擴(kuò)增，B：acfA基因重組質(zhì)粒的雙酶切檢測；1，acfA基因；2，acfA基因重組質(zhì)粒；3，acfA基因重組質(zhì)粒雙酶切M: Protein marker; A: acfA gene by PCR; B: The restriction enzyme analysis of acfA gene recombinant plasmid; 1, acfA gene; 2, recombinant plasmid of acfA gene; 3, restriction enzyme of acfA recombinant plasmid圖1 溶藻弧菌ACFA重組蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction recombinant plasmid of V. alginolyticus ACFA protein

2.2 ACFA重組蛋白的原核表達(dá)檢測與純化

為檢驗(yàn)重組蛋白的原核表達(dá)情況，將ACFA表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行蛋白電泳(圖2)顯示：原核表達(dá)獲得了約24 ku的蛋白條帶，大小與ACFA蛋白一致。將ACFA表達(dá)菌株大量培養(yǎng)，獲得的包涵體進(jìn)行蛋白電泳切膠純化。而純化的ACFA沒有生物學(xué)活性，需采用尿素濃度梯度復(fù)性方法，對純化的ACFA蛋白進(jìn)行復(fù)性，結(jié)果如圖2所示。

2.3 ACFA重組蛋白抗原性鑒定

通過將溶藻弧菌全蛋白組電泳，轉(zhuǎn)NC膜，與不同稀釋度的ACFA抗血清進(jìn)行Western blotting試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在對應(yīng)的ACFA蛋白條帶處出現(xiàn)明顯條帶；而對照血清無條帶呈現(xiàn)(圖3)。揭示制備的重組ACFA蛋白抗血清可與ACFA蛋白特異性合，表明重組ACFA蛋白具有很好的抗原性。

M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:未誘導(dǎo)的ACFA菌株；2:IPTG誘導(dǎo)的ACFA菌株；3:SDS-PAGE切膠純化與復(fù)性的ACFA蛋白M:Protein marker; 1: No induced ACFA strain; 2: IPTG induced ACFA strain; 3: SDS-PAGE gel slices and urea gradient renature purification of ACFA protein圖2 ACFA重組蛋白的原核表達(dá)檢測與純化Fig.2 Prokaryotic expression and purification of ACFA protein

A、B分別表示1∶400與1∶800倍稀釋的重組ACFA蛋白抗血清；C：陰性對照血清(1∶400倍稀釋)A and B were expressed as recombinant ACFA antiserum with 1∶400 and 1∶800, respectively; C∶ Negative control antiserum with 1:400 times dilution 圖3 ACFA蛋白抗原性檢測Fig.3 Antigenicity identification of ACFA protein

2.4 ACFA蛋白生物信息學(xué)分析

2.4.1 ACFA蛋白生化指標(biāo)預(yù)測 將ACFA蛋白序列提交至網(wǎng)站http://www.expasy.org/protscale/，進(jìn)行疏水性分析。結(jié)果顯示，ACFA蛋白疏水性最強(qiáng)的分值為2.556，最弱為-2.344；總平均疏水性指數(shù) (Grand average of hydropathicity, GRAVY) 為-0.256(圖4)，表明ACFA蛋白為親水性蛋白。通過在線網(wǎng)站預(yù)測獲得ACFA分子量為23.77 ku，等電點(diǎn)為4.57，脂溶性指數(shù)(Aliphatic index)為78.51。將ACFA蛋白序列提交至網(wǎng)站：http://web.expasy.org/peptide_cutter/分析其酶切位點(diǎn)，結(jié)果顯示ACFA蛋白有多個(gè)酶切位點(diǎn)，其中蛋白酶 K有117個(gè)，胃蛋白酶(pH>2)81個(gè)，胃蛋白酶(pH 1.3)50個(gè)，嗜熱菌蛋白酶59個(gè)。

2.4.2 ACFA蛋白信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用在線軟件SignalP 4.1分析顯示，ACFA蛋白的1～18位氨基酸可能為信號肽序列(圖5)。根據(jù)丹麥科技大學(xué)(DTU)的CBS服務(wù)器上的 TMHMM Serverv.2.0程序顯示ACFA蛋白在1～20位氨基酸可能有跨膜結(jié)構(gòu)，但是可信度低，僅有0.4(圖6)；而且1～18位氨基酸預(yù)測為信號肽，ACFA蛋白成熟時(shí)該多肽被切除?？梢?，ACFA蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，全部位于細(xì)菌的膜外。

圖4 溶藻弧菌ACFA蛋白疏水性分析Fig.4 Analysis of the hydrophobicity of V. alginolyticus ACFA protein

圖5 溶藻弧菌ACFA蛋白信號肽預(yù)測Fig.5 Signal peptide prediction for V. alginolyticus ACFA protein

圖6 溶藻弧菌ACFA蛋白跨膜區(qū)預(yù)測Fig.6 Transmembrane domain prediction for V. alginolyticus ACFA protein

2.4.3 ACFA蛋白二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 依據(jù)SOPMA服務(wù)器在線預(yù)測ACFA蛋白二級結(jié)構(gòu)(圖7)顯示，a-螺旋氨基酸所占比例為25.58 %，β-轉(zhuǎn)角為6.05 %，無規(guī)則卷曲為32.56 %，β-片層為35.81 %。采用SWISS-MODEL程序，模版蛋白選用maf.1.A，構(gòu)建ACFA蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其沒有配體，如圖8所示。

c：無規(guī)則卷曲；e：β-片層；h：a-螺旋；t：β-轉(zhuǎn)角c: Random coil; e: Extended strand; h: Alpha helix; t: Beta turn圖7 溶藻弧菌ACFA蛋白蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Prediction of the secondary structure of V. alginolyticus ACFA protein

2.4.4 ACFA蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測 利用氨基酸的性質(zhì)(親水性、柔韌性、可及性、極性、暴露表面、轉(zhuǎn)角) 和隱形馬爾可夫模型的BepiPred在線預(yù)測(設(shè)定表位閾值0.35)顯示，ACFA蛋白的28～41、43～51、76～85、91～99、136～145、166～171和199～204區(qū)段存在優(yōu)勢B細(xì)胞表位(表1)。通過ABCpred在線軟件，采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法，預(yù)測線性表位，獲得ACFA可能的B細(xì)胞表位區(qū)段(表2)。綜合BepiPred和ABCpred兩種方案的共同多肽序列，最終獲得ACFA蛋白最可能的優(yōu)勢B細(xì)胞表位區(qū)段為：28～37，76～85，91～99，136～144。

表1 BepiPred方案預(yù)測溶藻弧菌ACFA蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置

表2 ABCpred方案預(yù)測溶藻弧菌ACFA蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置

表3 溶藻弧菌ACFA蛋白CTL表位預(yù)測

表4 溶藻弧菌ACFA蛋白的Th表位預(yù)測

2.4.5 ACFA蛋白的T細(xì)胞表位預(yù)測 CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)表位預(yù)測采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法結(jié)合量化矩陣法，通過CTLPred在線服務(wù)網(wǎng)站，獲得ACFA的CTL抗原表位為：49～57位的ELEGGIFSG，以及106～114位的ITAKQVSLA(表3)。

Th(T輔助細(xì)胞)表位通過在線程序進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測多肽類型選擇DRB1*0101、DRB1*0102和DRB1*0301(表4)，綜合預(yù)測的共有區(qū)段，結(jié)果顯示ACFA蛋白可能的最優(yōu)勢Th抗原表位為：151～158肽區(qū)段的VANDDVEI，以及172～180肽區(qū)段的LGAMFSVGA。

3 討 論

溶藻弧菌給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失，而目前綠色、生態(tài)養(yǎng)殖給疾病的防治提出更高的要求。蛋白亞單位疫苗具有無毒、成本低、無耐藥性等特點(diǎn)，受到人們高度重視[17-18]。本研究成功構(gòu)建溶藻弧菌ACFA原核表達(dá)菌株，純化獲得ACFA蛋白，并驗(yàn)證ACFA蛋白具有很好的抗原性，這為研究ACFA蛋白功能與疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

生物信息可以很好的預(yù)測蛋白的理化性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)，尤其是抗原表位的預(yù)測，在疫苗的研制上受到人們的關(guān)注[19]。因而，通過生物信息學(xué)分析可以減少實(shí)驗(yàn)的盲目性，大大提高實(shí)驗(yàn)的成功率，在疫苗研制和免疫診斷上應(yīng)用廣泛[20]。本研究通過計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)，對溶藻弧菌ACFA蛋白進(jìn)行生化指標(biāo)、親水性、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、二級與三級結(jié)構(gòu)，以及B/T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測。分析表明ACFA為親水性蛋白，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，位于細(xì)胞膜外，并且N端的1-18位氨基酸為信號肽序列?？梢?，通過信號肽指導(dǎo)ACFA蛋白分泌到細(xì)胞外，ACFA是一種分泌性蛋白[9]。并且信號肽預(yù)測可以避免預(yù)測出的B/T細(xì)胞抗原表位落在信號肽區(qū)段，提高抗原表位預(yù)測的準(zhǔn)確性。此外，在二級結(jié)構(gòu)上，ACFA構(gòu)成主要為無規(guī)則卷曲與β-片層。無規(guī)則卷曲易于產(chǎn)生盤旋、扭曲，有利于抗體結(jié)合，常含有優(yōu)勢的B細(xì)胞抗原表位[21]，這為ACFA蛋白的免疫能力提供保障。

目前，預(yù)測蛋白B細(xì)胞表位較為準(zhǔn)確的代表軟件為BepiPred和ABCpred。BepiPred主要利用氨基酸的性質(zhì)(親水性、柔韌性、可及性、極性、暴露表面、轉(zhuǎn)角) 和隱形馬爾可夫模型預(yù)測線性表位[22]；ABCpred基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，準(zhǔn)確率可高達(dá)65.9 %[23]。本研究結(jié)合BepiPred和ABCpred 2種軟件進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測，結(jié)合兩者共同顯示的表位；并兼顧ACFA蛋白二級結(jié)構(gòu)，選取無規(guī)則卷曲區(qū)，盡量避免α-螺旋區(qū)，推測ACFA蛋白B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位可能為：28～37，76～85，91～99，136～144區(qū)段。

CTL抗原表位是可與MHC-I 類分子結(jié)合，并共同被T細(xì)胞抗原受體(TCR)特異性識別，誘發(fā)CTL免疫應(yīng)答的短肽，對CTL特異性殺傷效應(yīng)具有決定性作用[24-25]。CTL表位預(yù)測的方法較多，有人利用軟件BIMAS、SYFPEITHI和RANKPEP對CTL表位進(jìn)行預(yù)測[20, 26]。王光祥等利用在線軟件，采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法結(jié)合量化矩陣法成功預(yù)測羊口瘡病毒F1L蛋白CTL表位[24]。本研究利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法結(jié)合量化矩陣法，進(jìn)行ACFA蛋白的CTL表位預(yù)測。結(jié)果顯示ACFA蛋白的CTL表位為：49～57位的ELEGGIFSG，以及106-114位的ITAKQVSLA。這些ACFA蛋白的肽段可能與MHC-I類分子結(jié)合，通過抗原的呈遞作用，最終激活CTL細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[24, 27]。

Th表位是可與MHC-II類分子結(jié)合的抗原表位，形成抗原肽-MHC-II類分子復(fù)合物，通過APC細(xì)胞的呈遞作用，可被相應(yīng)的CD4+T細(xì)胞識別，從而激活Th細(xì)胞活性，以輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。Th表位預(yù)測方法較為成熟，病毒蛋白[24]、細(xì)菌蛋白[27]均實(shí)現(xiàn)很好的Th表位預(yù)測。本研究利用在線服務(wù)程序，選擇DRB1-0101、DRB1-0102、DRB1-03013 3種等位基因預(yù)測ACFA蛋白的Th表位。Th抗原表位為：151～158區(qū)段的VANDDVEI，以及172～180區(qū)段的LGAMFSVGA。這些ACFA蛋白的氨基酸序列可能與MHC-II類分子結(jié)合形成復(fù)合物，經(jīng)APC細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，實(shí)現(xiàn)與CD4+T細(xì)胞結(jié)合，激活機(jī)體的免疫反應(yīng)[28]。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Prokaryotic Expression, Antigenicity Identification and Bioinformatics Analysis ofVibrioalginolyticusAccessory Colonization Factor ACFA

LIU Xiang

(1. Chinese-German Joint Institute for Natural Product Research, Shaanxi University of Technology, Shaanxi Hanzhong 723001, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center of Tall Gastrodia Tuber and Medical Dogwood, Shaanxi Hanzhong 723001, China)

Vibrioalginolyticus(V.alginolyticus) accessory colonization factor A (ACFA) had good immunogenicity for application prospect in vaccine development. The ACFA expression strain was obtained by molecular clone. ACFA was purified by the way of SDS-PAGE gel slices, renatured by urea gradient, immunized mice to prepare antiserum and found that ACFA had good antigenicity using Western-blotting. By online software, the prediction results showed that ACFA protein was a hydrophilic and secreted protein, multiple restriction enzyme sites existed. TMHMM Server v.2.0 software predicted that ACFA had not transmembrane structure and located outside cell membrane. ACFA secondary structure contained random coil helix 32.56 %, alpha helix 25.58 %, beta turn 6.05 %, extended strand 35.81 % by SOPMA method. Using the SignalP 4.1 software analysis showed that the 1-18 amino acids of ACFA were signal peptide sequence. The 3D structure prediction found that ACFA protein had not ligand by Swiss-Model program. Using ABCpred and BepiPred prediction program, ACFA had 4 B cell epitopes. By the prediction method of quantitative matrix and neural network, ACFA protein had 2 CTL epitopes. ACFA protein had 2 Th epitopes using an online server prediction for MHC class II peptide binding affinity.

Vibrioalginolyticus; Accessory colonization factor ACFA protein; Protein structure; Cell epitope; Prediction

1001-4829(2016)07-1755-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.045

2015-06-24

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-088)

劉 祥(1983-)，男，安徽合肥人，博士，講師，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)與免疫學(xué)，E-mail: liuxiang888525@163.com。

S942

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