珍稀樹種花櫚木組培不同外植體的無菌繁殖體系構(gòu)建

喬 棟，韋小麗，李 群

(貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴陽 貴州 550025)

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珍稀樹種花櫚木組培不同外植體的無菌繁殖體系構(gòu)建

喬 棟，韋小麗*，李 群

(貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴陽 貴州 550025)

為構(gòu)建花櫚木組織培養(yǎng)的無菌繁殖體系，采用隨機區(qū)組試驗方法研究不同藥劑組合對其籽苗莖段、幼苗莖段和葉片、成年植株莖段和嫩葉等外植體的消毒效果。結(jié)果表明：籽苗莖段以70 %乙醇消毒30 s+0.1 %升汞滅菌8 min+培養(yǎng)基中添加PPM 0.5 mL/L的消毒效果最好；幼苗外植體最佳采集時間為4月，莖段用70 %乙醇浸泡30 s+(50 mg/L利福平+50 mg/L氯霉素)混合液浸泡30 min+0.1 %升汞浸泡8 min消毒效果最好，葉片用70 %乙醇浸泡30 s+(50 mg/L利福平+50 mg/L氯霉素)混合液浸泡30 min+0.1 %升汞浸泡6 min消毒效果最好；成年植株葉片以4月采集較好，最佳消毒方法為70 %乙醇浸泡30 s+(50 mg/L利福平+50 mg/L氯霉素)混合液浸泡30 min+0.1 %升汞浸泡12 min，成年植株莖段尚未取得理想消毒效果。

花櫚木；外植體；消毒方法

花櫚木(OrmosiahenryiPrain)為豆科(Leguminosae)紅豆屬(Ormosia)常綠喬木，又名花梨木，屬國家二級重點保護植物和珍貴用材樹種[1]。由于花櫚木野生植株稀少，結(jié)實困難，結(jié)實率及種子繁殖系數(shù)低[2]，因而建立花櫚木組織培養(yǎng)快繁體系、擴大其繁殖系數(shù)對保護花櫚木野生資源，提高人工培育種苗的繁殖效率具有重要意義。

有關(guān)花櫚木組織培養(yǎng)技術(shù)的相關(guān)研究已有文獻報道。姚軍等[3]采用花櫚木種子無菌萌發(fā)獲得的帶葉莖段進行組織培養(yǎng)研究；高麗等[4]采用花櫚木種子無菌萌發(fā)獲得的胚軸進行組織培養(yǎng)及后續(xù)的耐冷性誘導(dǎo)。然而，目前已有研究采用的外植體均來源于種子無菌萌發(fā)材料，尚未見有關(guān)采用花櫚木自然萌發(fā)植株和成年植株外植體進行組培的報道，在繁殖材料方面存在局限性。其原因可能是自然萌發(fā)植株和成年植株外植體內(nèi)生菌多，無菌培養(yǎng)體系建立困難[5-8]。為此，筆者以自然條件下生長的花櫚木植株的籽苗莖段、幼苗莖段和嫩葉、成年植株莖段和嫩葉作外植體，采用隨機區(qū)組試驗方法研究各消毒劑不同消毒時間組合對花櫚木不同外植體的消毒效果，旨在尋求花櫚木不同外植體的有效消毒方法，擴大組織培養(yǎng)外植體的來源，為花櫚木組織培養(yǎng)中無菌繁殖體系的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 外植體 花櫚木籽苗莖段、幼苗莖段和葉片、成年植株莖段和嫩葉，其中籽苗莖段來源于氣候箱內(nèi)播種萌發(fā)10 d的花櫚木籽苗，剪取3 cm長莖段(帶頂芽)做外植體；幼苗外植體取自貴州大學(xué)苗圃當(dāng)年生播種苗，分別于4、8和12月剪取帶頂芽長約6 cm的莖段(帶1～2個側(cè)芽，不帶葉片)作為外植體；成年植株外植體取自貴州大學(xué)苗圃7年生及農(nóng)場20年生花櫚木帶頂芽枝條，分別于4、8和12月剪取當(dāng)年生長約20 cm半木質(zhì)化枝條進行試驗。將各種莖段剪成1.5 cm長帶頂芽或帶側(cè)芽莖段(不帶葉片)，將幼苗和成年植株莖段上的當(dāng)年生葉片切成1 cm×1 cm大小作為外植體。

1.1.2 試劑 植物組培抗菌劑(PPM)、利福平、鏈霉素和氯霉素，美國Phytotech公司生產(chǎn)，購自北京西美杰公司。啟動培養(yǎng)基自制，配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L，pH 5.8～6.0。

1.1.3 儀器與設(shè)備 LDZX-50E高壓滅菌鍋，SW-CJ-1D單人超凈工作臺。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 分別將采集的籽苗外植體、幼苗外植體和成年植株外植體用洗滌劑浸泡15 min、30 min和1 h，然后在流水下分別沖洗30 min、1 h和2 h，并用牙刷輕輕刷洗，成年植株外植體需去除表面絨毛。之后所有材料在超凈工作臺內(nèi)用70 %乙醇浸泡30 s，用無菌水沖洗2～3次后備用。

1.2.2 試驗設(shè)計 試驗設(shè)16個處理(表1)。供試材料分別按表1進行消毒并用無菌水沖洗4～5次后接種到啟動培養(yǎng)基中，每個處理接種15瓶，每瓶接種外植體1個。接種后置(25±2)℃、光照強度3 000 lx下培養(yǎng)，光照時間12 h/d條件下培養(yǎng)。

1.2.3 測定內(nèi)容 接種后每天觀察、記錄材料污染情況，并統(tǒng)計污染率、存活率、誘導(dǎo)率和滅菌有效值。

污染率=(污染數(shù)/接種數(shù))×100%

存活率=(存活數(shù)/接種數(shù))×100%

誘導(dǎo)率=(成功誘導(dǎo)數(shù)/存活數(shù))×100%

滅菌有效值=(1-污染率)×成活率×誘導(dǎo)率×100%

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽苗莖段的消毒效果

由表2可知，以籽苗莖段為外植體的各處理中，處理3和處理4的污染率低，滅菌有效值為44.45%～87.10 %；處理3消毒效果優(yōu)于處理2；培養(yǎng)基中添加PPM的處理4其外植體的污染率顯著降低，僅為6.67 %，存活率顯著提高，達93.33 %，比未添加PPM的處理3提高26.66 %。因此，對籽苗莖段而言，用70 %乙醇浸泡30 s+0.1 %升汞浸泡8min+PPM消毒效果最好。

表1 花櫚木不同外植體的消毒方法

表2 不同處理花櫚木籽苗莖段的消毒效果

2.2 幼苗外植體的消毒效果

2.2.1 葉片 從表3可知，以幼苗葉片為外植體，4月采集的幼苗葉片，污染率和存活率相對較低，為0～40 %；誘導(dǎo)率(處理13和處理16除外)較高，為50 %～100 %；8和12月采集的葉片，盡管存活率高，為70 %～100 %，但誘導(dǎo)率均為0。用(100 mg/L苯菌靈+100 mg/L鏈霉素)混合液浸泡30 min(處理11～13)與(50 mg/L利福平+50 mg/L氯霉素)混合液浸泡30 min(處理14～16)均能有效降低4月采集幼苗葉片的污染率，其污染率均為0，低于處理9和處理10，但其存活率降低。處理11～16抗菌素用量產(chǎn)生的效果差異不明顯，外植體存活率和誘導(dǎo)率均隨升汞處理時間增加而降低，其中以處理14的消毒效果最好，存活率和誘導(dǎo)率分別為33.33 %和60 %，滅菌有效值達19.99 %。因此，4月采集的幼苗葉片外植體最佳處理方式為70 %乙醇浸泡30 s+(50 mg/L利福平+50 mg/L氯霉素)混合液浸泡30 min+0.1 %升汞浸泡6 min。

2.2.2 莖段 從表3還可知，不同時期采集莖段的污染率(處理9除外)依次為4月>8月>12月，但大多數(shù)消毒處理的污染率差異不明顯，處理9～16的污染率平均值比較接近。與葉片消毒相比，處理9～16的消毒方法均可對莖段產(chǎn)生較好效果。說明，幼苗莖段外植體對取材時間沒有葉片要求嚴格。外植體存活率(處理11除外)則表現(xiàn)為12月>8月>4月?？赡芘c4月幼苗莖段較幼嫩有關(guān)。誘導(dǎo)率以4月最高，平均誘導(dǎo)率為70.86 %，12月次之，平均誘導(dǎo)率為58.67 %， 8月最低，平均誘導(dǎo)率為55.71 %。外植體存活率和誘導(dǎo)率均隨升汞處理時間增加而降低。從滅菌有效值看，各月采集的材料以處理9、處理10和處理15的效果較好。但需要注意的是，雖然8月及12月的外植體材料滅菌有效值高于4月，但外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織較少且容易褐化。因此，建議4月采集的莖段用處理10消毒，即70 %乙醇浸泡30 s+0.1 %升汞浸泡6 min+培養(yǎng)基中添加PPM；8月和12月采集的莖段用處理15消毒，即用70 %乙醇浸泡30 s+(50 mg/L利福平+50 mg/L氯霉素)混合液浸泡30 min+0.1 %升汞浸泡8 min消毒。

表3 不同處理花櫚木當(dāng)年生幼苗葉片和莖段的消毒效果

表4 不同處理花櫚木成年植株葉片和莖段的消毒效果

2.3 成年植株外植體

2.3.1 葉片 從表4可知，不同時期采集的成年植株外植體其污染率依次為8月>12月>4月，8月的葉片帶菌多，滅菌困難。與幼苗葉片相比，成年植株葉片消毒困難，即使是4月采集的葉片外植體，污染率也在60 %以上，培養(yǎng)基中添加PPM 0.5 mL/L的滅菌效果仍然很差。處理5～9以處理8的滅菌效果較好，添加抗菌劑處理后，其污染率為66.67 %，存活率為33.33 %，誘導(dǎo)率為80 %，滅菌有效值為8.89 %。因此，用成年植株葉片外植體，以4月采集為宜，其最佳消毒及誘導(dǎo)處理方式為70 %乙醇浸泡30 s+(50 mg/L利福平+50 mg/L氯霉素)混合液浸泡30 min+0.1 %升汞浸泡12 min。

2.3.2 莖段 從表4還可知，成年植株莖段外植體消毒比其葉片更困難。其中，4和12月采集的莖段相對帶菌較少，其污染率低于60 %，8月的帶菌最多，無論哪種滅菌處理均全部污染。成年植株莖段消毒效果以12月采集莖段用處理7消毒的滅菌效果較好，污染率為63.67 %，存活率為33.33 %。但從誘導(dǎo)率看，以4月采集莖段采用處理6(在培養(yǎng)基中添加PPM 0.5 mL/L)消毒的滅菌效果較好，誘導(dǎo)率達100 %。從滅菌有效值看，處理6和處理7的滅菌效果均較差。

3 結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)過程中，無菌培養(yǎng)體系的建立是獲得組培苗的重要環(huán)節(jié)。該試驗結(jié)果表明，籽苗外植體以70 %乙醇消毒30 s+0.1 %升汞滅菌8 min+70 %乙醇消毒30 s+培養(yǎng)基中添加PPM 0.5 mL/L的消毒效果最好；幼苗外植體以4月采集較好，其幼苗莖段用70 %乙醇浸泡30 s+(50 mg/L利福平+50 mg/L氯霉素)混合液浸泡30 min+0.1 %升汞浸泡8 min的消毒效果最好，幼苗葉片用70 %乙醇浸泡30 s+(50 mg/L利福平+50 mg/L氯霉素)混合液浸泡30 min+0.1 %升汞浸泡6 min消毒效果最好。成年植株葉片外植體以4月采集較好，最佳消毒方法為70 %乙醇浸泡30 s+(50 mg/L利福平+50 mg/L氯霉素)混合液浸泡30 min+0.1 %升汞浸泡12 min。

研究發(fā)現(xiàn)，采用抗菌劑(50 mg/L利福平+50 mg/L氯霉素)混合液及(100 mg/L苯菌靈+100 mg/L鏈霉素)混合液浸泡對花櫚木幼苗葉片、莖段和成年植株葉片消毒均能起到較好的滅菌效果，污染率較低，其成活率和誘導(dǎo)率均較高。

在培養(yǎng)基中添加PPM只在籽苗莖段滅菌中具有良好效果，對于幼苗及成年植株葉片和莖段的滅菌效果并不顯著。在植物組織培養(yǎng)中使用抗菌劑成本較高，應(yīng)謹慎考慮其適用范圍。

不同取材部位及取材時間對外植體的消毒難易程度有極大影響[9-13]。取材時間對多數(shù)植物的組織培養(yǎng)都有一定的影響[14-17]。該研究發(fā)現(xiàn)，4月及12月采集的外植體其消毒效果優(yōu)于8月，可能與4月之后溫度上升導(dǎo)致菌類活躍性上升有關(guān)。另外，由于4月植物生長較旺盛，因而此時取材的外植體誘導(dǎo)效果更好。同時，消毒時選用幼嫩葉片及帶頂芽莖段比下部莖段消毒效果更好。因為其生長時間不長，雜菌等附著物較少，因而較容易滅菌。但花櫚木成年植株莖段的消毒仍有待進一步研究。

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(責(zé)任編輯 王 海)

Establishment of Sterile Propagation System of Different Explant for Rare SpeciesOrmosiahenryiin Tissue Culture

QIAO Dong, WEI Xiao-li*，LI Qun

(Forest College, Guizhou University, Guizhou Guiyang 550025, China)

In order to establish the sterile system ofO.henryifor tissue culture, stem segment of ten days seedling, leaf and stem segment of seedling and adult tree were used to study the sterilization effects of different combination of reagent on the tissue culture through a random block experiment. Results: 70 % alcohol soak 30 s+0.1 % HgCl2soak 8 minutes+PPM 0.5 mL/L have the best sterilization effect for stem segment of ten days seedling. The optimum collecting time of seedling explant is April, the optimum sterilization method of leaf for seedling and stem segment for seedling are 70 % alcohol soak 30 s+(50 mg/L Rifampicin+50 mg/L Chloramphennicol)+0.1 % HgCl2soak 6 minutes and 70 % alcohol soak 30 s+(50 mg/L Rifampicin+50 mg/L Chloramphennicol)+0.1 % HgCl2soak 8 minutes. The optimum collecting time of leaf explant for adult tree is April, and the best sterilization method is 70 % alcohol soak 30 s+(50 mg/L Rifampicin+50 mg/L Chloramphennicol)+0.1 % HgCl2soak 12 minutes, but the stem segment of adult tree has not achieved optimum sterilization effect.

Ormosiahenryi; Explant; Sterilization method

1001-4829(2016)07-1719-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.039

2015-10-13

國家自然科學(xué)基金“花櫚木根瘤菌多樣性及幼苗形成調(diào)控因素研究”(31460193)；貴州省國際合作項目“珍貴用材樹種花櫚木精準(zhǔn)化容器育苗理論與技術(shù)研究”[G字(2012)7012]；貴州省林業(yè)廳重大攻關(guān)“貴州優(yōu)質(zhì)闊葉用材樹種培育技術(shù)與示范”[黔林科合(2010)重大02號]；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金“組培過程中不同家系花櫚木的影響探究”(貴大研農(nóng)2015003)；貴州大學(xué)SRT項目“花櫚木組織培養(yǎng)外植體的滅菌技術(shù)探討”[貴大SRT字(2014)113號]

喬 棟(1991-)，男，在讀碩士，研究方向：林木植物組織培養(yǎng)，E-mail：610064918@163.com,*為通訊作者。

S792.99；Q813.1+2

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