神經膠質瘤細胞ATF5表達水平對HCMV復制的影響

張 雪， 錢冬萌， 胡 明， 陳 豪， 李 玲， 張 麗， 宋旭霞， 王 斌

(青島大學醫(yī)學院 病原生物學教研室，山東 青島 266071)

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神經膠質瘤細胞ATF5表達水平對HCMV復制的影響

張 雪， 錢冬萌， 胡 明， 陳 豪， 李 玲， 張 麗， 宋旭霞， 王 斌*

(青島大學醫(yī)學院 病原生物學教研室，山東 青島 266071)

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV) 在神經膠質瘤細胞中的復制水平不一，其機制尚不清楚。本研究通過下調轉錄激活因子5(ATF5)在神經膠質瘤細胞中的表達，檢測HCMV感染神經膠質瘤細胞后病毒復制水平的變化。首先用HCMV AD169 (MOI=5) 分別感染U87、SY5Y及A172細胞,觀察細胞形態(tài)變化，分別在24、48、72、96、120 h取各時間點上清液檢測病毒滴度；Real-time PCR檢測HCMV即刻早期基因(IE2)、早期基因(UL44)、晚期基因(UL99)及ATF5的表達情況;Western-blot檢測病毒基因編碼蛋白及ATF5表達的情況。結果顯示HCMV在U87、SY5Y細胞中復制水平與病毒在A172細胞中復制水平相比，U87、SY5Y細胞組明顯高于A172細胞組(P<0.05)，ATF5表達在U87、SY5Y細胞組與A172細胞組相比，U87、SY5Y細胞組ATF5表達明顯高于A172組(P<0.05)；利用慢病毒介導的RNA干擾技術下調ATF5在U87、SY5Y細胞的表達，用HCMV感染細胞檢測病毒基因及蛋白的表達，結果ATF5表達下調可抑制HCMV的復制(P<0.05)。以上結果表明，在膠質瘤細胞中下調ATF5表達水平可以抑制HCMV的復制水平。

人巨細胞病毒；轉錄激活因子5；復制；人膠質瘤細胞；病毒基因

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)屬于β皰疹病毒亞科，是人類皰疹病毒中最大的一組病毒。在人群中，HCMV感染相當普遍，大多數(shù)感染呈臨床隱性感染或潛伏感染；但在新生兒、免疫抑制或免疫功能低下的人群中則可引起臨床顯性感染，出現(xiàn)明顯癥狀， 甚至發(fā)生致死性疾病。HCMV基因在宿主細胞內的轉錄、表達呈現(xiàn)一定時序性,即表達可分為即刻早期(immediately，early IE)、早期(early，E)和晚期(late，L)，IE基因編碼產生的即刻早期蛋白可激活E基因編碼的蛋白參與病毒復制，L基因編碼蛋白參與病毒顆粒的結構組成[1]。HCMV感染和惡性神經膠質瘤關系密切，Cobbs等[2]對27例不同級別的膠質瘤組織(Ⅱ～Ⅳ級)、腦膜瘤組織、正常腦組織進行免疫組化檢測，結果顯示，膠質瘤均可檢測到HCMV基因的表達，且隨惡性程度增高而增高，而腦膜瘤組織、正常腦組織均未檢測到HCMV基因的表達。有研究表明CREB-A可以和IE蛋白相互作用，并可以激活HCMV UL112-113啟動子，從而啟動病毒基因表達[3-6]。有文獻報道當機體感染HSV-1時，ATF5可以通過某些潛在的機制促進HSV-1病毒的復制[7]。而我們研究中的轉錄激活因子5(ATF5)是轉錄因子ATF/CREB家族成員之一，具有亮氨酸拉鏈(bZIP)的特征結構域，能與細胞內多種蛋白分子相互作用，共同調節(jié)基因的轉錄[8-9]。因此推測：神經膠質瘤細胞中ATF5的表達水平可影響HCMV在神經膠質瘤細胞中的復制水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞 HCMV AD169毒株由法國巴斯德研究所贈送，按常規(guī)方法傳代，滴定。人胚肺成纖維細胞(HELF)由本實驗室保存，用于HCMV病毒的擴增。U87、SY5Y、A172細胞購自上海細胞庫，按常規(guī)方法培養(yǎng)、傳代后，第5代后用于本實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清(FBS，Hyclone)、MEM(Hyclone)、DMEM(Hyclone)、DMEM/F12(Hyclone)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma)、Trizol(Invitrogen)、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)、Real-time PCR Master Mix(Roche)、RIPA 細胞裂解液(Solarbio)、PMSF(Solarbio) 、Anti-Cytomegalovirus IE(ViroStat)、anti-UL44 (Santa Cruz Biotechnology)、anti-UL99(Santa Cruz Biotechnology)、Anti-ATF5 antibody(abcom)、HRP山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG、BIO RAD Real-time PCR儀(My-iQ Optics Module)、蛋白凝膠電泳系統(tǒng)(韋伯)、激光共聚焦顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 HCMV病毒增殖和滴度測定 取出凍存的HCMV AD169毒株(法國巴斯德研究所惠贈)，在流水中迅速融化，將對數(shù)生長期的HELF更換2%血清培養(yǎng)基，加入200 μL病毒懸液，將其放入37 ℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)2 h，期間每隔15 min輕輕搖動培養(yǎng)瓶。棄掉培養(yǎng)液后，加入含有2%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，觀察并記錄細胞的變化，當細胞出現(xiàn)病變效應達80%以上時用細胞刮刀刮取細胞，收集細胞及培養(yǎng)液，-86 ℃反復凍融3次，使細胞破裂病毒顆粒被釋放，1 000 r/min離心10 min，收集上清液為病毒儲存液，分裝于EP管放于-86 ℃冰箱保存?？瞻叨繖z測病毒滴度為106pfu/mL。

1.2.2 HCMV感染膠質瘤細胞后收集上清檢測病毒滴度 HCMV AD169 (MOI=5)分別感染U87、SY5Y、A172和HELF細胞,觀察細胞形態(tài)變化，分別在24、48、72、96、120 h取各時間點上清液離心。將HELF接種于24孔板，細胞形成單層后棄掉培養(yǎng)液，分別取上清0.2 mL/孔加到24孔板內，每個樣品設3個平行對照，并以不接種病毒的HELF作正常對照，于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)使病毒充分吸附后棄掉病毒液，加入1 mL含1%低熔點瓊脂糖、2% FBS的培養(yǎng)液，室溫下凝固后，置于恒溫箱中倒置培養(yǎng)后加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),10 d后取出培養(yǎng)板,顯微鏡下計數(shù)空斑數(shù)?？瞻咝纬蓡挝唬簆fu/mL=每孔內空斑平均數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/每孔接種的病毒量(mL)。

1.2.3 熒光定量PCR分別檢測IE2、UL44、UL99 及ATF5 mRNA的表達水平變化 HCMV AD169 (MOI=5)分別感染U87、SY5Y及A172細胞，分別在0、12、24、48、72 h 用Trizol法提取RNA，紫外分光光度計定量后將RNA反轉錄成cDNA, 置于-20 ℃用于Real-time PCR的模板。Real-time PCR 采用β-actin作為內參基因，內參基因與目的基因各設3個平行反應管。引物由上海生工生物有限公司合成， β-actin上游引物5′-TCGTGGGCCGCTCTAGGCAC-3′，下游引物5′-TGGCCTTAGGGTTCAGGGGG-3′； IE2上游引物5′-TGACCGAGGATTGCAACGA-3′，下游引物5′-CGGCATGATTGACAGCCTG-3′； UL44上游引物5′-TACAACAGCGTGTCGTGCTCCGCG -3′，下游引物5′-GGCGTGAAAAACATGCGTATCAAC-3′； UL99上游引物5′-GTGTCCCATTCCCGACTCG-3′，下游引物5′-TTCACAACGTCCACCCACC-3′；ATF5上游引物5′-AAGTCGGCGGCTCTGAGGTA-3′，下游引物5′-GGACTCTGCCCGTTCCTTCA-3′。反應體系為20 μL，其中10 μL SYBR green mixture，上下游引物分別1 μL，cDNA 2μL，加水至20 μL。94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，循環(huán)40次。在55 ℃ 30 s時讀取熒光值。

1.2.4 蛋白提取及Western-blot檢測IE2、UL44、UL99 及ATF5蛋白的表達 HCMV AD169 (MOI=5)分別感染U87、SY5Y及A172細胞，分別在0、24、48、72、96 h提取總蛋白，將細胞培養(yǎng)皿放于冰上用預冷的PBS洗2遍，加入200 μL含有1 μmol/L PMSF的細胞裂解液，冰浴10 min后，用細胞刮刀刮下細胞后轉移到EP管中，再放冰上20 min使其充分裂解，12 000 r/min 4 ℃離心6 min，上清液為總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。進行SDS-PAGE將蛋白分離，濕法將蛋白轉至PVDF膜上，用TBST清洗膜3次，每次10 min，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別按要求稀釋后加入β-actin，IE2、UL44、UL99及ATF5抗體4 ℃孵育過夜，用TBST清洗膜3次，每次10 min，再加入HRP標記的二抗，室溫孵育1.5 h，TBST清洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光。以β-actin作為內參，Quantity One軟件進行灰度分析，計算目的蛋白相對表達含量。

1.2.5 慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染神經膠質瘤細胞 進行預實驗對感染條件進行篩選，將細胞接種于96孔板,病毒感染時使細胞融合度達20%～30%保持細胞狀態(tài)良好。設4個組分別為Complete Medium、Complete Medium+5 μg/mL Polybrene、Enhanced Infection Solution(Eni.S.)及Eni.S.+5 μg/mL Polybrene，每組設5個復感染指數(shù)(MOI=1、5、10、15、50)，每個孔設3個復孔。培養(yǎng)8～12 h以后觀察細胞形態(tài)，并更換新鮮培養(yǎng)液，感染3～4 d后，觀察熒光表達情況，確認最佳感染條件和感染參數(shù)。在最佳感染狀態(tài)下，將陰性對照慢病毒CON053及LV-ATF5-RNAi分別感染U87和SY5Y細胞，待細胞穩(wěn)定轉染后，提取蛋白，WB檢測ATF5的表達。

2 結果與分析

2.1 HCMV感染膠質瘤細胞后收集上清檢測病毒滴度

HCMV感染U87、SY5Y、A172后觀察細胞形態(tài)變化, U87、SY5Y細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化，細胞觸角由細長變粗鈍，細胞由瘦變粗圓(見圖1)，收集不同時間點上清，將上清加入接種HELF的24孔板中，空斑定量檢測病毒滴度。加24、48 h收集的上清液的孔未出現(xiàn)變化，72 h的可檢測到空斑且隨時間延長空斑數(shù)量增多，120 h的空斑數(shù)量最多，病毒滴度最高(見圖2)；而A172細胞形態(tài)無明顯變化(見圖1)，也未檢測到空斑，對照HELF組在HCMV感染72 h時開始出現(xiàn)明顯的細胞病變效應(見圖1)，收集上清檢測病毒滴度，加72 h的可檢測到空斑，120 h的空斑數(shù)量最多，病毒滴度最高(見圖2)。

圖1 A172、U87、SY5Y和HELF感染HCMV后形態(tài)變化Fig.1 The morphology changes of the A172、U87、SY5Y and HELF which were infected with HCMVA、C、E、G：未感染HVMV細胞；B、D、F、H：感染HVMC 72 h后細胞A，C，E，G：mock infected；B，D，F(xiàn)，H：infected with HCMV 72 h

圖2 HCMV感染膠質瘤和HELF收集上清檢測病毒滴度Fig.2 HCMV infection HELF and glioma cells then the supernatant was collected to detect the virus titer

2.2 HCMV感染U87、SY5Y及A172后其IE2、UL44、UL99及ATF5基因mRNA表達

Real-time PCR檢測顯示，HCMV感染U87、SY5Y細胞在12 h IE2基因表達顯著增高，UL44在12 h開始表達48 h達高峰，UL99在12 h開始有表達72 h達高峰，ATF5在72 h表達出現(xiàn)高峰；而HCMV感染A172細胞僅UL44在72 h有少量表達，ATF5的表達較低。U87、SY5Y及A172中IE2、UL44、UL99及ATF5 mRNA相對表達含量見圖3。

圖3 Real-time PCR檢測A172、U87和SY5Y組IE、UL44、UL99、ATF5 mRNA的表達Fig.3 Expressions of IE、UL44、 UL99、ATF5 mRNA in A172、U87 and SY5Y cells infected with HCMV by Real-time PCRA：A172細胞；B：U87細胞；C：SY5Y細胞，圖4同A：A172 cell；B：U87 cell；C：SY5Y cell,same figure 4

2.3 HCMV感染U87、A172后其IE2、UL44、UL99及ATF5蛋白表達

Western-blot檢測顯示，HCMV感染U87、SY5Y細胞，IE2蛋白在24 h顯著表達，在96 h達高峰，UL44在24 h開始表達72 h明顯增高，96 h達高峰，UL99在48 h開始有表達96 h達高峰，ATF5表達在72 h明顯增高96 h出現(xiàn)高峰，IE2、UL44、UL99及ATF5四種蛋白相對表達含量均高于未感染組和A172組(P<0.05)；而HCMV感染A172細胞僅UL44在96 h有少量表達， ATF5的表達低于U87、SY5Y細胞(見圖4)。結果與Real-time PCR結果一致，A172、U87及SY5Y中IE2、UL44、UL99及ATF5 蛋白相對表達含量見表1。

HCMV感染U87、SY5Y兩組細胞后，Pearson相關分析結果顯示IE2與ATF5表達具有明顯正相關性，U87(r=0.955,P<0.05)，SY5Y(r=0.956,P<0.05)。而HCMV IE基因編碼產生的即刻早期蛋白可激活E基因,E基因編碼的蛋白參與病毒復制[1]，IE基因編碼兩種重要的調控蛋白IE1(IE72)和IE2(IE86)；有文獻報道CREB-A可以和IE蛋白相互作用，并可以激活HCMV UL112-113啟動子，從而啟動病毒基因表達[3-6]，而本研究的轉錄激活因子5(ATF5)隸屬轉錄因子ATF/CREB家族，能與細胞內多種蛋白分子相互作用，共同調節(jié)基因的轉錄，因此下調ATF5在U87、SY5Y細胞表達，檢測ATF5對HCMV復制水平的影響。

圖4 Western-blot檢測A172、U87和SY5Y組IE、UL44、UL99、ATF5蛋白的表達Fig.4 Expressions of IE，UL44， UL99 and ATF5 protein in A172，U87 and SY5Y cells infected with HCMV by Western-blot

組別IEUL44UL99ATF5A172組0h0000．23±0．0624h0000．19±0．0448h0000．11±0．03?72h0000．05±0．08?96h00．10±0．04?00．02±0．05?U87組0h0000．27±0．0224h0．46±0．05?▲0．27±0．09?▲00．33±0．05▲48h0．52±0．11?▲0．40±0．13?▲0．23±0．07?▲0．43±0．08?▲72h0．69±0．06?▲0．62±0．08?▲0．43±0．09?▲0．64±0．03?▲96h1．13±0．10?▲0．71±0．16?▲0．73±0．13?▲0．79±0．07?▲SY5Y0h0000．25±0．0724h0．37±0．07?▲0．11±0．04?▲00．29±0．03▲48h0．50±0．04?▲0．14±0．02?▲00．40±0．07?▲72h0．63±0．09?▲0．51±0．05?▲0．23±0．06?▲0．51±0．06?▲96h1．00±0．10?▲0．60±0．08?▲0．58±0．12?▲0．67±0．05?▲

注:A172、U87、SY5Y三組細胞與自身未感染病毒組細胞相比*P<0.05 ，在相同時間點U87、SY5Y分別與A172相比 ▲P<0.05

2.4 慢病毒感染U87、SY5Y細胞效率檢測

在Complete Medium+5 μg/mL Polybrene條件下U87(MOI=1)、SY5Y(MOI=15)慢病毒感染效率最高(感染效率=每個高倍鏡下熒光細胞數(shù)量/同一鏡下普通顯微鏡計數(shù))在感染72 h時轉染效率可達95 %，激光共聚焦顯微鏡下可見紅色熒光蛋白(圖5)。

圖5 熒光顯微鏡檢測慢病毒感染效率Fig.5 Detect the lentivirus infection efficiency by fluorescence microscopyA:慢病毒感染的U87細胞(微分干涉顯微鏡(DIC))；B:慢病毒感染的U87細胞(熒光顯微鏡)；C:merge；D:慢病毒感染的SY5Y的細胞(微分干涉顯微鏡(DIC))；E:慢病毒感染的SY5Y細胞(熒光顯微鏡)；F:mergeA:U87 cell infected with lentivirus(differential interference contrast microscope (DIC))；B:U87 cell infected with lentivirus(Fluorescence microscope)；C:merge；D:SY5Y cell infected with lentivirus(differential interference contrast microscope (DIC))；E: SY5Y cell infected with lentivirus(Fluorescence microscope)；F:merge

2.5 慢病毒對ATF5沉默效率的檢測

慢病毒穩(wěn)定轉染U87和SY5Y細胞后提取蛋白，Western-blot檢測，結果顯示LV-ATF5-RNAi組中ATF5表達明顯減低，而正常組和陰性對照CON053組ATF5的表達無明顯變化(圖6)，其中U87細胞正常組、陰性對照CON053組和LV-ATF5-RNAi組ATF5的相對表達量分別為0.31±0.02、0.29±0.02、0.07±0.03，SY5Y細胞正常組、陰性對照CON053組和LV-ATF5-RNAi組ATF5的相對表達量分別為0.29±0.01、0.28±0.04、0.06±0.03。

圖6 Western-blot 檢測慢病毒對ATF5的沉默效率Fig.6 Western-blot analyzes the efficiency of lentiviral silencing ATF51～3:U87細胞；4～6：SY5Y細胞；1、4正常細胞組；2、5：陰性對照CON053組；3、6：LV-ATF5-RNAi組1～3:U87 cell；4～6：SY5Y cell，1，4 the normal group；2，5：the CON053 group；3，6：LV-ATF5-RNAi group

2.6 沉默ATF5表達，病毒在膠質瘤細胞中mRNA表達水平的變化

Real-time PCR檢測顯示，沉默ATF5的U87、SY5Y細胞IE2在12 h開始表達72 h表達最多；UL44、UL99在24 h開始有表達72 h表達最多。IE2、UL44、UL99與相應時間點陰性對照CON053組相比其相對表達量均下降(見圖7)。

圖7 Real-time PCR檢測ATF5 的U87和SY5Y細胞中 IE、UL44、UL99 mRNA的表達Fig.7 Expressions of IE，UL44， UL99 mRNA in U87，SY5Y cells after silencing ATF5 expression by Real-time PCRA:U87細胞CON053組；B:U87細胞LV-ATF5-RNAi組；C:SY5Y細胞CON053組；D:SY5Y細胞LV-ATF5-RNAi組，圖8同 A:U87 cell CON053 group;B:U87 cell LV-ATF5-RNAi group;C:SY5Y cell CON053 group;D:SY5Y cell LV-ATF5-RNAi group，same figure 8

2.7 沉默ATF5表達，病毒在膠質瘤細胞中蛋白表達水平的變化

Western-blot檢測顯示， HCMV感染沉默ATF5的U87、SY5Y細胞后IE2蛋白在24 h開始有表達，在96 h達高峰；UL44蛋白U87細胞在24 h開始表達，SY5Y細胞在48 h有表達，兩細胞在96 h達高峰；UL99蛋白在72 h開始有表達(見圖8)。IE2、UL44、UL99與相應時間點陰性對照CON053組相比其表達量均下降(P<0.05)，結果與Real-time PCR結果一致(見表2、3)，結果表明下調ATF5的表達后，HCMV在U87、SY5Y細胞中復制水平下降。

圖8 Western-blot檢測沉默ATF5 的U87和SY5Y 細胞中IE、UL44、UL99蛋白的表達Fig.8 Expressions of IE，UL44 and UL99 protein in U87 and SY5Y cells after silencing ATF5 expression by Western-blot

組別IEUL44UL99U87(CON053)0h00024h0．43±0．070．22±0．06048h0．49±0．050．34±0．070．21±0．0972h0．60±0．040．59±0．080．40±0．0696h0．98±0．050．65±0．060．67±0．08U87(LV?ATF5?RNAi)0h00024h0．12±0．08?0?048h0．23±0．03?0．12±0．07?0?72h0．27±0．05?0．17±0．05?0．24±0．08?96h0．35±0．09?0．26±0．05?0．28±0．06?

注:相同時間點U87(LV-ATF5-RNAi)組與U87(CON053)組相比*P<0.05

表3 沉默ATF5的SY5Y細胞IE、UL44和UL99蛋白相對表達量比較

注:相同時間點SY5Y(LV-ATF5-RNAi)組與SY5Y(CON053)組相比*P<0.05

3 討 論

人巨細胞病毒感染和神經膠質瘤關系密切, 調節(jié)HCMV復制和再激活的因素并不十分清楚，但細胞因子可能起到重要作用，在病毒基因激活時細胞轉錄因子和病毒反式激活因子是必不可少的[10-13]。病毒編碼的主要即刻早期調控蛋白IE86可與宿主細胞中轉錄因子相互作用從而激活自身的表達,而在一些非允許細胞系中IE的表達受到抑制，有研究已證明IE基因編碼產生的即刻早期蛋白可激活E基因編碼的蛋白參與病毒復制[1]。

轉錄激活因子 5(ATF5)是神經膠質瘤的一個標志性轉錄因子，最近研究表明CREB-A可以和IE蛋白相互作用，并可以激活HCMV UL112-113啟動子，從而啟動病毒基因表達[3-6]。轉錄激活因子5(ATF5)隸屬轉錄因子ATF/CREB家族，具有亮氨酸拉鏈(bZIP)的特征結構域，能與細胞內多種蛋白分子相互作用，共同調節(jié)基因的轉錄[8-9]。許多研究表明ATF5與細胞增殖分化凋亡有關[14-15]。然而有關ATF5的表達對HCMV復制水平的影響少見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，HCMV感染不同膠質瘤細胞后病毒復制水平不一，Real-time PCR 及Western-blot顯示在不同膠質瘤細胞中ATF5的表達與IE2的表達具有明顯正相關性，提示ATF5的表達可能促進HCMV病毒的復制。為進一步證明ATF5在HCMV感染中可能的作用，以慢病毒為載體構建ATF5小干擾RNA下調ATF5在U87、SY5Y細胞的表達。沉默U87、SY5Y細胞內源性ATF5后，觀察HCMV感染膠質瘤細胞后IE表達水平的變化。結果顯示，下調ATF5的表達，病毒蛋白表達顯著下降(P<0.05)。結果表明，下調ATF5的表達可抑制HCMV病毒的復制。因此，預防HCMV感染或者下調細胞內源性ATF5表達，可作為治療膠質瘤新的治療靶點。本研究僅對ATF5表達和HCMV在神經膠質瘤復制水平表型作了初步研究，其具體分子機制還有待進一步研究。

[1] Luo MH,Fortunato EA.Long-Term Infection and Shedding of Human Cytomegalovirus in T98G Glioblastoma Cells[J].J Virol,2007,81(19): 10424-10436.

[2] Cobbs CS,Harkins L,Samanta M,et al.Human cytomegalovirus infection and expression in human malignant glioma[J].Cancer Res,2002,62(12):3347-3350.

[3] Kew VG,Yuan J,Meier J,et al.Mitogen and stress activated kinases act co-operatively with CREB during the induction of human cytomegalovirus immediate-early gene expression from latency[J]. PLoS Pathog,2014,10(6):e1004195.

[4] Philip Lashmit, Shuhui Wang, Hongmei Li, et al. The CREB Site in the Proximal Enhancer Is Critical for Cooperative Interaction with the Other Transcription Factor Binding Sites To Enhance Transcription of the Major Intermediate-Early Genes in Human Cytomegalovirus-Infected Cells[J].J Virol,2009,83(17):8893-904.

[5] Rodems SM,Clark CL,Spector DH.Separate DNA Elements Containing ATF/CREB and IE86 Binding Sites Differentially Regulate the Human Cytomegalovirus UL112-113 Promoter at Early and Late Times in the Infection[J].J Virol,1998,72(4):2687-2707.

[6] Lang D,Gebert S,Alt H,et al.Functional interaction between the human cytomegalovirus 86-kilodalton IE2 protein and the cellular transcription factor CREB[J].J Virol,1995,69(10):6030-6037.

[7] Wu L,Zhang X,Che Y,et al.A cellular response protein induced during HSV-1 infection inhibits viral replication by interacting with ATF5[J]. Sci China Life Sci,2013,56(12):1124-1133.

[8] Yuanyan Wei,Yuqing Ge,Fengbiao Zhou,et al.Identification and characterization of the promoter of human ATF5 gene[J]. J Biochem, 2010,148(2):171-178.

[9] 葉雄俊,張志文,張新軍,等.ATF5與TCF4相互作用及其對Wnt信號通路的調控[J].科學通報,2003,48(6):582-588.

[10]Xiaoqiu Liu,Jinxiang Yuan,Allen W Wu,et al.Phorbol Ester-Induced Human Cytomegalovirus Major Immediate-Early(MIE)Enhancer Activation through PKC-Delta,CREB,and NF-κB Desilences MIE Gene Expression in Quiescently Infected Human Pluripotent NTera2 Cells[J].J Virol, 2010,84(17):8495-508.

[11]Colberg-Poley AM,Santomenna LD,Harlow PP,et al.Human cytomegalovirus US3 and UL36-38 immediate-early proteins regulate gene expression[J].J Virol,1992,66(1):95-105.

[12]Kerry JA,Priddy MA,Jervey TY,et al.Multiple regulatory events influence human cytomegalovirus DNA polymerase (UL54) expression during viral infection[J].J Virol,1996,70(1):373-382.

[13]Liu B,Stinski MF.Human cytomegalovirus contains a tegument protein that enhances transcription from promoters with upstream ATF and AP-1 cis-acting elements[J].J Virol,1992,66(7):4434-4444.

[14]王桐梅,錢冬萌,胡明,等.HCMV感染對惡性膠質瘤U87細胞增殖及ATF5表達的影響[J].微生物學雜志,2014,34(1):17-21.

[15]Angelastro JM,Canoll PD,Kuo J,et al.Selective destruction of glioblastoma cells by interference with the activity or expression of ATF5[J].Oncogene,2006，25(6):907-916.

The Effects of ATF5 Expression Level in Glioma Cells on HCMV Replication

ZHANG Xue, QIAN Dong-meng, HU Ming, CHEN Hao, LI Ling, ZHANG Li, SONG Xu-xia, WANG Bin

(Teach. &Res.Div.ofPatho.Microb.,Col1.ofMed.QingdaoUni.,Qingdao266071)

The replication levels of human cytomegalovirus (HCMV) in gliomata are different, and the mechanism is still unknown. In this study the changes of replication levels of the virus after its infection of gliomata were detected through down-regulation of the expression of activation transcription factor 5 (ATF5) in gliomata. Firstly, cells U87, SY5Y, and A172 were infected with HCMV respectively, and observe the changes of their cellular morphology, and collect each of their supernatants at the time points of 24, 48, 72, 96, and 120 h to test their viral titers, and detect the expression situation of incontinent incipient gene IE2, incipient gene UL44, terminal gene UL99, and ATF5 with real-time PCR, and detect the expression situation of the HCMV coded protein and ATF5 with Western-blot. The results showed that as compared the replication level of HCMV in cells A172 with the ones in cells U87 and SY5Y, the group of U87 and SY5Y cells were significantly higher than that of the replication level in the group of A172 cells (P<0.05); and as compared the expression of ATF5 in the groups of U87 cell and SY5Y cell were significantly higher than the group of A172 (P<0.05); Using lentivirus mediation RNA interfering technique to down-regulate the expression of ATF5 in U87 and SY5Y, using HCMV infected cells to detect the expression of viral gene and protein, the results showed that the down-regulation of the expression of ATF5 could inhibit the replication of HCMV (P<0.05). The above results showed that down-regulate the expression level of ATF5 in glioma cell could inhibit the replication level of HCMV.

human cytomegalovirus (HCMV); activation transcription factor 5 (ATF5); replication; human glioma cell; viral gene

國家自然科學基金項目(81471958)；青島大學創(chuàng)新團隊青年教師培育項目；青島市博士后應用研究項目資助(2015160)

張雪 女，碩士研究生。主要研究方向為病毒基因工程與蛋白質組學研究。E-mail：zhangxueqy701@163.com

* 通訊作者。男，博士，教授，博士生導師。主要研究方向為分子病毒學。Tel：0532-83780032，E-mail：wangbin532@126.com

2015-05-03；

2015-05-16

Q939.93; R 373.9

A

1005-7021(2016)02-0025-08

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.005