正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃馬酊最佳滲漉工藝

陳 薇，冷 靜，楊 敏，高 倩，王 琴

（1.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400042）

正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃馬酊最佳滲漉工藝

陳 薇1，冷 靜1，楊 敏1，高 倩2，王 琴1

（1.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400042）

目的 優(yōu)選黃馬酊的最佳滲漉提取工藝。方法 選擇乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）及滲漉速度（C）3個(gè)因素為考察對(duì)象，以士的寧及鹽酸小檗堿的含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用 L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果 以70%乙醇10倍量進(jìn)行滲漉，滲漉速度為3 mL／（min·kg）為最佳工藝條件。結(jié)論 優(yōu)選得到的黃馬酊滲漉工藝合理可行，可用于制劑室大生產(chǎn)。

黃馬酊；小檗堿；士的寧；滲漉；正交試驗(yàn)

Chen Wei1,Leng Jing1,Yang Min1,Gao Qian2,Wang Qin1

(1.Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital,Chongqing,China 400021;

2.The Pharmacy College of Chongqing Medical University,Chongqing,China 400042)

黃馬酊是重慶市中醫(yī)院使用多年的臨床驗(yàn)方，具有疏通經(jīng)絡(luò)、活血止痛、解毒消腫、消瘀散結(jié)之功效，臨床主要外用于血管栓塞性脈管炎（中醫(yī)脫疽），有獨(dú)特療效。黃馬酊由酒黃連和制馬錢子2味中藥材組方，其中黃連主要指標(biāo)成分為鹽酸小檗堿[1]285，馬錢子主要指標(biāo)成分為士的寧[1]48，均為生物堿類，其醇溶性較水溶性好[2－3]，因此提取溶劑選用一定濃度的乙醇。常用的乙醇提取方法有浸漬法、滲漉法、回流法等，滲漉法有操作簡(jiǎn)便、效率高等優(yōu)點(diǎn)，適于醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。為了保證制劑的質(zhì)量和療效，本研究中以鹽酸小檗堿及士的寧的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)[4]，采用正交試驗(yàn)方法，對(duì)乙醇最佳滲漉工藝進(jìn)行了考察?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫 1260型高效液相色譜儀(安捷倫公司)；ODS－3 C18柱（北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心）；DAD紫外檢測(cè)器；自制滲漉裝置；分析電子天秤（瑞士Mettler Toledo儀器公司）；Milli－Q Biocel A－10超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

黃連對(duì)照藥材（批號(hào)為913－8902），馬錢子對(duì)照藥材（批號(hào)為 121164－200302），士的寧對(duì)照品（批號(hào)為110705－200306，供含量測(cè)定用，含量以97%計(jì)），鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為110713－200609，供含量測(cè)定用，含量以98.5%計(jì)），以上試藥均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ODS－3C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇－乙腈－0.1 mol／L磷酸二氫鈉及0.025 mol／L十二烷基硫酸鈉溶液（50∶25∶25）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL／min。理論板數(shù)以士的寧峰計(jì)應(yīng)不低于5 000。

2.1.2 溶液制備

稱取士的寧和鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含士的寧0.046 mg及鹽酸小檗堿0.097 mg的對(duì)照品混合溶液，即得對(duì)照品溶液。取處方比例的黃連粗粉、馬錢子粗粉，加相應(yīng)濃度的乙醇潤(rùn)濕，置滲濾桶中，浸漬48 h，調(diào)節(jié)流速，加乙醇至處方量，收集滲濾液，靜置，濾過，精密量取1 mL濾液，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺黃連陰性樣品、缺馬錢子陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：在擬訂色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定。各峰之間分離度均大于1.5。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取士的寧對(duì)照品14 mg，鹽酸小檗堿對(duì)照品24 mg，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取上述2種對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。精密吸取上述系列對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定士的寧及鹽酸小檗堿的峰面積。以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。士的寧為Y＝2 563.9 X－18.393，R2＝0.999 4(n＝6)，士的寧進(jìn)樣量在0.056～0.336 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；鹽酸小檗堿為 Y＝3 353.4 X－20.588，R2＝0.999 5 (n＝6)，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.096～0.576 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果士的寧峰面積的 RSD為0.6%(n＝5)，鹽酸小檗堿峰面積的 RSD為0.8%(n＝5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，6，8，10 h時(shí)在擬定色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果士的寧峰面積的 RSD為 1.2%(n＝7)，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.4%(n＝7)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品5份，精密量取，依法制備5份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果士的寧峰面積的RSD為 1.3%(n＝5)，鹽酸小檗堿峰面積的 RSD為1.6%(n＝5)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量（鹽酸小檗堿2.0 g／L，士的寧0.91 g／L）的樣品0.5 mL，置100 mL容量瓶中，再分別加入8，10，12 mL鹽酸小檗堿、士的寧對(duì)照品溶液（鹽酸小檗堿0.097 g／L，士的寧0.046 g／L），按擬訂方法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝9)

2.2 黃馬酊滲漉工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

按處方比例稱取黃連粗粉、馬錢子粗粉，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。以士的寧及鹽酸小檗堿的含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)黃馬酊滲漉工藝進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)考察結(jié)果，選擇乙醇濃度（因素A），乙醇用量（因素B）及滲漉速度（因素C）3個(gè)因素，各取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平表及試驗(yàn)結(jié)果見表2至表4。

2.2.2 結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇滲漉的影響因素為乙醇用量＞乙醇濃度＞滲漉速度，且以B2A2C3為最佳。方差分析結(jié)果表明，因素B有顯著影響，各因素影響大小順序?yàn)锽＞A＞C，A和C無顯著影響，考慮到滲漉速度為1 mL／min（以1 kg藥材計(jì)），生產(chǎn)周期過長(zhǎng)，故將因素C降低一個(gè)水平，即C2。故最佳工藝條件為A2B2C2，即以70%乙醇10倍量進(jìn)行滲漉，滲漉速度為3mL／（min·kg）。

表2 因素水平表

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化所得最佳滲漉工藝條件，同法重復(fù)3次提取，所得士的寧及鹽酸小檗堿的含量結(jié)果見表5。結(jié)果表明，優(yōu)化所得滲漉工藝條件合理可行、穩(wěn)定可靠，具有可操作性和重復(fù)性。根據(jù)酒黃連藥材中鹽酸小檗堿含量為6.4%，制馬錢子藥材中士的寧含量為1.34%，可計(jì)算出黃連的提取轉(zhuǎn)移率為80.82%，制馬錢子的提取轉(zhuǎn)移率為82.34%。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析表

表5 最佳滲漉工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

黃馬酊作為醫(yī)院的傳統(tǒng)中藥制劑，在四肢血管科、內(nèi)分泌科、皮膚科有著廣泛的應(yīng)用，對(duì)糖尿病足潰瘍[5]、血管栓塞性脈管炎、肢端缺血壞死[6]、下肢慢性潰瘍[7]等具有良好的臨床效果，備受廣大患者青睞。

黃馬酊傳統(tǒng)制法為白酒浸泡，本研究采用乙醇為溶劑，采用正交試驗(yàn)對(duì)酒黃連、制馬錢子制成的黃馬酊的提取方式進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)果表明，以70%乙醇10倍量進(jìn)行滲漉，滲漉速度為3 mL／(min·kg)，所得酊劑中士的寧及鹽酸小檗堿的含量較傳統(tǒng)的冷浸法高，略低于回流法所得含量。對(duì)于院內(nèi)制劑，回流法不適于大生產(chǎn)，故選用滲漉法。

黃馬酊的傳統(tǒng)提取方法為白酒浸泡30 d，本研究對(duì)提取方法優(yōu)選后3～4 d即可完成批量生產(chǎn)，明顯縮短了制劑所需時(shí)間，對(duì)于規(guī)范黃馬酊的制作工藝、指導(dǎo)醫(yī)院制劑生產(chǎn)具有一定意義。

黃馬酊屬于復(fù)方制劑，已知有效成分為鹽酸小檗堿、士的寧，是否還有其他成分存在，可否進(jìn)一步濃縮提純，或開發(fā)其他更適用的劑型，值得進(jìn)一步研究。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]段曉穎.正交試驗(yàn)法優(yōu)選馬錢子醇提工藝研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2007，24(5):375－377.

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Optimum Percolation Extraction Process of Huang－Ma Tincture by Orthogonal Test Method

Objective To optimize the percolation extraction process of Huang－Ma Tincture.Methods The Ethanol concentration(A), Ethanol dosage(B)and percolation rate(C)were selected as the factors,and the contents of Strychnine and Berberine Hydrochloride were taken as the observed index;L9(34)orthogonal test was designed to optimize the process.Results The optimal technology was 70% ethanol 10 times as much as that of the drugs and percolation rate was 3 mL／(min·kg).Conclusion The preparation process is reasonable and highly efficient,which can be used for he mass production of Huang－Ma Tincture.

Huang－Ma Tincture;strychnine;berberine hydrochloride;percolation;orthogonal Test

R284.2；R282.71；TQ461

A

1006－4931(2016)21－0037－03

陳薇（1981－），女，碩士研究生，主管中藥師，主要從事方劑學(xué)研究，（電子信箱）1016487073＠qq.com；楊敏（1969－），男，大學(xué)本科，主任中藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)管理研究，本文通訊作者，（電子信箱）453475345＠qq.com。

2016－05－18)