表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)X線照射大鼠肺損傷病理形態(tài)、M M P－1及T IM P－1蛋白表達(dá)的影響

王祥財(cái)，梁雷鋒，施華球，許明君，王釔力，衷敬華

（1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000； 2.廣西壯族自治區(qū)玉林市第一人民醫(yī)院，廣西 玉林 537000）

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)X線照射大鼠肺損傷病理形態(tài)、M M P－1及T IM P－1蛋白表達(dá)的影響

王祥財(cái)1，梁雷鋒2，施華球1，許明君1，王釔力1，衷敬華1

（1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000； 2.廣西壯族自治區(qū)玉林市第一人民醫(yī)院，廣西 玉林 537000）

目的 觀察表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)放射性肺損傷大鼠肺組織病理形態(tài)及MMP－1和TIMP－1蛋白表達(dá)的影響，評(píng)價(jià)EGCG對(duì)放射性肺損傷的防治作用。方法 將雄性Wistar大鼠108只隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組，放射模型組，大、中、小劑量?jī)翰杷亟M和潑尼松組。除正常對(duì)照組外，其余組均給予X線照射，單次30 Gy。每組分別于照后第14天、30天、60天隨機(jī)處死大鼠，取左肺組織常規(guī)方法制成石蠟切片，蘇木素－伊紅(HE)染色觀察病理形態(tài)變化，采集右肺中葉組織，免疫組化法觀察肺組織MMP－1和TIMP－1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 HE染色顯示，大、中劑量?jī)翰杷亟M肺泡充血、滲出、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均輕于放射模型組。免疫組化結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，14～60 d放射模型組肺組織MMP－1和TIMP－1蛋白表達(dá)相應(yīng)增高，MMP－1／TIMP－1比例增大。與放射模型組比較，中、大劑量?jī)翰杷亟MMMP－1和TIMP－1蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05），MMP－2／TIMP－2始終處于相對(duì)平衡狀態(tài)，小劑量?jī)翰杷亟MMMP－1和 TIMP－1蛋白表達(dá)增多，與放射模型組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 放射性肺損傷的病理變化與MMP－1和TIMP－1表達(dá)的平衡失調(diào)有關(guān)，EGCG對(duì)放射性肺損傷大鼠有保護(hù)作用，其機(jī)制可能為通過(guò)抑制MMP－1和TIMP－1蛋白表達(dá)，從而維持MMP－1／TIMP－1比例的平衡。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；放射性肺損傷；蘇木素－伊紅染色；MMP－1蛋白；TIMP－1蛋白

放射性肺損傷是胸部腫瘤行放射治療時(shí)容易出現(xiàn)的常見(jiàn)不良反應(yīng)，因其發(fā)生率高，可造成嚴(yán)重不良事件，且臨床尚無(wú)特效治療手段，故關(guān)于放射性肺損傷保護(hù)劑的研究成為目前放射治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。放射性肺損傷包括初期的炎癥改變及后期纖維化變化。纖維化的病理特點(diǎn)主要是膠原蛋白的增生，目前認(rèn)為，MMP－1／TIMP－1是調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白增生的主要酶系之一。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）是綠茶提取的主要成分，研究證實(shí)其在抗炎、防輻射等方面具有一定作用，但將EGCG應(yīng)用在放射性肺損傷方面的研究卻鮮見(jiàn)，具體機(jī)制也尚不明確。本研究中應(yīng)用EGCG對(duì)放射性肺損傷大鼠肺組織進(jìn)行保護(hù)，觀察肺病理形態(tài)及MMP－1和TIMP－1蛋白的表達(dá)，以評(píng)價(jià)EGCG對(duì)放射性肺損傷的防治作用，為進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與動(dòng)物

兒茶素（EGCG，批號(hào)為Z20130056)購(gòu)自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)。雄性Wistar大鼠108只，平均體質(zhì)量（200±20）g，動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK2013－026，隨機(jī)分籠，每籠6只，由動(dòng)物室統(tǒng)一喂養(yǎng)。

1.2 動(dòng)物分組

將108只Wistar大鼠隨機(jī)均分為6組，即正常對(duì)照組、模型組、兒茶素大劑量[200 mg／（kg·d）]組、中劑量[100 mg／（kg·d）]組及小劑量[50 mg／（kg·d）]組和潑尼松[6.72 mg／（kg·d）]組。正常對(duì)照組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液腹腔注射；放射性肺損傷模型組大鼠給予X射線照射進(jìn)行造模；兒茶素大劑量組大鼠給予X射線照射進(jìn)行造模，1周后予以兒茶素（200 mg／kg）進(jìn)行灌胃，1次／天；兒茶素中劑量組大鼠給予X射線照射進(jìn)行造模，1周后予以兒茶素（100 mg／kg）進(jìn)行灌胃，1次／天；兒茶素小劑量組大鼠給予X射線照射進(jìn)行造模，1周后予以兒茶素（50 mg／kg）進(jìn)行灌胃，1次／天；潑尼松組大鼠給予X射線照射進(jìn)行造模，1周后予以潑尼松（6.72 mg／kg）灌胃，1次／天。

1.3 動(dòng)物模型制作

除正常對(duì)照組外，其余各組均用X射線照射進(jìn)行放射性肺損傷模型建立。用23EX型直線加速器（美國(guó)瓦里安公司）產(chǎn)生的6 MV X射線，等距離照射大鼠全肺，照射野上界平大鼠腋窩，下界平胸骨劍突，照射面積約4.5 cm×4 cm，大鼠全身其余部分用10 cm后擋鉛屏蔽。源皮距為100 cm，劑量率為240 cGy／min，照射劑量為30 Gy[2]。照后1周，各治療組開(kāi)始灌胃給藥，正常對(duì)照組及模型組灌胃給予等體積的蒸餾水。

1.4 標(biāo)本獲取和處理

大鼠處死時(shí)采用乙醚麻醉，迅速切取肺臟標(biāo)本置冰鹽水中充分洗滌。

1.5 觀察項(xiàng)目

病理觀察（HE染色）：在 X線照射后不同時(shí)間點(diǎn)（分別在第14天、30天、60天），在各組隨機(jī)抽取6只大鼠，用2%戊巴比妥鈉30 mg／kg腹腔內(nèi)注射，麻醉后開(kāi)胸暴露肺，取肺組織置10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定，用常規(guī)方法制成石蠟切片，經(jīng)蘇木素－伊紅（HE）染色。

圖像分析：應(yīng)用圖像分析儀測(cè)組織切片中肺泡壁厚度、肺間質(zhì)、彈力纖維、肺內(nèi)成纖維細(xì)胞膠原含量。

免疫組化：分別在第14天、30天、60天，在各組隨機(jī)抽取 6只大鼠，取大鼠右肺中葉，10%福爾馬林溶液固定24 h，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，免疫組化采用S－P檢測(cè)肺組織MMP－1及TIMP－1蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，采用析因分析，多重比較采用LSD分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)觀察（HE染色）

各組大鼠肺組織石蠟切片，分別行HE染色觀察動(dòng)物肺組織一般病理學(xué)改變。正常對(duì)照組：肺內(nèi)結(jié)構(gòu)正常。放射模型組：第14，30，60天，肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞由少逐漸增多，再逐漸減少，纖維細(xì)胞逐漸增多，膠原纖維沉積而表現(xiàn)肺纖維化，大、中劑量?jī)翰杷亟M肺泡充血、滲出、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等方面程度較輕，炎性細(xì)胞、纖維細(xì)胞數(shù)目明顯少于放射模型組。潑尼松組炎性細(xì)胞、纖維細(xì)胞數(shù)目少于放射模型組，中、大劑量?jī)翰杷亟M與潑尼松組比較，炎性程度明顯較輕。見(jiàn)圖1。

圖1 照射60 d各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果（×400）

表1 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠肺組織MMP－1表達(dá)量比較（s，n＝18）

表1 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠肺組織MMP－1表達(dá)量比較（s，n＝18）

注：與放射模型組比較， P＜0.05， P＜0.01。表2同。

組別正常對(duì)照組放射模型組潑尼松組中、高劑量?jī)翰杷亟M小劑量?jī)翰杷亟M平均表達(dá)量6.32±2.25 96.08±4.15 49.44±5.30 35.59±4.84 64.55±6.13 14 d 4.35±4.01 57.12±4.54 40.64±5.17 25.54±5.35 46.59±5.15 30 d 3.45±4.02 76.73±6.22 45.62±5.12 28.67±0.11 57.64±5.18 60 d 4.27±4.28 83.58±3.19 58.58±4.18 34.47±5.10 66.79±5.11

表2 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠肺組織TIMP－1表達(dá)量比較（s，n＝18）

表2 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠肺組織TIMP－1表達(dá)量比較（s，n＝18）

組別正常對(duì)照組放射模型組潑尼松組中、高劑量?jī)翰杷亟M小劑量?jī)翰杷亟M14 d 5.35±4.01 42.14±2.24 24.44±4.47 21.43±3.45 34.59±5.15 30 d 5.43±4.42 42.22±4.22 25.52±5.55 22.47±4.11 38.64±5.18 60 d 5.27±4.48 53.35±5.133 29.54±4.58 24.42±4.10 42.79±4.11平均表達(dá)量5.32±5.23 56.58±5.12 27.88±4.30 24.54±2.44 42.45±5.43

2.2 大鼠肺組織MMP－1蛋白表達(dá)

第14天、30天、60天，放射模型組與正常對(duì)照組比較，大鼠肺組織中MMP－1均大量表達(dá)（P＜0.01）。中、大劑量?jī)翰杷亟M大鼠肺組織中MMP－1表達(dá)均低于放射模型組（P＜0.01）；小劑量?jī)翰杷亟M與放射模型組MMP－1表達(dá)差異不明顯（P＞0.05）；潑尼松組也均低于放射模型組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.3 大鼠肺組織TIMP－1蛋白表達(dá)

第14天、30天、60天，放射模型組與正常對(duì)照組比較，大鼠肺組織中TIMP－1均大量表達(dá)（P＜0.01）；中、大劑量?jī)翰杷亟M大鼠肺組織中TIMP－1表達(dá)均低于放射模型組（P＜0.01）；小劑量?jī)翰杷亟M與放射模型組比較，TIMP－1表達(dá)差異不明顯（P＞0.05），潑尼松組也低于放射模型組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

3 討論

放射性肺損傷是胸部惡性腫瘤經(jīng)放射治療后引起的炎性反應(yīng)，臨床無(wú)特效藥，常予激素對(duì)癥處理，但不良反應(yīng)大，故探索無(wú)毒、高效的放射性保護(hù)劑成為了臨床研究的熱點(diǎn)。

放射性肺損傷包括初期的炎癥改變及后期纖維化變化。纖維化病理特點(diǎn)主要是膠原蛋白的增生，目前認(rèn)為，MMP－1／TIMP－1是調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白增生的主要酶系之一。當(dāng)發(fā)生放射性肺損傷時(shí)，肺膠原蛋白不斷增加，從而刺激MMP－1的產(chǎn)生，以期降解膠原蛋白，但隨著MMP－1產(chǎn)生的增加，也會(huì)引起TIMP－1的升高，以達(dá)到MMP－1／TIMP－1平衡。隨著放射性損傷程度的加大，MMP－1不斷產(chǎn)生，抑制MMP－1的TIMP－1不能隨之繼續(xù)產(chǎn)生，從而導(dǎo)致 MMP－1／TIMP－1失衡，最終導(dǎo)致纖維化。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，MMP－1是放射性肺損傷中炎癥和纖維化過(guò)程中的高風(fēng)險(xiǎn)因素[3]。Costa等[4]研究認(rèn)為，MMP－1參與了放射性肺損傷中膠原蛋白的降解，在放射性肺纖維化中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究中發(fā)現(xiàn)，大、中劑量?jī)翰杷亟M肺泡充血、滲出、出血程度均顯著輕于放射模型組，炎性細(xì)胞和纖維細(xì)胞數(shù)目均明顯少于放射模型組；與正常對(duì)照組比較，14 d至60 d放射模型組肺組織MMP－1和TIMPs蛋白表達(dá)相應(yīng)增高，MMP－1／TIMP－1比例增大，MMP－1大量增多，反而抑制了正常膠原降解的正反饋，從而使膠原基質(zhì)沉積增多，最終導(dǎo)致肺纖維化[5－7]。與放射模型組比較，中、大劑量?jī)翰杷亟MMMP－1和TIMP－1蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01或 P＜0.05），MMP－1／TIMP－1始終處于相對(duì)平衡狀態(tài)，從而利于膠原降解正反饋[8]。小劑量?jī)翰杷亟MMMP－1和TIMP－1蛋白表達(dá)增多，與放射模型組比較差異不明顯。說(shuō)明中、大劑量?jī)翰杷亟M對(duì)放射性肺損傷大鼠有一定的保護(hù)功能，其機(jī)制可能與其能調(diào)節(jié)大鼠肺組織MMP－1／TIMP－1比例始終維持平衡有關(guān)[9－12]。說(shuō)明放射性肺損傷的纖維化過(guò)程是受復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制決定，本研究結(jié)果提示，MMP－1／TIMP－1比例平衡是調(diào)節(jié)肺纖維化的重要因素之一。

我國(guó)是天然藥物大國(guó)，茶葉在我國(guó)分布廣泛，茶兒茶素作為茶葉的提取物，制作工藝成熟，價(jià)格低廉。故深入研究茶兒茶素等中藥關(guān)于放射性肺損傷防護(hù)作用的基礎(chǔ)理論，對(duì)于促進(jìn)中醫(yī)現(xiàn)代化具有重要意義，也為開(kāi)發(fā)防護(hù)放射性損傷的中藥制劑提供了新的思路[13－15]。

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Effects of EGCG on the Pathological Morphology and Expression of MMP－1，TIMP－1 Protein in Radiation－Induced Lung Injury of Rats

Wang Xiangcai1，Liang Leifeng2，Shi Huaqiu1，Xu Mingjun1，Wang Yili1，Zhong Jinghua1
（1.The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，GanZhou，Jiangxi，China 341000； 2.Yulin First People′s Hospital，Yulin，Guangxi，China 537000）

Objective Toobservetheeffect of epigallocatechin gallate（EGCG） on thepathologicalmorphology and expression of MMP－1，TIMP－1 protein in radiation－induced lung injury of rats，and to evaluate the effect of EGCG on prevention of radiation－induced lung injury.Methods 108 male Wistar rats were randomly divided into 6 groups：normal group，radiation model group，large，medium and small dose of EGCG group，prednisone group.Except for the normal group，the remaining groups were given X ray of 30 Gy dose.Rats were sacrificed randomly on 14，30 and 60 d after radiation；routine method of left lung tissue was made into paraffin sections；HE staining was used to observe the pathological morphological changes.The left lung tissue was made into paraffin sections by routine method；theexpression of MMP－1 and TIMP－1 protein in lung tissuewasobserved by immunohistochemicalmethod.Results HE staining showed that the degree of alveolus congestion，exudation，hemorrhage and infiltration of inflammatory cells in the large and medium dose EGCG group were lighter than that in the radiation model group.Compared with the normal control group，the expression of MMP－1 and TIMP－1 protein in lung tissue in the radiation model group was elevated and the ratio of MMP－1／TIMP－1 was increased on 14－60 d.Compared with the radiation model group，the MMP－1 and TIMP－1 protein expressions in the large and medium dose EGCG group were significantly decreased（P＜0.05），and the MMP－2／TIMP－2 remained in relative equilibrium state；in small dose EGCG group，the expression of MMP－1 and TIMP－1 protein increased，and there was no significant difference compared with the radiation model group（P＞0.05）.Conclusion The pathologic changes of radiation－induced lung injury are related to the imbalance of MMP－1 and TIMP－1 expression.EGCG has a protective effect on radiation－induced lung injury in rats，and its mechanism may be through inhibiting the expression of TIMP－1，MMP－1，in order to maintain the balance of MMP－1／TIMP－1 ratio.

epigallocatechin gallate；radioactive lung injury；HE staining；MMP－1 protein；TIMP－1 protein

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2016)22－0026－04

王祥財(cái)（1968－），男，主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事臨床淋巴瘤、肺癌、肝癌、胃腸道惡性腫瘤的化學(xué)治療及介入治療，（電話）0797－8265619；衷敬華，博士研究生，主治醫(yī)師，本文通訊作者，（電子信箱）zaijunhao2009＠126.com。

2016－08－18)

江西省衛(wèi)生廳中藥局基金項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2013A078；江西省教育廳青年科學(xué)基金項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：GJJ12561。