基于NaYF4：Yb,Er上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒精準(zhǔn)檢測DNA

毛蘭蘭　張立明　鄧燕　呂卓璇＊,　何農(nóng)躍＊,,2

基于NaYF4：Yb,Er上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒精準(zhǔn)檢測DNA

毛蘭蘭1張立明1鄧燕1呂卓璇＊,1何農(nóng)躍＊,1,2

(1湖南工業(yè)大學(xué)綠色化學(xué)與生物納米技術(shù)應(yīng)用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省高等學(xué)校2011協(xié)同創(chuàng)新中心“經(jīng)濟(jì)林培育與利用”生物芯片分中心，株洲412007)
(2東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210096)

建立了一種利用堿基堆積原理并以上轉(zhuǎn)換納米粒子熒光作為內(nèi)參的精準(zhǔn)檢測DNA的方法。該方法首先利用熱分解法制備NaYF4:Yb,Er上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒(upconversion nanoparticles，UCNPs)，再通過表面羧基化變性牛血清蛋白修飾后與氨基化探針核酸單鏈共價偶聯(lián)，形成上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記顯示探針。最后再基于堿基堆積原理進(jìn)行雜交檢測。研究結(jié)果表明以NaYF4:Yb,Er熒光強(qiáng)度為內(nèi)參，根據(jù)FAM/UCNP的強(qiáng)度比來定量檢測目標(biāo)DNA濃度比單一的以報(bào)告DNA中FAM熒光強(qiáng)度定量檢測目標(biāo)DNA濃度要更為精準(zhǔn)，有效地避免了實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的人為操作和儀器誤差。本方法不需要進(jìn)行擴(kuò)增，檢測底限可達(dá)到5 nmol·L-1，且在較大的濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，同時該方法也有著良好的特異性，能有效區(qū)分單堿基錯配序列。

NaYF4:Yb,Er；DNA檢測；內(nèi)參；精準(zhǔn)性

0　引言

上轉(zhuǎn)換稀土納米材料是近年來新興的稀土熒光材料，是由鑭系稀土元素?fù)诫s的氧化物、硫化物和氟化物等構(gòu)成[1-4]。它能夠通過多光子機(jī)制把長波輻射(近紅外光)轉(zhuǎn)換成短波輻射，發(fā)射出比激發(fā)光波長更短的熒光(可見光)。與傳統(tǒng)的下轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記物如有機(jī)染料、熒光蛋白、量子點(diǎn)等相比，上轉(zhuǎn)換稀土熒光納米材料具有化學(xué)穩(wěn)定性好、發(fā)光強(qiáng)度高而穩(wěn)定、毒性低、生物相容性好和反Stokes位移大等優(yōu)點(diǎn)[5-10]。另外，因近紅外光為上轉(zhuǎn)換稀土納米材料的激發(fā)光源，將其用于生物體內(nèi)，可以有效地避免生物體內(nèi)自發(fā)熒光的干擾，同時對生物組織有良好的穿透能力，能有效地提高檢測的靈敏度和信噪比[11]?；谙⊥辽限D(zhuǎn)換熒光納米材料這些無可替代的優(yōu)點(diǎn)，其在生物標(biāo)記和生物檢測等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛能。此外，NaYF4:20%Yb,2%Er UCNPs是目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的稀土納米材料之一[12-13]，它能在980 nm激光器的激發(fā)下，發(fā)出肉眼可見且穩(wěn)定的綠色熒光，將其用于生物標(biāo)記和檢測中，具有著很大的優(yōu)勢。因此，尋找高效、快捷、形貌可控的上轉(zhuǎn)換稀土納米材料合成與表面修飾技術(shù)，具有十分重要的理論與現(xiàn)實(shí)價值。堿基堆積原理是指當(dāng)兩條或多條連續(xù)的寡核苷酸鏈與一條長的互補(bǔ)的單鏈DNA或RNA雜交后，這些短的寡核苷酸鏈可以獲得額外的穩(wěn)定性。在本實(shí)驗(yàn)中，只有當(dāng)目標(biāo)DNA存在時，才可幫助捕獲探針與報(bào)告探針穩(wěn)定結(jié)合，通過雜交反應(yīng)從而獲得檢測信號(如圖1所示)。本研究通過利用羧基化變性牛血清蛋白修飾的NaYF4: Yb,Er UCNPs作為標(biāo)記物與DNA探針結(jié)合，再根據(jù)堿基堆積力原理，將長鏈目標(biāo)DNA和FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記的短鏈報(bào)告DNA與UCNPs修飾的捕獲探針DNA進(jìn)行雜交。離心洗滌后，通過NaYF4:Yb,Er UCNPs的熒光強(qiáng)度作為內(nèi)參，確定DNA標(biāo)準(zhǔn)品與FAM/UCNP的信號強(qiáng)度比值的線性關(guān)系，從而進(jìn)行目標(biāo)DNA的檢測。多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，以UCNPs熒光強(qiáng)度作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)的方法能夠有效地避免實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的人為操作和儀器誤差，比單一的以報(bào)告探針的熒光信號作為判斷標(biāo)準(zhǔn)要更精準(zhǔn)。該方法無需擴(kuò)增，檢測靈敏度可至5 nmol·L-1，同時也具有較好的特異性，能檢測僅單個堿基差異的DNA序列，與其他上轉(zhuǎn)換比率法檢測法[14-17]相比，有一定的優(yōu)勢，具有較好的應(yīng)用前景。

圖1　上轉(zhuǎn)換熒光探針檢測DNA的工作原理示意圖Fig.1 Schematic of upconversion fluorescent probes to detect DNA

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

六水氯化釔(YCl3·6H2O)、氯化鐿(YbCl3)、氯化鉺(ErCl3)、油酸(OA)、十八烯(ODE)、牛血清蛋白(BSA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，均購自Sigma公司；氯仿、環(huán)己烷、甲醇、乙醇、琥珀酸、三乙胺、二甲基亞砜，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NH2-PEG 5000購自上海西寶生物科技有限公司；DNA序列(如下)、雜交液Ⅲ、SDS、SSC溶液均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

Seq 1：5′-NH2-AAAAAAAAAA-AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC A-TGC GAC CTA T-3′(探針DNA)

Seq 2：5′-NH2-AAAAAAAAAA-AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC A-TGC GAC CTA T-FAM-3′(FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針DNA)

Seq 3:5′-FAM-AT AGG TCG CA-3′(報(bào)告DNA)

Seq 4:5′-TGA GGT AGT AGG TTG TAT AGTT-3′(目標(biāo)DNA)

Seq 5:5′-AGA GGT AGT AGG TTG TAT AGT T-3′(目標(biāo)DNA-錯配1個)

Seq 6:5′-AAA GGT AGT AGG TTG TAT AGT T-3′(目標(biāo)DNA-錯配2個)

Seq 7:5′-TAGCTT ATC AGACTG ATGTTG A-3′(目標(biāo)DNA-錯配多個)

Seq 8:5′-AAC TAA TCA TCC AAC ATC CTCA-3′(目標(biāo)DNA-全錯配)

S-2000N型掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；F-4600熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)，其中測量上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜的激發(fā)光源為連續(xù)波長的980 nm半導(dǎo)體激光器；JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本電子公司)；Nicolet Nexus 470傅里葉紅外光譜儀(Thermo Electron公司)。

1.2NaYF4:Yb,Er UCNPs的制備

NaYF4:20%Yb,2%Er UCNPs參照較成熟的熱分解法合成[18-19]。具體步驟如下：取0.473 g YCl3·6H2O，0.112 g YbCl3，0.011 g ErCl3于100 mL三頸燒瓶中，加入2 mL去離子水超聲分散，再加入12 mL油酸與30 mL十八烯，將整體裝置放入加熱套中，在氬氣的保護(hù)下加熱攪拌。隨后將混合溶液在15 min內(nèi)升至110℃，除水30 min；再10 min升至140℃，除HCl氣體30 min。待溶液溫度降至室溫，將0.2 g氫氧化鈉與0.296 g氟化銨溶于10 mL甲醇中，再加入至混合溶液。再進(jìn)一步將溶液10 min升至100℃，除甲醇25 min；再15min升至310℃，回流反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物用環(huán)己烷和乙醇(體積比為1:2)沉淀，再用純乙醇與50%乙醇各離心洗滌2次，最后分散于40 mL氯仿中。

1.3NaYF4：Yb,Er UCNPs的表面羧基修飾

1.3.1羧基化變性牛血清蛋白(dBSA)的制備[20-21]：

取1 g牛血清蛋白溶于20 mL去離子水中；再取2 g丁二酸，溶于10 mL去離子水中，并加入5 mL三乙胺將其pH值調(diào)至7～8；隨后將偏堿性的丁二酸溶液緩慢加入牛血清蛋白溶液中，再加入1 g EDC，磁力攪拌下反應(yīng)1 h，反應(yīng)完成后，將所得到的混合溶液在85℃下恒溫變性1 h。變性后的溶液用蒸餾水透析純化72 h，最后真空冷凍干燥成松軟絮狀的羧基化變性牛血清蛋白，并于-4℃冰箱保存。

1.3.2NaYF4:Yb,Er UCNPs的表面羧基化蛋白修飾[20]

稱量50 mg dBSA，溶于1 mL DMSO溶液中，再加入10 mg NH2-PEG 5000與2 mg EDC，磁力攪拌下反應(yīng)4 h。反應(yīng)完成后，將其滴加入10 mL氯仿分散的NaYF4:Yb,Er UCNPs中，劇烈攪拌反應(yīng)過夜。最后的羧基化產(chǎn)物用DMSO離心洗滌5次，并分散于10 mL DMSO中待用。

1.4NaYF4：Yb,Er上轉(zhuǎn)換熒光納米探針的制備

羧基化NaYF4:Yb,Er UCNPs與氨基化DNA探針的結(jié)合根據(jù)酰胺反應(yīng)進(jìn)行。具體步驟如下：首先將DNA粉末用pH=7.2，濃度為0.01 mol·L-1的PBS溶解成50μmol·L-1的DNA溶液，隨后取14.7μL DNA溶液，加入2 mL PBS，在磁力攪拌下，緩慢將其滴加入2 mL DMSO分散的dBSA/NaYF4:Yb,Er UCNPs中，再加入5 mg EDC，反應(yīng)過夜。反應(yīng)后的產(chǎn)物用2×SSC/0.1%SDS和0.2×SSC的洗滌液分別離心洗滌2次，最后用1 mL雜交液Ⅲ分散待用。

1.5DNA雜交

取100μL雜交液Ⅲ分散的NaYF4:Yb,Er修飾的探針溶液于200μL PCR管中，再分別加入1μL不同濃度的目標(biāo)DNA溶液(0～500 nmol·L-1)與1μL 500 nmol·L-1的報(bào)告DNA溶液于其中混合，保持總反應(yīng)體系為100μL。隨后，總?cè)芤悍湃隤CR儀中雜交1 h，反應(yīng)結(jié)束后，分別用2×SSC/0.1%SDS和0.2×SSC的洗滌液離心洗滌2次，最后用100μL PBS分散待測熒光。

2　結(jié)果與討論

通過掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察了熱分解法合成的OA/NaYF4:Yb,Er UCNPs的表面形貌。如圖2所示：從SEM中可以觀察出所制備的OA/NaYF4:Yb,Er UCNPs具有均一的形貌和尺寸，且單分散性好；從TEM中得出所制得的納米顆粒呈現(xiàn)規(guī)則的球狀，平均粒徑較小，約25 nm，這足以滿足生物標(biāo)記與生物檢測應(yīng)用的尺寸要求。

圖3為dBSA/NaYF4:Yb,Er UCNPs的TEM與紅外光譜表征圖。從TEM表征圖中(圖3A)，dBSA修飾后的納米粒子分散良好。值得一提的是，由于牛血清蛋白經(jīng)過羧基化的改性，不僅給NaYF4:Yb,Er UCNPs表面帶來了大量的羧基官能團(tuán)而有利于后續(xù)酰胺反應(yīng)的進(jìn)行，同時使UCNPs具有更好的生物相容性，便于其后的生物應(yīng)用。此外，通過NaYF4: Yb,Er UCNPs修飾前后紅外光譜圖的進(jìn)一步分析，我們更能明顯地觀察到顆粒表面成功地修飾了羧基化的牛血清蛋白。其中3 422 cm-1處寬吸收峰為羧基官能團(tuán)中O-H的伸縮振動峰，很顯然，修飾后的O-H峰比修飾前的增大了許多；1 654 cm-1的強(qiáng)吸收帶為羧基化蛋白與NH2-PEG反應(yīng)后形成的酰胺C=O基團(tuán)伸縮振動峰；1 097 cm-1為PEG中-O-醚鍵的伸縮振動吸收峰；669 cm-1對應(yīng)著牛血清蛋白和NH2-PEG中N-H的面外搖擺振動吸收峰。這些都足以證明NaYF4:Yb,Er UCNPs表面含有大量的羧基官能團(tuán)。

圖2　OA/NaYF4:Yb,Er UCNPs的SEM圖(A)與TEM圖(B)Fig.2 SEM(A)and TEM(B)images of the OA/NaYF4:Yb,Er UCNPs

圖3　dBSA/NaYF4:Yb,Er UCNPs的TEM圖(A)與紅外光譜圖(B)Fig.3 TEM(A)images and FTIR spectra(B)of dBSA/NaYF4:Yb,Er UCNPs

圖4 480 nm激發(fā)下探針修飾的NaYF4:Yb,Er UCNPs的FAM熒光光譜圖(A)與980 nm激發(fā)下NaYF4:Yb,Er UCNPs修飾前后的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖(B)Fig.4 Fluorescence spectra of the probe modified NaYF4:Yb,Er UCNPs under an excitation wavelength of 480 nm(A); and fluorescence spectra of NaYF4:Yb,Er UCNPs under an excitation wavelength of 980 nm(B)

圖4A所示為NaYF4:Yb,Er UCNPs修飾的FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記DNA探針的FAM熒光光譜圖。我們將dBSA/NaYF4:Yb,Er UCNPs與氨基化FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA探針反應(yīng)，通過加入EDC縮合劑與否來判斷羧基與氨基是否為共價鍵結(jié)合。從圖中可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在反應(yīng)中加入了一定量的EDC時，我們能明顯地觀察到FAM熒光基團(tuán)在522 nm處有強(qiáng)吸收峰(FAM的激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為522 nm)；當(dāng)未加入EDC時，我們無法測到洗滌后溶液中FAM的熒光強(qiáng)度。這充分說明了羧基化蛋白修飾的NaYF4:Yb,Er UCNPs與氨基化DNA探針已通過酰胺反應(yīng)共價鍵牢固地結(jié)合在一起，而不是簡單的物理吸附。圖4B顯示了NaYF4:Yb,Er UCNPs經(jīng)過羧基化蛋白修飾與探針修飾后的熒光情況，從它們的熒光光譜圖可觀察出：在980 nm激光器的激發(fā)下，修飾前后的NaYF4:Yb,Er熒光強(qiáng)度沒有產(chǎn)生很大變化，熒光強(qiáng)度和性能仍較好。

圖5為DNA雜交后溶液中FAM與UCNP的熒光光譜圖。在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用堿基堆積力作用原理進(jìn)行DNA雜交檢測。堿基堆積力可提供較強(qiáng)的額外作用力來維持長核苷酸序列與兩條相鄰短核苷酸序列的穩(wěn)定性，該原理已經(jīng)成功應(yīng)用于miRNA的基因芯片和熒光實(shí)時定量檢測[22-23]。在本研究中，只有在完全互補(bǔ)的目標(biāo)DNA存在的情況下，才會提供一個比較強(qiáng)的堿基堆積力來促使捕獲探針與報(bào)告探針穩(wěn)定的結(jié)合，再通過檢測可獲得雜交信號。而在無目標(biāo)DNA的情況下，即使存在著與目標(biāo)DNA極其相似的序列，在較高的雜交溫度下，也無法使得捕獲探針與報(bào)告探針穩(wěn)定地結(jié)合，因而不能獲取報(bào)告探針上的FAM熒光信號。圖5A為在480 nm激發(fā)光的激發(fā)下，目標(biāo)DNA濃度為0～100 nmol·L-1時所測的FAM熒光光譜；圖5B則為在980 nm激發(fā)光的激發(fā)下，目標(biāo)DNA濃度為0～100 nmol·L-1時所測得的UCNPs熒光光譜；兩者在不同的目標(biāo)DNA濃度下都有著相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，當(dāng)目標(biāo)DNA濃度大于5 nmol·L-1時，都能夠較清晰的檢測出DNA序列上FAM熒光基團(tuán)的信號，說明該方法的檢測底限為5 nmol·L-1，在以后的研究中我們將進(jìn)一步改進(jìn)方法，提高其靈敏度。

圖5　雜交后溶液中的FAM熒光光譜圖(A)與UCNP熒光光譜圖(B)Fig.5 FAM(A)and UCNP(B)luminescence spectra of the final hybridization solution

為了考察用NaYF4:Yb,Er UCNPs作為內(nèi)參來檢測DNA的優(yōu)點(diǎn)，我們研究了目標(biāo)DNA濃度與報(bào)告DNA中FAM熒光基團(tuán)的熒光強(qiáng)度或FAM/UCNP的熒光強(qiáng)度比之間的線性關(guān)系，分別如圖6A與B。從圖5A中，可明顯看出目標(biāo)DNA濃度與FAM的熒光強(qiáng)度在0～100 nmol·L-1間的線性關(guān)系并不明顯，兩者相關(guān)系數(shù)R2=0.738。然而，當(dāng)使用UCNP作為內(nèi)參，依據(jù)FAM/UCNP的比值來判斷目標(biāo)DNA濃度的變化時，它們在0～100 nmol·L-1間有著較好的線性關(guān)系，隨著目標(biāo)DNA濃度的增大，F(xiàn)AM/ UCNP的熒光強(qiáng)度比也隨著增大，兩者相關(guān)系數(shù)R2= 0.958。這說明用NaYF4:Yb,Er UCNPs作為內(nèi)參，能大大地提高DNA檢測的準(zhǔn)確性，減少實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的人為操作和儀器誤差。事實(shí)上，實(shí)驗(yàn)過程中常常會有難以避免的人為操作和儀器誤差存在。當(dāng)存在這些誤差時，必然會使溶液中報(bào)告DNA端的FAM熒光信號發(fā)生變化。因此如果單一地以FAM熒光強(qiáng)度為信號，肯定會導(dǎo)致最后所測結(jié)果的不準(zhǔn)確；然而，由于在同一溶液體系中，如有誤差的存在，F(xiàn)AM與UCNP都會存在相應(yīng)的變化，因此用UCNP作為內(nèi)參，以FAM/UCNP的熒光強(qiáng)度比作為信號，可很大程度地消除這些誤差的存在，使最終的檢測結(jié)果重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高。

此外，我們用不同的目標(biāo)DNA(分別與標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)DNA錯配1個堿基、錯配2個堿基、錯配多個堿基及全錯配)與探針DNA、報(bào)告DNA雜交來檢測該方法區(qū)別堿基錯配的能力及特異性強(qiáng)弱。如圖7所示，只有當(dāng)目標(biāo)DNA與探針前部分堿基完全互補(bǔ)配對時，才能促進(jìn)報(bào)告DNA與探針雜交，進(jìn)而可檢測到報(bào)告DNA中FAM熒光基團(tuán)在522 nm處的發(fā)射峰，然而錯配1個或多個堿基都無法檢測到FAM基團(tuán)在522 nm處的發(fā)射峰。這說明該方法有較強(qiáng)的堿基錯配識別能力及好的特異性。

圖6　目標(biāo)DNA濃度分別與FAM熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系圖(A)與FAM/UCNP熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系圖(B)Fig.6 Linear relationships between target DNA concentration and the fluorescence intensity of FAM(A), and between target-miRNAs concentration and the intensity ratios of FAM/UCNPs(B)

圖7　不同目標(biāo)DNA雜交后的FAM熒光光譜圖Fig.7 FAM luminescence spectra of final hybridization solution for different DNA sequences

3　結(jié)論

本文以形貌、尺寸均一，表面富有羧基官能團(tuán)修飾的NaYF4:Yb,Er UCNPs為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，利用堿基堆積力原理快速便捷地檢測目標(biāo)DNA。通過多次實(shí)驗(yàn)證明，該方法比傳統(tǒng)的以報(bào)告DNA為單一信號所檢測的結(jié)果要更為精準(zhǔn)，在無擴(kuò)增的前提下，最低檢測限達(dá)5 nmol·L-1，且重復(fù)性好，特異性高。此簡便方法有望在疾病的早期檢測和預(yù)防上發(fā)揮巨大的應(yīng)用潛能。

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Accurate Detection of DNA Based on the NaYF4：Yb,Er Upconversion Nanoparticles

MAO Lan-Lan1ZHANG Li-Ming1DENG Yan1LüZhuo-Xuan＊,1HE Nong-Yue＊,1,2
(1Economical Forest Cultivation and Utilization of 2011 Collaborative Innovation Center in Hunan Province,Hunan Key Laboratory of Green Chemistry and Application of Biological Nanotechnology,Hunan University of Technology,Zhuzhou,Hunan 412007 China)
(2State Key Laboratory of Bioelectronics,School of Biological Science and Medical Engineering,Southeast University,Nanjing 210096,China)

A new method for improving the accuracy of DNA detection has been developed,which was based on the base stacking principle and the fluorescence of NaYF4:Yb,Er UCNPs.Firstly,the NaYF4:Yb,Er UCNPs were synthesized by thermaldecomposition method and functionalized with denatured bovine serum albumin.Then,the denatured bovine serum albumin-functionalized OA/NaYF4:Yb,Er UCNPs were conjugated with amino groupmodified DNA probes to form upconversion fluorescence labeled probes and detect DNA.The results showed that the method of using the fluorescence of NaYF4:Yb,Er UCNPs as a reference standard to quantitatively detect target DNA concentration had higher accuracy than that of only using a single FAM fluorescence intensity,and the operation and equipment errors was effectively avoid during the experiment.Moreover,this method can reach the detection limit as low as 5 nmol·L-1without amplification,displays a good linear relationship in wide concentration range and a high specificity,and also can effectively differenciate single-base mismatch sequences.

NaYF4:Yb,Er;DNA detection;reference standard;accuracy

O614.33；O614.32

A

1001-4861(2016)12-2095-07

10.11862/CJIC.2016.271

2016-04-09。收修改稿日期：2016-09-24。

國家自然科學(xué)基金(No.61301039,61471168,61527806)和湖南省2011高等學(xué)校協(xié)同創(chuàng)新中心(No.湘教通[2013]448號)資助項(xiàng)目。

＊通信聯(lián)系人。E-mail：luzhuoxuan1981@163.com;nyhe@seu.edu.cn