嗜堿性假單胞菌對菲的降解研究

溫文靜，譚麗嬋，雒曉芳，熊 梅，胡 紅，張 巍，娜吾巴爾·阿布都黑力，許淑娟

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學 實驗中心，甘肅蘭州730030）

嗜堿性假單胞菌對菲的降解研究

溫文靜1，譚麗嬋1，雒曉芳2＊，熊 梅1，胡 紅1，張 巍1，娜吾巴爾·阿布都黑力1，許淑娟1

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學 實驗中心，甘肅蘭州730030）

目的：研究和分析嗜堿性假單胞菌株對菲的降解.方法：采用索氏提取法，以活性炭為吸附載體，多環(huán)芳烴為惟一碳源，研究嗜堿性假單胞菌在不同的溫度、pH和鹽度條件下對菲降解率的影響.結(jié)果：將此菌株培養(yǎng)48h后，溫度為37℃時，菲的降解率可達39.8%.當pH值為7.0時，菲的降解率可達47.1%；當鹽度為120mmol／L時，菲的降解率可達28.4%.結(jié)論：嗜堿性假單胞菌對菲有較高的降解效率，pH、溫度、鹽度三個因素對菌株的降解率有較大影響.

嗜堿性假單胞菌；菲；降解率

隨著石油消耗的增加，環(huán)境中多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的濃度也逐漸增大，廣泛分布在空氣、土壤、海水及沉淀物中［1，2］.多環(huán)芳烴是一類有兩個或兩個以上稠合苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，具有疏水性及低水溶性，易吸附于固體顆粒并能長期存在于環(huán)境中，是一種持久性的有機污染物.由于多環(huán)芳烴的潛在毒性、致癌性及致畸誘變作用，對人類健康和生態(tài)環(huán)境具有很大的潛在危害，已引起各國環(huán)境科學家的極大重視［3～4］.石化工業(yè)造成的污染是高濃度多環(huán)芳烴的主要來源，萘、蒽、菲、芘、苊等是石油化工中常見的多環(huán)芳烴化合物，同時在這些污染環(huán)境中也蘊藏著豐富的降解微生物 .這些都是對多環(huán)芳烴污染進行生物修復的寶貴資源［5］.微生物降解在PAHs的遷移轉(zhuǎn)化乃至最終消失的過程中占有重要地位，是PAHs從環(huán)境中去除的最主要途徑，因此PAHs的生物修復受到了極大關(guān)注［6，7］.降解多環(huán)芳烴的微生物主要有細菌和真菌.相較于細菌而言，真菌能降解PAHs的種類并不多，但降解PAHs的效率通常高于細菌，特別是在降解高環(huán)多環(huán)芳烴方面表現(xiàn)突出［9］.PAHs最初的形態(tài)大多數(shù)為氣態(tài)的，部分冷卻后形成顆粒物或吸附在顆粒物上，隨著顆粒物的飄動發(fā)散在環(huán)境各處，通過沉降和降水沖洗作用而污染地面水和土壤，植物在生長過程中會從中吸收、轉(zhuǎn)移并富集PAHs，植物腐爛后，PAHs又回到土壤中.同時PAHs也可以通過食物鏈在動物體內(nèi)累積，嚴重危害了人類健康［10］.因此，如何加快PAHs在環(huán)境中的降解，減少其對環(huán)境的污染，成為人們?nèi)找骊P(guān)注的話題.

本實驗主要研究在不同條件下嗜堿性假單胞菌對菲的降解影響，以嗜堿性假單胞菌對菲的降解率為評價指標，掌握銅綠假單胞菌對菲的最佳降解條件，為微生物降解多環(huán)芳烴的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)，對提高多環(huán)芳烴污染物的降解效率，具有十分重要的意義.

1 嗜堿性假單胞菌的獲得

1.1 微生物菌株來源

此菌株由西北民族大學實驗中心形態(tài)實驗室微生物學分室分離獲得.

1.2 菌種保存

將此菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上保存，4℃冰箱備用.

1.3 形態(tài)觀察和生理生化特性指標的測定

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中所列各項實驗內(nèi)容和試驗方法初步鑒定.

2 培養(yǎng)基及試劑

2.1 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基.

2.2 試劑

菲、NaOH、HCl、NaCl、環(huán)己烷、活性炭（均為分析純）.

3 實驗方法

3.1 菌種復活及樣品制備

取出嗜堿性假單胞菌在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C下培養(yǎng)48h.

取若干個50mL錐形瓶，分別加入菲0.5g，用10mL左右的環(huán)己烷溶液溶解，完全溶解后加入10 g活性炭，放置48h，待環(huán)己烷完全揮發(fā).

3.2 不同培養(yǎng)條件下嗜堿性假單胞菌對菲的降解

取以上制備好的樣品，加入濃度為10mL，菌濃度為（0.75～1.56）×108個／mL的菌液，密封并置于搖床上培養(yǎng)，分別于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃下振蕩48h后測定菲的降油率，并作圖比較.

在37℃條件下，用1mol／L的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)菌液的pH值分別為5、6、7、8、9，然后加入到含有處理好的菲的三角瓶中振蕩培養(yǎng)48h后，測定菲的降油率，并作圖比較.

將10mL的菌液分別加入處理好的含有菲的三角瓶中，然后再向其中加入NaCl，使NaCl的濃度分別為20mmol／L、40mmol／L、80mmol／L、120mmol／L和160mmol／L，振蕩培養(yǎng)48h后測定菲的降油率，并作圖比較.

3.3 降油率的測定

采用索氏提取法，將樣品分別裝入圓柱形的濾紙盒中，用回形針封口后裝入索氏提取器的提取管中，再量取環(huán)己烷倒入提取瓶中，最后把圓底燒瓶、提取管、冷凝器三部分連接，安裝好索氏提取器，把圓底燒瓶放入到水浴鍋中，在水浴鍋中加滿水.由于不同芳香環(huán)系對紫外有特征吸收峰［10］，可在48h后采用紫外可見分光光度計在293nm處測定菲的吸光度，最后根據(jù)標準菲工作曲線換算出含油量.

3.4 菲標準曲線的繪制

菲標準曲線的繪制參照雒曉芳［11］和汪如婷［12］等的標準曲線的計算方法進行.

4 結(jié)果與分析

4.1 不同溫度條件下嗜堿性假單胞菌對菲的降解

圖1為菲在不同溫度條件下培養(yǎng)48h后的降解率.溫度是影響微生物體內(nèi)物質(zhì)代謝過程的一個重要環(huán)境因素，它能夠通過影響降解酶的活性來調(diào)節(jié)微生物對外源物質(zhì)的降解速度.在適宜的溫度范圍內(nèi)，細菌的代謝能達到較高的速率，從而能較快地降解外源物質(zhì).由圖1可知，溫度對嗜堿性假單胞菌降解多環(huán)芳烴具有較大的影響.隨著培養(yǎng)溫度的升高，菲降解率上升，25℃時菲的降解率為20.1%.隨著溫度的升高，降解率上升速率逐漸提高，當溫度為35℃時，菲的降解率達到最高值為37.8%.35℃之后菲的降解率開始下降，這可能是因為嗜堿性假單胞菌的最適生長溫度為35℃.該結(jié)果表明溫度對嗜堿性假單胞菌降解菲具有較大影響.

4.2 不同pH條件下嗜堿性假單胞菌對菲的降解

圖1 在不同溫度條件下嗜堿性假單胞菌對菲降解率的影響

圖2 在不同pH條件下嗜堿性假單胞菌對菲降解率的影響

圖2為菲在不同pH條件下培養(yǎng)48h后的降解率.pH值能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)的空間構(gòu)象產(chǎn)生顯著影響，過低或過高的pH值均能夠降低酶的活性，不利于降解酶活性的發(fā)揮.同時，不適宜的pH值會使細胞膜上的電荷產(chǎn)生變化，從而影響菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改變微生物的生長速度并影響其代謝途徑［13］.由圖2可知，pH值對多環(huán)芳烴的降解率具有較大的影響，當pH＜7.0時，菲的降解率隨之降低；當pH值為7.0時多環(huán)芳烴達到最高降解率，菲的降解率達到47.1%.當pH＞7.0時，隨著pH的升高，降解率降低.因此，嗜堿性假單胞菌對菲的降解最適pH為7.0.

4.3 不同鹽度條件下嗜堿性假單胞菌對菲的降解

圖3 在不同鹽度條件下嗜堿性假單胞菌對菲降解率的影響

圖3為菲在不同鹽度條件下培養(yǎng)48h后的降解率.不同的微生物對滲透壓變化的適應(yīng)能力不盡相同.如圖3所示，嗜堿性假單胞菌在鹽濃度為120mmol／L時生長良好，對菲的降解效率最高.當鹽濃度在120mmol／L以下時，降解率有所下降.當鹽濃度超過120mmol／L，菌體的生長明顯受到抑制，降解率迅速下降.在鹽濃度為160mmol／L時，降解率為9.76%，菌體幾乎不再生長，這表明過高的鹽濃度不利于假單胞桿菌的生長繁殖.

5 結(jié)論

在單因素條件下，溫度、pH、鹽度對嗜堿性假單胞菌降解多環(huán)芳烴菲具有較大的影響.嗜堿性假單胞菌降解多環(huán)芳烴菲的最適降解溫度為35℃，最適降解pH為7，最適降解鹽度為120mmol／L.實際應(yīng)用時，應(yīng)根據(jù)菌株來調(diào)節(jié)相應(yīng)的環(huán)境因素，使降解效果達到最優(yōu).

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Research on the Features for Phenanthrene Degradation by Basophilic pseudomonas

WEN Wen-jing1，TAN Li-chan1，LUO Xiao-fang2＊，XIONG Mei1，HU Hong1，ZHANG Wei1，NAWUBAER Abuduheili1，XU Shu-juan1
（1.Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730100，China；2.Center of Experiment，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730100，China）

Objective The article aimed to study and analyse the degradation of Basophilic pseudomonas strain on phenanthrene.Methods The effects of polycyclic aromatic hydrocarbons as sole source of carbon on the degradation rate of phenanthrene in different temperature，pH and salinity conditions were studied by using the method of Soxhiet extraction，by using activated carbon as adsorbent and polycyclic aromatic hydrocarbons as sole carbon source.Results After Basophilic pseudomonas strain was cultured for 48h，the degradation rate of phenanthrene was 39.8%，47.1%and 28.4%at the temperature of 37℃，pH 7and 120mmol／L salinity，respectively.Conclusion Basophilic pseudomonas strain had high degradation efficiency on phenanthrene.pH，temperature and salinity existed a great influence on the degradation rate of phenanthrene.

Basophilic pseudomonas；Phenanthrene；Degradation rate

Q935

A

1009-2102（2016）04-0058-04

2016-08-02

西北民族大學2016年本科生科研創(chuàng)新項目（URIP16221）.

＊

溫文靜（1994—），女，海南陵水人.