中藥骨康方對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞骨架保護(hù)作用的初步實(shí)驗(yàn)研究

張姝江 李 穎 白 波 陳 藝

(1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東省矯形技術(shù)與植入材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州，510120；2 廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，佛山，528200)

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中藥骨康方對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞骨架保護(hù)作用的初步實(shí)驗(yàn)研究

張姝江1李 穎2白 波1陳 藝1

(1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東省矯形技術(shù)與植入材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州，510120；2 廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，佛山，528200)

目的：探討在離心力作用下中藥骨康方對(duì)大鼠成骨細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的保護(hù)與修復(fù)作用。方法：選用成年新西蘭白兔，分2組分別灌服中藥骨康方及戊酸雌二醇，制備中藥骨康方和雌激素的含藥血清。原代培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞，制備細(xì)胞爬片，分為中藥骨康方血清培養(yǎng)組(中藥組)，雌激素血清培養(yǎng)組(西藥組)、不含藥血清組(對(duì)照組)以及空白組。中藥組、西藥組及對(duì)照組3組細(xì)胞分別在240 g、200 g離心力下離心4 min，空白組不離心，離心后培養(yǎng)24 h以多聚甲醛固定各組細(xì)胞，鬼筆環(huán)肽熒光染色后，于共聚焦顯微鏡下觀察。每張細(xì)胞爬片隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野5～7個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均熒光值，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：不同離心力作用下，中藥組、西藥組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞比較熒光強(qiáng)度明顯較強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。中藥組與西藥組中，240 g離心力與200 g離心力相比，前者細(xì)胞微絲熒光強(qiáng)度顯著減弱(P<0.001)；中藥組與西藥組相比，200 g時(shí)，中藥組細(xì)胞微絲熒光強(qiáng)度強(qiáng)于西藥組細(xì)胞，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);240 g時(shí)，西藥組細(xì)胞微絲熒光強(qiáng)度強(qiáng)于中藥組細(xì)胞，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)論：離心力作用下，中藥骨康方含藥血清對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的微絲結(jié)構(gòu)由保護(hù)和修復(fù)作用，但隨著離心力的加大，該作用有限。

中藥；成骨細(xì)胞；肌動(dòng)蛋白；機(jī)械應(yīng)力

成骨細(xì)胞在繼續(xù)分化為骨細(xì)胞并修復(fù)重建骨結(jié)構(gòu)的過(guò)程會(huì)收到環(huán)境中力學(xué)刺激的影響，而成骨細(xì)胞如何感應(yīng)到力學(xué)作用并轉(zhuǎn)化為信號(hào)影響其自身的增殖和相關(guān)蛋白表達(dá)是如今的一個(gè)研究點(diǎn)。目前有研究對(duì)機(jī)械應(yīng)力作用于成骨細(xì)胞后，細(xì)胞骨架的變化進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)靜壓力使細(xì)胞間隙發(fā)生改變，而流體剪切力則直接影響胞質(zhì)微絲排列，從而使細(xì)胞骨架異常，發(fā)生細(xì)胞皺縮和形態(tài)改變[1-2]。周期性應(yīng)力對(duì)骨質(zhì)疏松的成骨細(xì)胞有增粗微絲改善細(xì)胞骨架的作用。但是離心力對(duì)細(xì)胞骨架主要是破壞作用，而中藥骨康方能否對(duì)這種破壞作用起到保護(hù)效果，以及其機(jī)制為何是本研究探討的內(nèi)容。

1 資料與方法

1.1 一般資料 戊酸雌二醇(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，中國(guó))，中藥骨康方提取液(含生藥量1.43 g/mL，廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院制劑室)，藥物組成為：補(bǔ)骨脂，制淫羊藿，熟地黃，肉蓯蓉，當(dāng)歸，大棗，黃芪，白芍，菟絲子；小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclon公司，美國(guó))，鬼筆環(huán)肽(FITC-Phalloidin，Sigma)，共聚焦顯微鏡(Zeiss公司，德國(guó))，低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó))，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 將4只健康新西蘭兔隨機(jī)分為2組，每組2只，分為中藥觀察組和西藥對(duì)照組。觀察組灌服中藥骨康方，對(duì)照組灌服戊酸雌二醇，灌胃給藥容積為10 mL/kg。用藥量以成人的用量推算動(dòng)物用量，根據(jù)人與動(dòng)物及各類(lèi)動(dòng)物間藥物劑量換算方法計(jì)算[6]。成人按60 kg計(jì)算，每天口服28.6 g中藥復(fù)方，以此推算：兔中藥復(fù)方用量=2.30×28.6×60-1g×kg-1=1.096 g×kg-1；成人按60 kg計(jì)算，每天口服1 mg戊酸雌二醇，以此推算：兔戊酸雌二醇用量=2.30×1×60-1mg×kg-1=0.038 mg×kg-1。所用藥物以蒸餾水定容至所需濃度，灌胃1次/d，連續(xù)灌胃7 d。2組大白免連續(xù)灌胃1周，最后一次灌胃后2 h，分別行心臟采血，將獲得的全血置于含抗凝劑的試管中，5～10 min后，于3 000 r/min離心15 min，吸取上清，即獲取含藥血清，再滅活，抽濾除菌，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SD大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng) 1周齡SD大鼠的乳鼠20只，雌雄不限，處死后常規(guī)消毒。無(wú)菌條件下取乳鼠頭蓋骨，去掉肌肉及結(jié)締組織，用含雙抗的磷酸緩沖液(Phosphate Buffer Solution，PBS)漂洗后剪碎，加入0.1% EDTA與0.25%胰蛋白酶(Typsin，TNE)，于37 ℃下消化30 min。加入含血清的培養(yǎng)基DMEM中止消化，棄去上清液，加入0.1%的I型膠原酶，繼續(xù)于37 ℃下消化1 h。取消化后的混懸液離心，棄上清，加入20%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打使細(xì)胞分散均勻。以105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37 ℃，飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液。選擇3代成骨細(xì)胞，分別以不同含藥血清做預(yù)處理培養(yǎng)，分為中藥骨康方血清培養(yǎng)組(中藥組)、雌激素血清培養(yǎng)組(西藥組)以及空白組：分別加入10%中藥組兔血清的高糖DMEM、10%西藥組兔血清的高糖DMEM以及10%小牛血清高糖DMEM，培養(yǎng)3～5 d，待細(xì)胞達(dá)到80%融合后，用0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA混合液消化傳代，接種于蓋玻片上制成細(xì)胞爬片。

1.2.3 不同離心力對(duì)細(xì)胞骨架作用觀察 中藥組、西藥組以及對(duì)照組的細(xì)胞爬片培養(yǎng)2 d后，分別于240 g和200 g離心力下離心，離心時(shí)間4 min；空白組細(xì)胞爬片不加藥物亦不離心處理。離心后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各組細(xì)胞爬片以多聚甲醛固定細(xì)胞。

1.2.4 成骨細(xì)胞牽引后激光共聚焦顯微鏡下肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的原位表達(dá) 固定后的細(xì)胞爬片經(jīng)PBS漂洗后，加入鬼筆環(huán)肽,5 μg/mL，避光，于37 ℃下孵育30 min；PBS洗片兩次，避光，以PI20 μg/mL復(fù)染30 min,50%甘油封片。激光共聚焦顯微鏡(LSM70，德國(guó)Zeiss)下觀察,選擇波長(zhǎng)為488 nm。隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野讀取熒光強(qiáng)度并計(jì)算平均值。

2 結(jié)果

共聚焦熒光顯微鏡下觀察，熒光染色后的細(xì)胞骨架。240 g離心力作用后，對(duì)照組與含藥血清培養(yǎng)的中藥組及西藥組比較，前者微絲松散、紊亂，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、翻卷，熒光強(qiáng)度明顯較弱(圖1)；而240 g離心力作用后，中藥組與西藥組成骨細(xì)胞的微絲松散程度相似，形態(tài)略皺縮，熒光強(qiáng)度差異不大。200 g受力細(xì)胞中，中藥組與西藥組成骨細(xì)胞的微絲保持較完整，形態(tài)正常，2組在熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)差別不大；未用藥的對(duì)照組細(xì)胞在受離心力作用后，細(xì)胞皺縮翻卷明顯，細(xì)胞骨架熒光暗淡、紊亂(圖2)。與不受力的空白對(duì)照組相比，中藥組200 g和西藥組200 g的細(xì)胞形態(tài)與正常貼壁細(xì)胞相同。

圖1

圖2

每組熒光染色細(xì)胞爬片在鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野讀取5～7個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度平均值，結(jié)果計(jì)算s，具體結(jié)果見(jiàn)表1。中藥組與西藥組之間進(jìn)行比較，并與未用藥的對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)：不同離心力作用下，含藥血清培養(yǎng)的2組細(xì)胞與未用藥對(duì)照組細(xì)胞，其熒光強(qiáng)度明顯較強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。含藥血清培養(yǎng)的2組細(xì)胞中，240 g受力與200 g受力相比，前者細(xì)胞微絲熒光強(qiáng)度顯著減弱(P<0.001)；中藥組與西藥組相比，在200 g時(shí)，中藥組細(xì)胞微絲的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于西藥組細(xì)胞，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但240 g時(shí)，西藥組細(xì)胞微絲熒光強(qiáng)度強(qiáng)于中藥組細(xì)胞，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

表1 中西藥物組在不同轉(zhuǎn)速離心后的細(xì)胞骨架熒光值讀數(shù)比較(s)

3 討論

力學(xué)刺激在骨的發(fā)生以及成骨細(xì)胞修復(fù)骨組織損傷都有重要的作用。在周期性的機(jī)械應(yīng)變力、太空微重力等環(huán)境下，骨細(xì)胞骨架可以發(fā)生重排，機(jī)械力對(duì)細(xì)胞的成長(zhǎng)分化有重要作用[3-5]。靜壓力和剪切力對(duì)成骨細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)作用不同，靜壓力作用下的細(xì)胞形態(tài)變化微弱，但剪切力可以使細(xì)胞內(nèi)微絲成束重排，細(xì)胞變形脫落[2]，陳偉輝等[1]發(fā)現(xiàn)在流體剪切力作用后，受力的大鼠成骨細(xì)胞株出現(xiàn)皺縮、脫落和微絲解聚消散。而離心力對(duì)細(xì)胞內(nèi)微絲系統(tǒng)有類(lèi)似剪切力的效果。陳國(guó)平等[6]觀察到在離心力作用下，成骨細(xì)胞的微絲結(jié)構(gòu)出現(xiàn)解聚，去除刺激后可以緩慢恢復(fù)。關(guān)鍵等發(fā)現(xiàn)[7]，離心力對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞株的刺激可導(dǎo)致Runx2的mRNA表達(dá)增加；Li等[8]對(duì)成骨樣細(xì)胞施加離心力10 min后檢測(cè)到Runx2/Cbfal mRNA表達(dá)水平有短暫地增加改變，認(rèn)為成骨細(xì)胞通過(guò)多種復(fù)雜途徑響應(yīng)機(jī)械力學(xué)刺激。Fitzgerald等[9]認(rèn)為對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞加載3×g到287×g離心力都會(huì)引起特定基因的mRNA表達(dá)增加。機(jī)械力學(xué)刺激對(duì)細(xì)胞的多種影響最終體現(xiàn)在細(xì)胞骨架的改變上，機(jī)械應(yīng)力作用下，在細(xì)胞表面的信號(hào)通路相關(guān)蛋白覺(jué)察到應(yīng)力刺激信號(hào)后，通過(guò)細(xì)胞骨架介導(dǎo)下游(Down Stream)反應(yīng)[10-11]，從而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖和分化，影響骨改建。

中藥對(duì)于治療骨病及關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)已有悠久歷史，目前也有許多研究者針對(duì)中藥治療骨病的藥物作用機(jī)制進(jìn)行研究。有研究報(bào)道，骨康方可以調(diào)高成骨細(xì)胞保護(hù)素和核內(nèi)因子a1mRNA的表達(dá)水平，從而促進(jìn)骨保護(hù)蛋白的表達(dá)分泌[12]，而該方在大鼠骨質(zhì)疏松模型的研究中也表現(xiàn)出可以調(diào)高骨密度的作用[13]。成骨細(xì)胞在未受力時(shí)，纖維束粗大而分布均勻，應(yīng)力纖維清晰可見(jiàn)，受力后,大多數(shù)細(xì)胞的纖維束變得纖細(xì)而稀疏，分布不均勻，方向性變差，并且隨加力時(shí)間延長(zhǎng)而更加明顯[14]。通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行觀察，可以了解在機(jī)械力作用后細(xì)胞骨架的變化?？偀晒鈴?qiáng)度、綠色熒光強(qiáng)度隨加力時(shí)間延長(zhǎng)均顯著降低，這說(shuō)明微絲結(jié)構(gòu)在機(jī)械牽張下發(fā)生了解聚和重排。肌動(dòng)蛋白F-actin是微絲的主要成分,其重排和解聚的動(dòng)態(tài)變化，可以反映部分細(xì)胞的功能狀況，尤其是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的狀況。以含藥血清體外培養(yǎng)細(xì)胞并觀察藥物對(duì)細(xì)胞的影響是常用的實(shí)驗(yàn)研究手段[12,15-16]。本研究采用中藥骨康方湯劑喂食大鼠后制備同種動(dòng)物系的含藥血清，并通過(guò)熒光染色觀察F-actin的變化，從而研究含藥血清對(duì)大鼠MSC細(xì)胞骨架的保護(hù)和修復(fù)作用。經(jīng)骨康方含藥血清培養(yǎng)的大鼠MSC細(xì)胞在經(jīng)過(guò)離心力作用后，細(xì)胞骨架微絲系統(tǒng)能獲得一定程度的保護(hù)和修復(fù)，其效果與雌激素含藥血清培養(yǎng)的細(xì)胞類(lèi)似，在200 g離心力時(shí)，甚至優(yōu)于雌激素含藥血清的保護(hù)作用。但隨著離心力的加大，該保護(hù)作用有限，到240 g時(shí)，該保護(hù)作用弱與雌激素含藥血清的效果，細(xì)胞還是會(huì)出現(xiàn)骨架微絲系統(tǒng)紊亂的現(xiàn)象。但與完全無(wú)含藥血清的對(duì)照組細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞骨架被破壞程度小，且在停止離心力作用并培養(yǎng)1 d后，可以得到恢復(fù)。

目前已知常用的治療骨質(zhì)疏松的藥物包括雌激素，阿侖膦酸鈉等，此類(lèi)藥物對(duì)成骨細(xì)胞骨架有修復(fù)和保護(hù)的作用[17]。中藥骨康方也是用于骨質(zhì)疏松防治的中藥方劑，有實(shí)驗(yàn)研究[18-20]證明中藥骨康方對(duì)骨代謝既可抑制骨吸收，又可促進(jìn)骨形成，從而改善骨的質(zhì)量。臨床研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于骨質(zhì)疏松的患者采用該方治療后，骨密度有明顯增加[20]。根據(jù)本研究的結(jié)果，中藥骨康方在成骨細(xì)胞受到外力刺激，對(duì)細(xì)胞微絲等結(jié)構(gòu)系統(tǒng)產(chǎn)生破壞作用后，該方也顯示出了保護(hù)和修復(fù)的作用。此修復(fù)與保護(hù)效果為骨質(zhì)疏松的防治也提示了一條新的路徑。

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(2015-08-20收稿 責(zé)任編輯：徐穎)

Preliminary Study on the Protective Effects of Gukang Fang on Microfilaments of Osteoblasts in Rats

Zhang Shujiang1, Li Ying2, Bai Bo1, Chen Yi1

(1TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangdongKeylaboratoryofOrthopaedicTechnologyandImplantMaterials,Guangzhou510120,China; 2GuangdongIntegratedHospitalofTraditionalChineseMedicineandWesternMedicine,Foshan528200,China)

Objective: To explore the protective and repairing effect of Gukang serum for the F-actin of osteoblasts. Methods: Two groups of New Zealand adult rabbits were fed with Chinese medicine Gukang Fang and estradiol valerate to make the serum containing Gukang and estrogen. The osteoblasts were separated from SD rats and then cultured. The cells were seeded onto cover glasses, and divided into Chinese medicine group and estrogen group, which were cultured with Gukang-containing serum and estrogen-containing serum respectively. Non-drug group(control group) and blank group were also set up. The Chinese medicine group, estrogen group and control group were centrifuged at 240 g and 200 g for 4 min. All the samples were fixed by paraformaldehyde solution and then dyed by FITC-phalloidin. The samples were observed by confocal microscope, and the fluorescence intensities were calculated and compared by one-way ANOVA. Results: The two groups disposed by drug-containing serum showed better fluorescence intensitiy than the control group(P<0.001). At 200 g, Chinese mecicine group presented better than the estrogen group in fluorescence intensity; while at 240 g, estrogen group performed better in fluorescence intensity, and the differences were significant(P<0.001). Conclusion: Gukang-containing serum may protect and repair the microfilaments in osteoblasts of rat when exposed to centrifugal force, yet as the force increases, the protective and repairing effect might be limited.

Medicine; Chinese traditional; Osteoblast; Actins; Stress; Mechanical

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃珠江科技新星專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào)：2012J2200037)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81001532)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：S2014A030313748)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào)：2013B021800162)

張姝江(1977.02—)，女，醫(yī)學(xué)博士，骨外科學(xué)講師，研究方向：骨與軟骨的損傷修復(fù)及組織工程，E-mail：orthop_zsj@163.com，Tel：(020)83341479

李穎(1979.02—)，男，醫(yī)學(xué)博士，骨外科學(xué)副主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合骨質(zhì)疏松治療，E-mail：leewinly@163.com

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10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.035