種子類藥材補(bǔ)骨脂及其混偽品的ITS2條形碼序列鑒定

周建國 馬雙姣 黃玉龍 石林春 金 鉞 姚 輝

(1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100193； 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙，410208)

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種子類藥材補(bǔ)骨脂及其混偽品的ITS2條形碼序列鑒定

周建國1馬雙姣1黃玉龍2石林春1金 鉞1姚 輝1

(1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100193； 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙，410208)

目的：種子類藥材補(bǔ)骨脂具有肝腎毒性，其混偽品曼陀羅子、天仙子、洋金花的種子、豬屎豆也含有毒性成分，且補(bǔ)骨脂與其混偽品外形相似，易導(dǎo)致混用誤用，嚴(yán)重危害人體健康。本研究利用DNA條形碼技術(shù)，分析補(bǔ)骨脂及其混偽品的ITS2序列，以期快速準(zhǔn)確鑒定補(bǔ)骨脂及其混偽品，保證其用藥安全及臨床療效。方法：對補(bǔ)骨脂及其混偽品樣品進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增ITS2序列，并進(jìn)行雙向測序，所有序列用MEGA6.0軟件進(jìn)行種間、種內(nèi)Kimura2-parameter(K2P)遺傳距離計(jì)算，并構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹。結(jié)果：補(bǔ)骨脂ITS2序列長度為233bp，G+C含量為69.5%，種內(nèi)無變異位點(diǎn)。補(bǔ)骨脂與其混偽品種間變異位點(diǎn)較多，種間K2P最小距離為0.5321，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其種內(nèi)距離，NJ樹顯示可以將補(bǔ)骨脂及其混偽品完全分開。結(jié)論：ITS2條形碼序列可準(zhǔn)確鑒別種子類藥材補(bǔ)骨脂及其混偽品，為保證補(bǔ)骨脂的臨床用藥安全和種質(zhì)資源鑒定提供了良好的技術(shù)手段。

補(bǔ)骨脂；ITS2序列；鑒定；DNA條形碼；混偽品

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，據(jù)《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版一部記載其性辛、苦、溫，歸腎、脾經(jīng)。內(nèi)用溫腎助陽，納氣平喘，溫脾止瀉；外用消風(fēng)祛斑。用于腎陽不足，陽疾遺精，五更泄瀉等；外用治白癱風(fēng)，斑禿[1]。由于補(bǔ)骨脂有較為悠久的用藥歷史，療效確切，近年來需求量不斷增加，但原有的道地藥材供不應(yīng)求，致使各種混偽品乘虛而入，而且補(bǔ)骨脂為細(xì)小種子類中藥，混偽品外形與其相似度較高，靠傳統(tǒng)方法很難有效鑒別，導(dǎo)致誤用現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重影響臨床用藥安全，甚至危及患者生命。據(jù)文獻(xiàn)資料記載，補(bǔ)骨脂的混偽品主要為：苘麻子AbutilontheophrastiMedic.、曼陀羅子DaturastramoniumL.、天仙子HyoscyamusnigerL.、萊菔子RaphanussativusL.、洋金花D.metelL.的種子、沙苑子AstragaluscomplanatusR.Br.、豬屎豆CrotalariapallidAit.和木蝴蝶Oroxylumindicum(L.)Vent.[2-6]。其中，曼陀羅子、天仙子、洋金花的種子和豬屎豆都有一定的毒性，臨床報(bào)道因誤服偽品而使患者中毒的現(xiàn)象不勝枚舉。曼陀羅子主要有毒成分為莨菪堿、東莨菪堿等，誤食后可使人口干、神志模糊、瞳孔散大[5]；天仙子有大毒，特別是服用過量可產(chǎn)生劇毒，使人神智錯(cuò)亂，有昏昏欲仙之感[7]；洋金花的種子主要成分為東莨菪堿，少量可起到麻醉鎮(zhèn)靜作用，過量易導(dǎo)致急性中毒，甚至死亡[8]；豬屎豆主要有毒成分為吡咯里西啶生物堿(PAs)，是目前已知的最重要的植物性肝毒成分，可誘發(fā)肝癌、肺癌等癥[9]。沙苑子雖然功效與補(bǔ)骨脂有部分相似，但是它們的歸經(jīng)不完全相同，以致它們的配伍會(huì)不同，而且他們的用法用量也有區(qū)別；苘麻子和萊菔子則功效與補(bǔ)骨脂相差甚遠(yuǎn)。由于補(bǔ)骨脂別名為破故脂、故紙，而木蝴蝶也有故紙、洋故紙的俗稱，所以二者臨床中混用誤用的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，常有醫(yī)生和調(diào)配人員因名迷實(shí)，存在錯(cuò)誤處方和調(diào)劑的現(xiàn)象[10]。黃應(yīng)安[11]曾報(bào)道當(dāng)?shù)爻０涯竞`用為補(bǔ)腎壯陽藥，民間自購滋補(bǔ)品燉食雞鴨時(shí)，木蝴蝶是一味不可或缺的中藥配方。但木蝴蝶與補(bǔ)骨脂的功效截然不同，誤用不僅延誤治療，而且可能會(huì)加重病情，極大地影響了醫(yī)師對治療方案的療效評價(jià)。另外，據(jù)報(bào)道，補(bǔ)骨脂本身也有一定的肝腎毒性，其主要成分補(bǔ)骨脂素，可使人惡心、胃痛、頭痛[12-13]，Clark等[14]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素作為抗癌劑可以引發(fā)正常細(xì)胞發(fā)生突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。所以如果補(bǔ)骨脂混用于其他藥材中，長期服用會(huì)對患者的肝腎產(chǎn)生一定的損害。

綜上所述，混偽品的使用不僅給人們的健康帶來危害，甚至威脅人們的生命安全，也給中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展帶來了不利的影響。所以，準(zhǔn)確有效的鑒別補(bǔ)骨脂及其混偽品，對于其臨床安全用藥、保證療效具有重要作用。目前，已有學(xué)者對補(bǔ)骨脂及其混偽品從來源、性狀、理化、顯微等方面進(jìn)行鑒定[2-6、10-11、15]。作為傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法有效補(bǔ)充的DNA條形碼(DNA barcoding)分子鑒定法，是利用基因組中一段相對較短的、公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列來進(jìn)行物種鑒定，此技術(shù)簡便高效，有法定的鑒定指導(dǎo)原則和明確的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，鑒定結(jié)果有良好的可重復(fù)性，方法穩(wěn)定性高，通用性強(qiáng)，不受樣品性狀以及研究者的專業(yè)水平限制，避免了主觀人為的判斷和客觀條件的影響，有助于實(shí)現(xiàn)物種鑒定規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，非常適用于中藥材的真?zhèn)舞b定[16-18]，已被《中國藥典》收錄[19-20]。目前，對植物類藥材來說，ITS2片段是最具優(yōu)勢的DNA條形碼序列之一[21-22]。本研究運(yùn)用ITS2序列對補(bǔ)骨脂及其混偽品進(jìn)行鑒定研究，旨在為該藥材的用藥安全、質(zhì)量控制、種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用等方面提供分子依據(jù)。

1 材料

研究材料包括9個(gè)物種共118份樣品，包括基原植物樣本、藥材樣本、對照藥材樣本、復(fù)核樣本和從GenBank上下載的序列。其中樣品BUGZ0001-09來自國家藥用植物種質(zhì)資源庫，所有樣品均經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定。復(fù)核樣本由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所(樣本號RC-YC0158MT01、06，RC-YC0649MT01)、北京市藥品檢驗(yàn)所(樣本號BJ-YC0612MT0405)、湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院(樣本號HN-YC0612MT04)進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證，對照藥材樣本(樣本號FDC039、FDC153、FDC148、FDC238)來自中國食品藥品檢定研究院，樣品具體信息詳見表1。

2 方法

2.1 DNA提取 將實(shí)驗(yàn)樣品用75%乙醇棉擦拭干凈，種子樣品稱取約50 mg，葉片樣品取變色硅膠干燥葉片約20 mg(注意：木蝴蝶的取樣要盡量取到其種子的胚乳部分，其翅為細(xì)胞產(chǎn)物或死細(xì)胞，DNA含量低)。向裝有樣品的EP管中分別加入約3%的PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)，經(jīng)球磨儀(Retsch MM400，Germany)研磨2 min(30次/min)，研磨后用核分離液[100 mmol/L Tris-HCL(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)，0.7 mmol/L NaCl，2% PVP-40，0.4% β-巰基乙醇]洗滌1～3遍，用植物DNA提取試劑盒(Bioteke Co.，China)提取總DNA，其余步驟按試劑盒操作說明進(jìn)行。葉片樣品65 ℃水浴30 min，種子類65 ℃水浴1 h。

2.2 PCR擴(kuò)增及測序 參照Chen等[20]的研究方法，ITS2序列的PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix(北京艾德萊生物科技有限公司，北京)12.5 μL(2.5 μmol/L)，正、反向引物各1 μL，模板DNA 2 μL(約40 ng/μL)，滅菌雙蒸水8.5 μL。通用引物為S2F：5' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'和S3R：5' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃，5 min；94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。電泳查看PCR擴(kuò)增情況，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院開放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雙向測序。

表1 樣品來源

2.3 數(shù)據(jù)處理 利用CodonCode Aligner V 5.1.5對測序得到的峰圖進(jìn)行校對和拼接，去除低質(zhì)量端和引物區(qū)，獲得嚴(yán)格一致性序列，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和從GenBank上下載的序列使用基于隱馬爾科夫模型HMMer[23]注釋方法去除5.8S和28S片段，以獲得ITS2間隔區(qū)序列，然后將所有序列用軟件Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0進(jìn)行序列比對和變異位點(diǎn)分析，并基于Kimura-2-parameter(K2P)雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離，用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)分類樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 補(bǔ)骨脂及其混偽品ITS2序列種內(nèi)種間變異分析 本研究涉及補(bǔ)骨脂不同來源序列共計(jì)30條，包括基原植物樣本4條、藥材樣本19條、對照藥材樣本1條、復(fù)核樣本和從GenBank上下載的序列6條。序列長度均為233bp，G+C含量為69.5%，種內(nèi)K2P遺傳距離為0。補(bǔ)骨脂與其混偽品種間序列進(jìn)行比對后，序列長度為287bp。見表2，ITS2序列間變異位點(diǎn)較多，達(dá)到197個(gè)，補(bǔ)骨脂與其混偽品的K2P遺傳距離范圍為：0.5321～0.7976。見表3，種間最小遺傳距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離。

表2 補(bǔ)骨脂及其混偽品的ITS2序列長度及G+C含量

表3 補(bǔ)骨脂及其混偽品ITS2序列種內(nèi)種間K2P距離計(jì)算結(jié)果與變異位點(diǎn)數(shù)目

3.2 補(bǔ)骨脂及其混偽品的ITS2序列聚類分析 因?yàn)檠a(bǔ)骨脂種內(nèi)無變異位點(diǎn)，所以選取其基原植物樣本、藥材樣本、對照藥材樣本、復(fù)核樣本和從GenBank上下載的序列各一條，用MEGA6.0構(gòu)建補(bǔ)骨脂及其混偽品的NJ系統(tǒng)分類樹(圖1)，從NJ樹中可以看出，補(bǔ)骨脂的ITS2序列聚為一支，其混偽品各自聚為一支。因此，ITS2條形碼序列可將補(bǔ)骨脂及其混偽品很好地區(qū)分開來。

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的補(bǔ)骨脂及其混偽品的NJ樹

4 討論

4.1 補(bǔ)骨脂及其混偽品的DNA提取及PCR擴(kuò)增 獲取高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行DNA條形碼研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和必要前提[24]，但中藥材中含有大量的次生代謝產(chǎn)物，DNA提取較為困難[25-26]，尤其種子類藥材內(nèi)含豐富油脂及酚類和多糖類物質(zhì)，研磨時(shí)極易被氧化，損失較大。本研究適當(dāng)加大樣品量，加大PVP(聚乙烯吡咯烷酮)使用量，用核分離液洗滌至上清液無黏稠，并延長水浴時(shí)間，補(bǔ)骨脂及混偽品均可成功提取DNA，其PCR產(chǎn)物電泳后均可顯示出單一目的條帶。多位學(xué)者在提取種子類樣品DNA時(shí)采取類似處理。馬雙姣等[27]在提取王不留行DNA時(shí)，在樣品粉碎前加入相當(dāng)于藥材量5%的PVP，粉碎后用核分離液漂洗2～3次，并65 ℃水浴3 h，可提高DNA提取效率。宋明等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在提取車前子DNA時(shí)，用核分離液洗滌3次，以56 ℃水浴8～9 h，可以成功提取其所有樣品DNA。

4.2 為中藥材從種質(zhì)資源上鑒定及臨床應(yīng)用提供保障，對中藥材種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供依據(jù) 種子是中藥材產(chǎn)業(yè)鏈的起點(diǎn)，是中藥材生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存最基本、最重要的資料，對中藥質(zhì)量和臨床療效具有至關(guān)重要的影響。然而，據(jù)報(bào)道，目前國內(nèi)中藥材種子質(zhì)檢主要參考農(nóng)作物種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，中藥材種子市場缺少全面系統(tǒng)的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)及可操作性強(qiáng)的技術(shù)[29-30]。本研究結(jié)果表明ITS2條形碼對可明顯區(qū)分種子類藥材補(bǔ)骨脂及其混偽品沙苑子、天仙子、苘麻子、萊菔子、木蝴蝶、曼陀羅子、洋金花的種子、豬屎豆，從種源上保證了藥材的品質(zhì)，該技術(shù)可推廣應(yīng)用到種子生產(chǎn)、銷售、臨床應(yīng)用等各環(huán)節(jié)。這一技術(shù)的推廣運(yùn)用，一是促進(jìn)種質(zhì)資源保護(hù)，有助于中藥材規(guī)范化安全化種植，有利于中藥材種植基地的GAP達(dá)標(biāo)。二是有助于規(guī)范藥材市場秩序，加強(qiáng)對中藥材的市場監(jiān)管，有助于藥企GMP和GLP達(dá)標(biāo)。三是有利于臨床用藥質(zhì)量和安全，保證臨床療效，維護(hù)患者切身利益，也有助于臨床SOP和GCP達(dá)標(biāo)。

4.3 DNA條形碼分子鑒定在實(shí)際工作中的意義 作為傳統(tǒng)中藥鑒定方法的補(bǔ)充，中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則中明確指出，DNA條形碼技術(shù)通過精密度考察和方法適用性考察，確保鑒定結(jié)果穩(wěn)定、可靠[16]。近年來，DNA條形碼技術(shù)已在中藥鑒定學(xué)、系統(tǒng)分類學(xué)、發(fā)育進(jìn)化、生態(tài)學(xué)、生物多樣性保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用[32-33]。本研究中選用ITS2條形碼序列對補(bǔ)骨脂及其混偽品進(jìn)行鑒定，其基原植物樣本、藥材樣本、和復(fù)核樣本來自不同產(chǎn)地、不同批次，對照藥材樣本為中國食品藥品檢定研究院認(rèn)定，但其ITS2序列均可穩(wěn)定獲得，說明采用ITS2條形碼鑒定補(bǔ)骨脂及混偽品具有很好的穩(wěn)定性。補(bǔ)骨脂ITS2序列經(jīng)比對后，種內(nèi)未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)，K2P遺傳距離為0。補(bǔ)骨脂與其混偽品經(jīng)比對后，變異位點(diǎn)較多，種間K2P遺傳距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于補(bǔ)骨脂種內(nèi)距離。另外，從基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹也可以明顯區(qū)分補(bǔ)骨脂及其混偽品。說明應(yīng)用ITS2條形碼鑒定補(bǔ)骨脂及其混偽品具有很高的準(zhǔn)確性。本研究突破了傳統(tǒng)鑒定方法主要依靠主觀經(jīng)驗(yàn)的限制，直接從基因水平提供客觀鑒定依據(jù)，具有鑒定結(jié)果穩(wěn)定性高、準(zhǔn)確可靠、非專業(yè)人員也可以操作的優(yōu)勢，適用于補(bǔ)骨脂及其混偽品的鑒定。運(yùn)用DNA條形碼對補(bǔ)骨脂及其混偽品進(jìn)行有效鑒別，可以防止補(bǔ)骨脂混入無毒中藥材特別是需要長期服用的中藥材中，為保證中藥材的質(zhì)量安全和臨床療效，促進(jìn)中醫(yī)藥的健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。

致謝：感謝中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所、北京市藥品檢驗(yàn)所、湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院對部分樣品進(jìn)行復(fù)核！

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(2016-04-12收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Identification of Psoraleae Fructus and its adulterants using ITS2 sequence

Zhou Jianguo1，Ma Shuangjiao1，Huang Yulong2，Shi Linchun1，Jin Yue1，Yao Hui1

(1TheKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China; 2SchoolofPharmacy，HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China)

Objective:Psoraleae Fructus has toxic effects on liver and kidney and its adulterants including Datura stramonium，Hyoscyamus niger，D.metel，Crotalaria pallid are also tested to have toxic ingredients.Psoralea corylifolia shares similar morphological characters with its adulterants，which can easily lead to misuses and greatly threaten the human health.This study aimed to identify P.corylifolia and its adulterants rapidly and accurately using DNA barcoding method based on ITS2 sequence.Methods:Genomic DNA of P.corylifolia and its adulterants were extracted and then the ITS2 sequences were obtained by direct PCR amplification and sequenced bi-directionally.The intra-and inter-specific genetic distances were analyzed using software MEGA 6.0，and the phylogenetic tree was constructed by using the neighbor-joining(NJ)method.Results:The ITS2 sequence length of P.corylifolia was 233bp，and the G+C content was 69.5%.The intra-specific variations were highly conservative.There were many variation sites of ITS2 sequences between P.corylifolia and its adulterants.The results showed that the minimum inter-specific divergence was 0.5321，which was larger than the maximum intra-specific divergence.The NJ tree indicated that P.corylifolia could be distinguished from its adulterants obviously.Conclusion:The ITS2 region can be used as a barcode for identification of P.corylifolia，which provide a new technique for the authentication of germplasm resources and clinic safety of medicinal use.

Psoralea corylifolia L.; ITS2 sequence; Identification; DNA barcoding; Adulterants

重大新藥創(chuàng)制國家科技重大專項(xiàng)(編號：2014ZX09304307001)；國家科技支撐計(jì)劃(編號：2011BAI07B08)

周建國(1993—)，男，2015級在讀碩士研究生，E-mail：1312905813@qq.com

姚輝(1976—)，男，博士，研究員，主要研究方向：中藥資源學(xué)，電話：(010)57833194，E-mail：scauyaoh@sina.com

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.008