蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的提取及抗氧化活性

邵 穎,陳安徽,劉 輝,胡 模,趙士琛

(江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,徐州工程學(xué)院,江蘇徐州 221008)

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蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的提取及抗氧化活性

邵 穎,陳安徽*,劉 輝,胡 模,趙士琛

(江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,徐州工程學(xué)院,江蘇徐州 221008)

在比較蛹蟲草子實(shí)體類胡蘿卜素的溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酸熱提取法的基礎(chǔ)上,對(duì)蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,并分析了類胡蘿卜素的體外抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:酸熱提取法是幾種常見提取方法中類胡蘿卜素提取得率最高的一種方法;酸熱法最優(yōu)提取工藝為:鹽酸濃度為1 mol/L,鹽酸用量為20 mL/g,酸浸時(shí)間為30 min,熱處理時(shí)間為5 min,蛹蟲草中類胡蘿卜素的得率達(dá)到1387 μg/g。抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素具有較好的體外抗氧化活性,在0～10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)抗氧化能力隨著類胡蘿卜素濃度的提高而增加。4 mg/mL類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率達(dá)到96.57%,類胡蘿卜素對(duì)鐵離子螯合能力的EC50值為3.26 mg/mL,且還顯示出了較好的還原能力。

蛹蟲草,子實(shí)體,類胡蘿卜素,提取,抗氧化活性

類胡蘿卜素是一類分布廣泛的天然色素,其中β-胡蘿卜素是其中最常見的一種。β-胡蘿卜素是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)認(rèn)定的A類營(yíng)養(yǎng)食品強(qiáng)化劑,攝入機(jī)體后會(huì)轉(zhuǎn)化為維生素A且不會(huì)因?yàn)檫^(guò)量攝入而造成維生素A的累積中毒現(xiàn)象[1-2];醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素具有抑制腫瘤形成、抗輻射的作用,并對(duì)治療口腔潰瘍、胃潰瘍、夜盲癥等疾病以及提高免疫能力均具有顯著療效,故美國(guó)藥典、歐洲藥典和英國(guó)藥典均已將β-胡蘿卜素作為藥物正式收載[3-4]。現(xiàn)代流行病學(xué)研究表明,類胡蘿卜素具有抗炎、抗癌、抗氧化活性,能夠降低多種癌癥、代謝綜合征、肥胖、白內(nèi)障以及黃斑變性等疾病的發(fā)病率[5-6]。另有研究發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育,提高動(dòng)物繁殖能力和肌肉品質(zhì)[7]及預(yù)防花粉過(guò)敏癥及過(guò)敏性皮炎等方面具有良好效果[8]。目前,類胡蘿卜素的保健功效、藥用功能及著色性能已使其在保健品、藥品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[9]。

蛹蟲草是我國(guó)傳統(tǒng)的可媲美冬蟲夏草的藥食兩用真菌,具有擴(kuò)張氣管、鎮(zhèn)靜、抗炎、降壓、抗病、抗惡性腫瘤等多種藥理活性[10-11],其子實(shí)體呈現(xiàn)的橙黃色即為其中所含的類胡蘿卜素所致[12-13]。目前發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素大多為脂溶性物質(zhì),但是也有學(xué)者從蛹蟲草子實(shí)體中分離到了強(qiáng)水溶性類胡蘿卜素,且其含量占到蛹蟲草總類胡蘿卜素的86.7%[14]。常見的類胡蘿卜素提取方法主要有超臨界CO2萃取法、酶法、超聲波提取法、微波輔助提取法、有機(jī)溶劑提取法、高效液相色譜法等[15-16],但針對(duì)不同的提取原料提取方法會(huì)有差別。本研究對(duì)蛹蟲草中類胡蘿卜素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化并研究了其體外抗氧化活性,為蟲草源天然保健型色素的多領(lǐng)域應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草子實(shí)體 徐州工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室自行栽培。

丙酮 宜興市第二化學(xué)試劑廠;鹽酸 分析純,上海博河精密化學(xué)品有限公司;95%乙醇 宜興市第二化學(xué)試劑廠;1,1-二苯基-2-苦味肼基自由基(DPPH) 美國(guó)sigma公司;其它試劑如硫酸亞鐵、抗壞血酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DHG-9140 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;超聲-微波萃取儀 CW-2000 上海新拓微波溶樣科技有限公司;全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀Spectra Max M2 美國(guó)Molecular device公司;TGL-16G臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;UV2802PC紫外-可見光分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司;梅特勒電子天平 AE2000型 上海分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲草子實(shí)體的采收及粉碎 將成熟蛹蟲草子實(shí)體自栽種瓶中采收后直接置于40 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干,并用高速粉碎機(jī)粉碎過(guò)40目篩,蛹蟲草子實(shí)體粉存放于密封袋中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 類胡蘿卜素含量測(cè)定 參照王陶等[17]的方法并改進(jìn)。

將提取液適當(dāng)稀釋后,測(cè)定溶液453 nm處吸光度,按下式計(jì)算類胡蘿卜素含量:

類胡蘿卜素含量(μg/g)=(Amax×V×D)/(0.16×W)

式中:Amax-453 nm波長(zhǎng)處吸光值;V-提取溶劑的用量,mL;D-測(cè)定試樣稀釋倍數(shù);0.16-類胡蘿卜素克分子消光系數(shù);W-蛹蟲草樣品干質(zhì)量,g。

1.2.3 類胡蘿卜素的提取方法選擇

1.2.3.1 有機(jī)溶劑浸提法 準(zhǔn)確稱取1.000 g蛹蟲草粉末7份,每份分別各加20 mL丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、氯仿于室溫條件下避光震蕩60 min后于5000 r/min離心10 min,取上清液。上清液適當(dāng)稀釋測(cè)定稀釋液于453 nm處的吸光值并計(jì)算類胡蘿卜素的含量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3.2 微波輔助提取法 參照張志軍[18]的方法并改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取1.000 g蛹蟲草粉末加20 mL丙酮于微波功率200 W時(shí)處理3 min,然后于室溫條件下避光震蕩30 min后于5000 r/min離心10 min,取上清液。上清液適當(dāng)稀釋后測(cè)453 nm處吸光值并計(jì)算類胡蘿卜素的含量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3.3 酸熱處理提取法 準(zhǔn)確稱取1.000 g蛹蟲草粉末用10 mL濃度1 mol/L的鹽酸浸泡40 min,然后于沸水浴中處理4 min,迅速冷卻并于5000 r/min離心10 min,用蒸餾水洗滌沉淀2次,殘?jiān)?0 mL丙酮,室溫避光條件下震蕩30 min后于5000 r/min 條件下離心10 min,取上清液。上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后測(cè)定453 nm處吸光值并計(jì)算類胡蘿卜素的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次平行。

1.2.3.4 超聲波輔助提取法 參照張志軍[18]的方法并改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取1.000 g蛹蟲草粉末加20 mL丙酮浸提,超聲功率200 W,超聲處理30 min后于5000 r/min離心10 min,取上清液。上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后測(cè)定453 nm處的吸光值并計(jì)算類胡蘿卜素的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次平行。

1.2.4 類胡蘿卜素酸熱提取法的優(yōu)化

1.2.4.1 鹽酸濃度的選擇 準(zhǔn)確稱取1 g蛹蟲草粉末5份(每份設(shè)置3個(gè)重復(fù)),分別于10 mL濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L的鹽酸中浸提40 min,然后于沸水浴中處理4 min,迅速冷卻并于5000 r/min離心10 min,用蒸餾水洗滌沉淀2次,殘?jiān)?0 mL丙酮,室溫避光條件下震蕩30 min后于5000 r/min條件下離心10 min,取上清液,經(jīng)適當(dāng)稀釋后測(cè)定453 nm處吸光值并計(jì)算類胡蘿卜素的含量。

1.2.4.2 鹽酸用量的選擇 準(zhǔn)確稱取1 g蛹蟲草粉末5份(每份設(shè)置3個(gè)重復(fù)),分別用5、10、15、20、25 mL濃度為0.5 mol/L的鹽酸浸提40 min,然后于沸水浴中處理4 min,迅速冷卻并于5000 r/min離心10 min,用蒸餾水洗滌沉淀2次,殘?jiān)?0 mL丙酮,室溫避光條件下震蕩30 min后于5000 r/min條件下離心10 min,取上清液,經(jīng)適當(dāng)稀釋后測(cè)定453 nm處吸光值并計(jì)算類胡蘿卜素的含量。

1.2.4.3 鹽酸浸提時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱取1 g蛹蟲草粉末5份(每份設(shè)置3個(gè)重復(fù)),分別用15 mL濃度為0.5 mol/L的鹽酸分別浸提10、20、30、40、50 min,然后于沸水浴中處理4 min,迅速冷卻并于5000 r/min離心10 min,用蒸餾水洗滌沉淀2次,殘?jiān)?0 mL丙酮,室溫避光條件下震蕩30 min后于5000 r/min條件下離心10 min,取上清液,經(jīng)適當(dāng)稀釋后測(cè)定453 nm處吸光值并計(jì)算類胡蘿卜素的含量。

1.2.4.4 熱處理時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱取1 g蛹蟲草粉末5份(每份設(shè)置3個(gè)重復(fù)),分別用15 mL濃度為0.5 mol/L的鹽酸分別浸提30 min,然后于沸水浴中分別處理0、2、4、6、8 min,迅速冷卻并于5000 r/min離心10 min,用蒸餾水洗滌沉淀2次,殘?jiān)?0 mL丙酮,室溫避光條件下震蕩30 min后于5000 r/min條件下離心10 min,取上清液,經(jīng)適當(dāng)稀釋后測(cè)定453 nm處吸光值并計(jì)算類胡蘿卜素的含量。

1.2.4.5 酸熱提取法正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方案以確定最佳酸熱提取工藝。因素水平表見表1。

表1 酸熱法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

Table 1 The factors and levels of orthogonal test of heat acid method

水平因素A鹽酸濃度(mol/L)B鹽酸用量(mL)C酸浸時(shí)間(min)D熱處理時(shí)間(min)102510253205153043120355

1.2.5 類胡蘿卜素的抗氧化活性

表2 溶劑對(duì)類胡蘿卜素提取率的影響

Table 2 The effect of different solvent on extraction of carotenoids

有機(jī)溶劑丙酮甲醇乙醇乙醚石油醚乙酸乙酯氯仿類胡蘿卜素含量(μg/g)25017±103--13596±23716480±0747245±20922792±180

注:-表示未檢測(cè)到類胡蘿卜素。

表3 幾種常見提取方法的比較

Table 3 Comparison result of common extraction methods

提取方法有機(jī)溶劑法微波提取法酸熱提取法超聲波法色素含量(μg/g)24867±273c29024±681d128995±936a30328±405b

注:a、b、c、d表示四種提取方法在95%置信度下的顯著水平分析。1.2.5.1 DPPH自由基清除活性分析 參照Wu[19],將類胡蘿卜素稀釋至不同的質(zhì)量濃度,制備成樣品溶液。分別量取各樣品溶液樣液1.5 mL,加入1.5 mL含0.2 mmol/L DPPH的95%(v/v)乙醇,搖晃均勻,置于常溫,遮光處理30 min,再于波長(zhǎng)517 nm處檢測(cè)它的吸光度值。

清除率計(jì)算公式如下:

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中:Ac-為對(duì)照組吸光度,1.5 mL蒸餾水加1.5 mL含0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇;Ai-為樣品組吸光度,1.5 mL樣品液加1.5 mL含0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇;Aj-為空白組吸光度,1.5 mL樣品液加1.5 mL 95%乙醇。

1.2.5.2 鐵離子螯合能力的測(cè)定 參照武守華等的文獻(xiàn)[20]。量取2 mL各質(zhì)量濃度的樣液,加入0.1 mL 5 mmol/L的氯化亞鐵,然后再加入0.2 mL 5 mmol/L Ferrozine,混勻,然后在室溫下靜置10 min,然后加入相同體積的去離子水并在562 nm下檢測(cè)吸光度。以去離子水作空白調(diào)零。吸光值越低代表鰲合能力越好。去離子水為空白對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照是EDTA。

按如下公式計(jì)算各濃度樣液鐵離子的鰲合能力:

鐵離子鰲合能力(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式中:A0-空白對(duì)照的吸光度;A1-加有樣液或者EDTA后的吸光度。

1.2.5.3 還原力的測(cè)定 采用Oyaizu[21]的文獻(xiàn)中所提的方法。量取不同質(zhì)量濃度的樣液2 mL,加入2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.6),再加入2 mL 1%(w/w)的鐵氰化鉀溶液,震蕩,50 ℃水浴20 min后加入10%(w/w)的TCA溶液2 mL,混勻后以3000 r/min離心10 min。離心后,取2 mL的上清液,再加2 mL去離子水和0.4 mL 0.1%(w/w)的FeCl3溶液,震蕩,50 ℃熱水浴下保持溫度10 min,當(dāng)液體由黃變成藍(lán)時(shí),在700 nm下檢測(cè)其吸光度,則其還原能力隨其樣品吸光度變化?？瞻讓?duì)照用去離子水替代樣液,VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用DPS7.05版軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素提取溶劑的確定

選取7種有機(jī)溶劑按照1.2.3.1的方法提取蛹蟲草子實(shí)體中的類胡蘿卜素,結(jié)果如表2所示。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,供試的7種有機(jī)溶劑中,丙酮最有利于類胡蘿卜素的提取,其次是氯仿。類胡蘿卜素在不同極性的溶劑中溶解性能不同,所以使用不同的溶劑提取類胡蘿卜素其得率會(huì)不同。類胡蘿卜素為脂溶性成分,所以非極性溶劑的提取效果要優(yōu)于極性溶劑。雖有報(bào)道顯示蛹蟲草子實(shí)體中存在水溶性類胡蘿卜素,但在本實(shí)驗(yàn)條件下使用甲醇、乙醇等極性溶劑并未提取到類胡蘿卜素。所以,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇提取效果最優(yōu)的丙酮作為類胡蘿卜素的提取溶劑。

2.2 提取方法的選擇

以蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的提取率為指標(biāo),比較了幾種常見提取方法的提取效果以選擇較優(yōu)的提取方法。具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,酸熱提取法更有利于蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的提取,含量達(dá)到1289.95±9.36 μg/g,顯著高于其他三種供試方法(p<0.05)。酸熱法有效提取類胡蘿卜素的原因可能是鹽酸及沸水后的冷卻處理可有效破壞蛹蟲草的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),使得胞內(nèi)物質(zhì)得以溶出。超聲波和微波輔助提取方法雖然工藝簡(jiǎn)單并且可以節(jié)約提取時(shí)間,不會(huì)破壞提取物的活性,但其提取效率太低。所以本研究選擇酸熱法作為最優(yōu)提取方法。

2.3 酸熱提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1 鹽酸濃度的確定 按照1.2.4.1的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以考察鹽酸濃度對(duì)類胡蘿卜素提取的影響。具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)鹽酸濃度為0.5 mol/L時(shí),蛹蟲草中類胡蘿卜素的提取量達(dá)到1333.67±6.65μg/g,顯著高于其他濃度下的提取量。隨著鹽酸濃度的提高,類胡蘿卜素的提取量卻明顯下降。所以,本實(shí)驗(yàn)條件下選擇鹽酸的濃度為0.5 mol/L。

圖1 鹽酸濃度對(duì)類胡蘿卜素含量的影響Fig.1 Effect of concentration of hydrochloric acidon the content of carotenoids

2.3.1.2 鹽酸用量的確定 按照1.2.4.2的方法考察了鹽酸用量對(duì)類胡蘿卜素提取的影響。具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 鹽酸用量對(duì)類胡蘿卜素含量的影響Fig.2 Effect of volume of hydrochloric acidon the content of carotenoids

圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著鹽酸用量的增加蛹蟲草中類胡蘿卜素的提取量呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì),直至鹽酸的用量達(dá)到15 mL。隨后,類胡蘿卜素的提取量隨著鹽酸用量的增加而明顯下降。所以,鹽酸的最佳用量為15 mL。

2.3.1.3 鹽酸浸提時(shí)間的確定 在鹽酸濃度和用量確定的基礎(chǔ)上,考察了鹽酸浸提時(shí)間對(duì)蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素提取的影響。具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 鹽酸浸提時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素含量的影響Fig.3 Effect of immerse time of hydrochloric acidon the content of carotenoids

圖4 熱處理時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素提取的影響Fig.4 Effect of heat treatment timeon the content of carotenoids

由圖3可知,隨著鹽酸浸提時(shí)間的延長(zhǎng),蛹蟲草中類胡蘿卜素的提取量逐漸增加,但浸提時(shí)間超過(guò)30 min,類胡蘿卜素的提取量卻顯著降低?？赡苁且?yàn)轭惡}卜素自蛹蟲草子實(shí)體中被提取出來(lái)之后較長(zhǎng)時(shí)間地暴露于空氣中被氧化所致。所以本研究選擇鹽酸浸提的最優(yōu)時(shí)間為30 min。

2.3.1.4 熱處理時(shí)間的確定 按照1.2.4.4的方法考察了熱處理時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素提取的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

由圖4可知,蛹蟲草經(jīng)鹽酸浸提后,浸提液于沸水中處理時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響到類胡蘿卜素的提取效果。浸提液在沸水中處理4 min時(shí)提取出的類胡蘿卜素的含量最高,熱處理時(shí)間超過(guò)4 min提取率顯著降低。所以,最佳熱處理時(shí)間為4 min。

2.3.2 酸熱提取法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)酸熱提取法進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化類胡蘿卜素的最佳提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 4 Result of orthogonal test

實(shí)驗(yàn)號(hào)A鹽酸濃度(mol/L)B鹽酸用量(mL)C酸浸時(shí)間(min)D熱處理時(shí)間(min)色素含量(μg/g)11111957212221135313331283421231251522311176623121214731321198832131365933211322Ⅰ/31125000113533311786671151667Ⅱ/31213667122533312360001182333Ⅲ/31295000127300012190001299667R17000013766757333148000

由表4可知:影響酸熱法提取結(jié)果的主次因素為A>D>B>C,即鹽酸濃度>熱處理時(shí)間>鹽酸用量>酸浸時(shí)間;最優(yōu)條件組合為A3B3C2D3,即鹽酸濃度1 mol/L、鹽酸用量20 mL/g、酸浸時(shí)間30 min、熱處理時(shí)間5 min,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素提取量為1387μg/g,高于正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3.3 蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的抗氧化活性

2.3.3.1 DPPH自由基清除活性 蛹蟲草子實(shí)體中提取的類胡蘿卜素的DPPH自由基清除活性如圖5所示。

圖5 蛹蟲草中類胡蘿卜素對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of carotenoids from Cordyceps Militarieson DPPH scavenging rate

由圖5可知,蛹蟲草子實(shí)體中提取出的類胡蘿卜素對(duì)DPPH自由基具有明顯的清除活性。在一定的濃度范圍內(nèi),DPPH自由基清除活性隨著類胡蘿卜素濃度的提高而增強(qiáng),當(dāng)類胡蘿卜素濃度為4 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到96.57%。隨后,自由基清除率卻隨著樣品濃度的提高而呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。

2.3.3.2 鐵離子螯合能力 鐵離子螯合能力是抗氧化活性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的鐵離子螯合能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素對(duì)鐵離子的螯合作用Fig.6 Chelating ability of carotenoids on iron ions

由圖6可知,鐵離子螯合能力隨著樣品濃度的增加而增加。當(dāng)類胡蘿卜素濃度為4 mg/mL時(shí),鐵離子螯合率已達(dá)到69.25%,隨后螯合率隨著樣品濃度的增加呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),蛹蟲草中提取出的類胡蘿卜素對(duì)鐵離子螯合能力的EC50值為3.26 mg/mL。說(shuō)明蛹蟲草中類胡蘿卜素具有較好的鐵離子螯合能力,但低于陽(yáng)性對(duì)照EDTA對(duì)鐵離子的螯合效果。

2.3.3.3 還原力 還原力是一個(gè)表明化合物潛在抗氧化活性的重要指標(biāo)。還原力越強(qiáng),抗氧化活性越強(qiáng)。

由圖7可以看出,在測(cè)定的樣品質(zhì)量濃度范圍內(nèi),蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的還原能力隨著樣品濃度的增加而增加。當(dāng)類胡蘿卜素濃度為10 mg/mL,吸光度達(dá)到0.4712,且還原力曲線還呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì),說(shuō)明類胡蘿卜素具有一定的還原能力。但效果明顯沒(méi)有陽(yáng)性對(duì)照VC好。

圖7 蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的還原力Fig.7 Reducing power of carotenoidsfrom the fruiting body of Cordyceps Militaries

3 結(jié)論與討論

研究了蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的提取工藝。通過(guò)比較幾種常見的類胡蘿卜素的提取方法對(duì)蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的提取效果,發(fā)現(xiàn)酸熱法顯著優(yōu)于其他提取方法。采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了酸熱法提取工藝,其最佳提取條件為:每g蛹蟲草添加濃度為1 mol/L鹽酸20 mL浸提30 min后于沸水中熱處理5 min,浸提液迅速冷卻后于5000 r/min條件下離心10 min取殘?jiān)?殘?jiān)褂谜麴s水洗滌2次后添加20 mL丙酮,室溫避光條件下震蕩30 min后于5000 r/min條件下離心10 min。在此提取工藝下,蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素提取量達(dá)到1387 μg/g。同樣采用酸熱法對(duì)蛹蟲草子實(shí)體中的類胡蘿卜素進(jìn)行提取,陳銀岳[22]等人提取的類胡蘿卜素的平均得率僅為986.05 μg/g,而張志軍[18]等人的提取得率卻高達(dá)2158 μg/g,本研究條件下的類胡蘿卜素得率介于二者之間。分析其中的原因可能是由于蛹蟲草自身種質(zhì)的差別,子實(shí)體中自身含有的類胡蘿卜素含量間的差別造成的,因?yàn)椴煌瑏?lái)源、不同種的蛹蟲草中含有的活性成分的種類及含量之間會(huì)存在一定的差異。值得對(duì)不同區(qū)域范圍、不同種質(zhì)資源、不同培養(yǎng)條件下的人工子實(shí)體、野生蛹蟲草子實(shí)體中的類胡蘿卜素含量進(jìn)行系統(tǒng)分析。

以DPPH自由基清除能力、鐵離子螯合能力及還原能力為指標(biāo)對(duì)蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素進(jìn)行了體外抗氧化活性檢測(cè)。蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素在特定的濃度范圍內(nèi)其抗氧化能力隨其濃度的提高而增加。當(dāng)類胡蘿卜素濃度為4 mg/mL時(shí),對(duì)濃度為0.2 mmol/L DPPH的清除率達(dá)到96.57%,類胡蘿卜素對(duì)鐵離子螯合能力的EC50值為3.26 mg/mL,且本實(shí)驗(yàn)條件提取的蛹蟲草源類胡蘿卜素還顯示了較好的還原能力。

本研究從蛹蟲草子實(shí)體中提取出的類胡蘿卜素是具有抗氧化活性的蟲草源色素,可以作為天然抗氧化型保健色素被廣泛應(yīng)用,具有巨大的應(yīng)用前景。

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Optimization of extraction process and antioxidant activity of carotenoids from fruiting body ofCordycepsMilitaris

SHAO Ying,CHEN An-hui*,LIU Hui,HU Mo,ZHAO Shi-chen

(Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221008,China)

OrthogonalexperimentwasusedtooptimizetheextractionprocessofcarotenoidsfromthefruitingbodyofCordyceps Militarisbasedonthecomparisonresultsofsolventextractionmethod,ultrasonicassistedextractionmethod,microwaveassistedextractionmethodandacidheatextractionmethod,andtheantioxidantactivityofcarotenoidswasalsodetected.Theexperimentresultsshowedthattheacidthermalmethodwasbetterthanotherextractionmethods,andtheoptimalextractingconditionsofacidthermalmethodwere:theconcentrationofhydrochloricacidof1mol/mL,theusageofhydrochloricacidof20mLpergramfruitingbody,timeofdigestionof30min,timeofthermaltreatmentof5min.Theyieldofcarotenoidsreachedto1387μg/g.Anti-oxidationexperimentresultsshowedthatcarotenoidsfromfruitingbodyofCordyceps Militarishadbetterantioxidantabilityandtheabilitywasincreasedwithhigherconcentrations.Atconcentrationof4mg/mL,thecarotenoidscoulddecrease96.57%ofDPPHradicalsandvalueofEC50oftheChelatingabilityonironionswas3.26mg/mL.Inaddition,thecarotenoidsofCordyceps Militarisalsorevealedbetterreducingcapacity.

Cordyceps Militaris;fruitingbody;carotenoids;extraction;antioxidantactivity

2016-03-01

邵穎(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：微生物資源的開發(fā)與應(yīng)用，E-mail：shyzhbo2005@126.com。

*通訊作者:陳安徽(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)，E-mail:chenah201@163.com。

江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目(BN2015012)；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大專項(xiàng)(15KJA180008)聯(lián)合資助。

TS202.3

B

1002-0306(2016)19-0221-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.035