干巴菌廢棄料酶水解優(yōu)化條件及黃酮、多糖含量的研究

劉品華，林 慧，劉明研，余麗訪，楊 芬 *

(1.曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011；2.廣西百色農(nóng)業(yè)學(xué)校，廣西 百色 533000)

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干巴菌廢棄料酶水解優(yōu)化條件及黃酮、多糖含量的研究

劉品華1，林 慧1，劉明研2，余麗訪1，楊 芬1 *

(1.曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011；2.廣西百色農(nóng)業(yè)學(xué)校，廣西 百色 533000)

測得野生干巴菌廢棄料(干固形物)中總氨基酸態(tài)氮為0.376 g/100g、總黃酮為6.158 mg/g、多糖為1.587 g/100g。研究了用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶水解的優(yōu)化條件及總黃酮、多糖的變化。結(jié)果表明，鮮干巴菌︰水=1︰4的條件下，酶水解最佳條件為：木瓜蛋白酶(≥800 U/mg)≥0.75 g/100 mL、時間7 h、pH值6.5、溫度65 ℃，干固形物中總氨基酸態(tài)氮為0.933 g/100 g，總黃酮3.868 mg/g，多糖1.792 g/100 g；菠蘿蛋白酶(300 U/mg)1 %～1.25 %、時間7 h、pH5、 溫度35 ℃，干固形物中總氨基酸態(tài)氮為0.772 g/100g，總黃酮4.968 mg/g，多糖2.192 g/100 g。木瓜蛋白酶表現(xiàn)了較好的水解效果。

干巴菌；酶水解；氨基酸態(tài)氮；黃酮；多糖

野生干巴菌(ThelephoraganbajunZang) 主要生長于亞熱帶云南松林或針闊混交林下，是一種狹域性分布的可食高等真菌，同其它食用菌相比，干巴菌不僅具備獨(dú)特、濃郁的鮮香味，也含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素、維生素等，具有很高的營養(yǎng)保健價值[1]。干巴菌在云南省主要分布在昆明、呈貢、嵩明、安寧、楚雄、易門、保山、曲靖、馬龍等州市(縣) ，其分布區(qū)大約在北緯22°～27°，東經(jīng)99°～106°，集中在海拔1000～2200 m的松林中，調(diào)查資料表明，云南省干巴菌年產(chǎn)量超過10 000 t[2-3]。干巴菌為云南特有珍稀野生菌[4]，由于生長環(huán)境和菌體特性，在菌體下部夾帶沙土等雜質(zhì)，清理后有約1/4的量被廢棄。通過酶水解工藝可有效的去除菌體中的雜質(zhì)，保留原有的營養(yǎng)成分和香味，使原來蛋白質(zhì)的功能特性發(fā)生很大變化，對水解工藝進(jìn)行優(yōu)化和控制具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義[5]。為此筆者對廢棄的干巴菌部分進(jìn)行了蛋白酶水解、黃酮、粗多糖的研究，旨在充分利用珍稀資源，為綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮干巴菌的廢棄部分(由云南曲靖馬龍金發(fā)酒樓提供)；木瓜蛋白酶(≥800 U/mg，BR，for laboratory use only，not for drug or other uses)；菠蘿蛋白酶(30萬U/g，食品添加劑，南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司)；蘆丁(中國藥品生物制品檢定所)；葡萄糖(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；硫酸(重慶川東化工有限公司)；苯酚(天津市化學(xué)試劑三廠)；亞硝酸鈉(北京紅星化工廠)；硝酸鋁(上海三浦化工有限公司)；無水乙醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、甲醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；氫氧化鈉(天津市化學(xué)試劑三廠)，試劑均為分析純。

1.2 儀器

pH儀(PP-20-P11，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；超級恒溫水浴(HH-501，常州國華電器有限公司)；紫外可見分光光度計(TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；組織搗碎均漿機(jī)(JJ-2 型，常州市頂新實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；電子分析天秤(AL204-IC，梅特勒-托利多儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100 ，上海愛朗儀器有限公司)；磁力加熱攪拌器(78-1型，上海南匯電訊器材廠)；AS-3120型超聲波機(jī)(Autoscience)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理 按鮮干巴菌的廢棄料部分1份，水4份的比例放入組織搗碎均漿機(jī)搗碎，得預(yù)處理待用液。

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計 預(yù)處理待用液400 mL。酶用量、pH值、溫度因素參考通用的使用范圍設(shè)定。

表1 木瓜蛋白酶水解正交實(shí)驗(yàn)

時間考慮到酶活性與時間的關(guān)系，最大設(shè)置到8 h。本實(shí)驗(yàn)采用L16(44)正交設(shè)計方案，試驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計 在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上為測定酶含量的影響，考察了酶的用量與水解的關(guān)系。木瓜蛋白酶的試驗(yàn)量為0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750 g/100mL，菠蘿蛋白酶的試驗(yàn)量為0.250、0.500、0.750、1.000、1.250、1.500 g/100mL，試驗(yàn)結(jié)果見圖1～2。

1.3.4 總氨基酸態(tài)氮的測定 分別取預(yù)處理待用液、木瓜蛋白酶水解液、菠蘿蛋白酶水解液，壓濾過80目濾網(wǎng)得檢測濾液。于200 mL燒杯中取80.0 g檢測濾液，置于電磁攪拌機(jī)上，待攪拌穩(wěn)定后把校準(zhǔn)的酸度計的復(fù)合電極放入燒杯的適合位置，用0.0464 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定至pH值8.2，準(zhǔn)確加入10.00 mL甲醛，再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定至pH值9.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積(mL)，同時做空白實(shí)驗(yàn)。計算公式：

其中，X為樣品干粉中總氨基酸態(tài)氮的含量，g/100g；V1為測定樣品加入甲醛后滴定至終點(diǎn)(pH值9.2)所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為空白實(shí)驗(yàn)加入甲醛后滴定至終點(diǎn)(pH值9.2)所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；0.1757為每1.0000g鮮干巴菌廢棄料中干固形物含量。

1.3.5 總黃酮的測定 精確稱取免烘干的蘆丁對照品0.0168g，置50mL容量瓶中，加50 %甲醇適量，振搖溶解，并稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.3360mg/mL蘆丁溶液。精確量取上述對照品溶液0.00、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80、2.10、2.40mL。分別置于10mL容量瓶中，加入無水甲醇3mL，5 %的亞硝酸鈉溶液0.60mL，搖勻，放置6min，加10 %的硝酸鋁溶液0.60mL，搖勻，放置6min，再加入8.6 %氫氧化鈉3mL，用50 %甲醇定容至刻度，在508.00nm波長處測定，以蘆丁對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得出線性回歸方程：y=1.0171x+0.0024，R2=0.9989。

圖1 木瓜蛋白酶水解干巴菌Fig.1 Papain hydrolyzed Sparassia Thelephora ganbajun

取預(yù)處理待用液、木瓜蛋白酶水解液、菠蘿蛋白酶水解液，以105 ℃烘干，恒重后粉碎，分別取粉末樣品1.0000g，于50mL容量瓶中，加入50 %的甲醇(約35mL)，在40 ℃水溫中超聲波萃取1.5h，冷卻定容，靜置過夜。然后過濾，前10mL濾液棄之，之后的濾液待測總黃酮含量。精確量取待測總黃酮濾液2.00mL置10mL容量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻作為空白對照樣。另精確量取濾液2.00mL置10mL容量瓶中，照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線建立中的顯色方法依次加入顯色劑，依法測定吸光度，計算總黃酮含量。

1.3.6 粗多糖的測定 參照NY/T1676《食用菌中粗多糖含量的測定》方法檢測。葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，490nm測吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=10.5248x+0.0 838，R2=0.9991。取預(yù)處理待用液、木瓜蛋白酶水解液、菠蘿蛋白酶水解液，以105 ℃烘干，恒重后粉碎取樣檢測，計算粗多糖含量。

1.3.7 香氣評價 評價樣品編號后，倒入50mL燒杯中，通過靜置狀態(tài)和搖動狀態(tài)，經(jīng)10人的嗅覺感官按照表3設(shè)計進(jìn)行評價。評價表述采用味最濃為10，味最淡為0的累加統(tǒng)計比較方法。

1.3.8 干固形物含量的測定 干巴菌廢棄料均勻后，用扁形稱量瓶，按照GB/T5009.3中直接干燥法進(jìn)行測定。

圖2 菠蘿蛋白酶水解干巴菌Fig.2 Bromelain hydrolyzed Sparassia Thelephora ganbajun

2 結(jié)果與分析

2.1 酶水解試驗(yàn)

木瓜蛋白酶水解溫度超過70 ℃后才開始下降，具有耐高溫的特性，最適反應(yīng)溫度約為65 ℃，在pH值6.8～7.6活性較高[6-8]。由表1可以看出，溫度對酶水解有顯著影響，酶的用量影響最小。正交結(jié)果優(yōu)化方案為水解溫度65 ℃、pH值6.0、時間7h、木瓜蛋白酶用量為正交設(shè)計最大值0.5g/400mL(水解液中酶含量約為1000U/g)，水解測得總氨基酸態(tài)氮含量為0.791g/100g。

pH值5.5時，菠蘿蛋白酶活力保留率達(dá)最高，液體菠蘿蛋白酶的活力隨溫度的升高而顯著下降[9]。由表2可以看出,菠蘿蛋白酶水解時溫度有較大的影響，酶的用量和時間因素影響次之，酸度因素影響最小。正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案是溫度35 ℃，菠蘿蛋白酶用量為正交設(shè)計的最大值1.2g(水解液中酶含量約為900U/g)，時間7h，pH值6.0，水解測得總氨基酸態(tài)氮含量為0.700g/100g。

從圖1可知,木瓜蛋白酶的含量在0.75g/100mL內(nèi)隨著酶含量的增加水解效率也隨之上升，酶含量為0.75g/100mL時測得氨基酸態(tài)氮為0.933g/100g。

從圖2可知,菠蘿蛋白酶用量達(dá)到1g/100mL以后水解效率提高不明顯，最佳菠蘿蛋白酶用量應(yīng)為1～1.25g/100mL，測得氨基酸態(tài)氮為0.772g/100g。

從表3可看出，對水解前后的干巴菌氣味評價基本沒有明顯變化。由此得出最佳水解條件為：木瓜蛋白酶(≥800 U/mg)≥0.75 g/100mL、時間7 h、pH值6.5、溫度65 ℃；菠蘿蛋白酶(300 U/mg)1～1.25 g/100mL、時間7 h、pH 5、 溫度35 ℃。

表2 菠蘿蛋白酶水解正交實(shí)驗(yàn)

表3 氣味感官評價

2.2 總黃酮的檢測

黃酮類化合物泛指2個具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物，廣泛存在于果蔬中，無毒副作用，有顯著的清除人體內(nèi)自由基、抗老化、抗突變、調(diào)血脂、降血壓等藥理保健功能[10-11]，在防癌和抑制脂肪酶等方面也有明顯效果[12]。近年研究表明，蘆丁及其衍生物具有抗氧化活性和廣泛藥理活性[13]，及抗痙攣、抗癌、抗血小板、抗病毒作用[14]。黃酮類化合物是重要的具有開發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑。從標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得出未水解干巴菌、木瓜蛋白酶水解干巴菌、菠蘿蛋白酶水解干巴菌中總黃酮相當(dāng)于蘆丁的含量6.158、3.868、4.968 mg/g。

2.3 粗多糖的檢測

多糖是自然界中含量最豐富的生物聚合物，幾乎存在于所有的生物中，是構(gòu)成生命活動的四大基本物質(zhì)之一。有研究表明植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等多種重要生理活性。國內(nèi)外近年來對于植物多糖的抗氧化作用進(jìn)行了廣泛的研究[15-16]。從標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得出未水解干巴菌、木瓜蛋白酶水解干巴菌、菠蘿蛋白酶水解干巴菌中粗多糖含量為1.587、1.792、2.192 g/100g。

2.4 干固形物檢測

測得鮮干巴菌廢棄料固形物含量為17.57 %，其余為水分及揮發(fā)性成分。

3 討 論

(1)干巴菌干固形物中氨基酸態(tài)氮、總黃酮、粗多糖含量分別為0.376、6.158、1.587 g/100g。

(2)木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶能較好的通過水解提高干巴菌水解液中氨基酸態(tài)氮的含量，木瓜蛋白酶的水解效果優(yōu)于菠蘿蛋白酶。最佳水解條件：木瓜蛋白酶用量≥0.75 g/100mL、溫度65 ℃、pH值6.0、時間7 h，水解后干固形物總氨基酸態(tài)氮含量為0.933 g/100g；菠蘿蛋白酶用量1.00～1.25 g/100mL、溫度35 ℃、pH值6.0、時間7 h，水解后干固形物總氨基酸態(tài)氮含量為0.772 g/100g。

(3)木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶水解后，總黃酮分別下降2.290、1.190 mg/g，粗多糖含量分別提高0.205、0.605 g/100g。

(4)通過水解工藝可除去含在干巴菌中的雜質(zhì)，得到富含氨基酸、黃酮、粗多糖的水解液，在提高營養(yǎng)成分的前提下保持原有的香氣特征不變。試驗(yàn)證明珍稀干巴菌1/4的廢棄料可以通過水解得到充分利用。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Enzymatic Hydrolysis of Waste Materials fromSparassiaThelephoraGanbajunand Content of Flavonoids/ Polysaccharides

LIU Pin-hua1, LIN Hui1, LIU Ming-yan2, YU Li-fang1, YANG Fen1 *

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Qujing Normal University, Yunnan Qujing 655011, China; 2. Guangxi Baise Agriculture School, Guangxi Baise 533000, China)

The contents of amino acid nitrogen, flavonoids, and polysaccharides of waste materials from wildSparassiaThelephoraganbajun(dry substance) were 0.376 g/100g, 6.158 mg/g, and 1.587 g/100g, respectively. The optimized conditions of enzymatic hydrolysis of the waste materials were studied by papain and bromelain through detection indicator of amino acid nitrogen, then the contents of flavonoids and polysaccharides were researched before and after hydrolysis. The optimal condition of enzymatic hydrolysis was determined as follows: papain (≥ 800 U/mg) ≥0.75 g/100mL, hydrolysis time: 7 h, pH value=6.5, hydrolysis temperature: 65oC. Under the condition, the contents of amino acid nitrogen, flavonoids and polysaccharides in dry substance were 0.933 g/100g, 3.868 mg/g and 1.792 g/100g. Bromelain (300 U/mg) 1 %-1.25 %, hydrolysis time: 7 h, pH value =5, hydrolysis temperature: 35oC. The contents of amino acid nitrogen, flavonoids and polysaccharides were 0.772 g/100g, 4.968 mg/g, and 2.192 g/100g. Papain exhibits better in the enzymatic hydrolys.

SparassiaThelephoraganbajun; Enzymatic hydrolysis; Amino acid nitrogen; Flavonoids; Polysaccharides

1001-4829(2016)08-1949-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.017

2014-11-27

上海師范大學(xué)資源化學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；曲靖師范學(xué)院資源與環(huán)境化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(SYS2010BX01)

劉品華(1963-)，男，教授，從事食品化學(xué)、分析方面的研究工作，E-mail:406051584@qq.com，*為通訊作者，E-mail:yangfen6688@163.com。

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