一步法多重RT-PCR檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒方法的建立和應(yīng)用

于新友，李天芝，沈志強，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

一步法多重RT-PCR檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒方法的建立和應(yīng)用

于新友1，李天芝1，沈志強1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

根椐GenBank中登錄的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬A群輪狀病毒（PARV）基因序列，分別設(shè)計3對引物，在建立各病毒單項一步法RT-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化多重RT-PCR反應(yīng)條件，建立了3種病毒的一步法多重RT-PCR檢測方法，用這3對引物對同一樣品中的PEDV、TGEV和PARV核酸模板進行多重RT-PCR擴增，結(jié)果可同時擴增PEDV的450 bp、TGEV的609 bp、PARV的241 bp特異性片段，而對其它4種病原的擴增結(jié)果均為陰性。敏感性測定結(jié)果表明，該多重RT-PCR技術(shù)能檢出10 pg的PEDV、10 pg的TGEV和1 pg的PARV模板。用67份臨床病料對建立的多重RT-PCR技術(shù)和單項RT-PCR技術(shù)進行對比驗證，結(jié)果顯示，兩者的總符合率為100%。表明建立的一步法多重RT-PCR檢測方法，具有特異、快速、準(zhǔn)確的特點，可用于這3種病毒的同時檢測和鑒別診斷。

豬流行性腹瀉病毒；豬傳染性胃腸炎病毒；豬A群輪狀病毒；一步法多重RT-PCR

腹瀉是當(dāng)前威脅養(yǎng)豬業(yè)的一類重要疾病，導(dǎo)致豬腹瀉的原因很多，包括營養(yǎng)性腹瀉、細(xì)菌性腹瀉、病毒性腹瀉和寄生蟲等因素。其中，病毒性因素是非常重要的一種因素，且發(fā)生與流行在近年呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]，引起豬腹瀉主要病毒有豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、豬A群輪狀病毒（PorcinegroupArotavirus,PARV）[3-4]，這3種病毒所致的腹瀉病情相似，在臨床癥狀、流行病學(xué)和病理變化上無明顯差異[5]。各日齡豬均可感染發(fā)病，多發(fā)生于晚秋至早春的寒冷季節(jié)，也可發(fā)生于其它季節(jié)，臨床表現(xiàn)主要為厭食、嘔吐、水樣腹瀉，仔豬死亡率高，肥育豬掉膘，飼料報酬降低。這3種病毒有時呈混合感染[6]，使病情加重[7]。針對這3種病毒傳統(tǒng)檢測方法耗時長、檢測敏感性較低及準(zhǔn)確性差。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種檢測技術(shù)，即具有常規(guī)PCR測快度、靈敏度高、特異性好等特點，又能檢測和鑒別多種病原，可節(jié)約大量的時間、人力和物力[8]，適合大量臨床樣品（特別是混合感染樣品）中病原體的快速診斷。筆者根據(jù)PEDV、TGEV和PARV相關(guān)保守基因序列設(shè)計引物，優(yōu)化了反應(yīng)條件，建立一種可用于上述3種病毒的一步法多重RT-PCR診斷方法，可用于臨床病料進行檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬A群輪狀病毒（PARV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬捷申病毒（PTV）由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動物生物技術(shù)重點開放實驗室保存，臨床疑似病料為2015年2—11月采自山東、安徽、河南和江蘇各地豬場豬腸道、腸道內(nèi)容物等。

1.2 工具酶及試劑盒

DL 2 000 Marker、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2等購自寶生物工程（大連）有限公司，多功能DNA純化回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司產(chǎn)品，AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司，其它化學(xué)試劑如異丙醇、乙醇等，均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 引物的設(shè)計與合成

參考GenBank中登錄的PEDV（JN601060）、TGEV（JX827605）和PARV（DQ786577）基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計3對特異性引物（表1），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用滅菌水溶解并配成15 pmol/mL溶液備用。

表1 PEDV、TGEV和PARV基因擴增引物

1.4 病毒RNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書分別提取PEDV、TGEV、PARV的RNA，并提取其它幾種病毒的核酸。

1.5 一步法RT-PCR擴增及條件優(yōu)化

參照一步法RT-PCR試劑盒操作說明，RT-PCR反應(yīng)體系，即PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2 μL，2×stepbuffer 25 μL，上、下游引物各1 μL，RNA模板10 μL，加ddH2O至50 μL。各參數(shù)為50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95℃預(yù)變性2 min，然后進入95℃30 s、52℃30 s、72℃40 s循環(huán)，共40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取5 μL產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。同時對各擴增條件進行優(yōu)化，包括退火溫度（40～60℃梯度溫度，每2℃為1個梯度）和引物濃度（0.2～1.2 μmol/L，每0.2 μmol/L為1個梯度）。

1.6 特異性試驗

用已建立的多重RT-PCR擴增，分別對PEDV、TGEV、PARV、CSFV、PRRSV、JEV和PTV的RNA模板進行擴增，擴增反應(yīng)同時設(shè)雙蒸水陰性對照，擴增反應(yīng)結(jié)束后進行凝膠電泳檢測，以檢驗多重RT-PCR的特異性。

1.7 多重RT-PCR的敏感性試驗

分別提取PEDV、TGEV和PARV的RNA，用儀器測定含量，并依次做10倍梯度稀釋，每個稀釋度取1 μL為模板，采用已優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)條件分別對上述不同稀釋度的RNA進行多重RT-PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后進行凝膠電泳檢測，以檢測建立的一步法多重RT-PCR的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗

用建立的多重PCR檢測方法分別對PEDV感染的8份陽性樣品，TGEV感染5份陽性樣品，PARV感染的3份陽性樣品及3份陰性樣品重復(fù)檢測3次，以驗證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品的檢測

對山東、安徽、河南和江蘇等省送檢的67份豬病料進行多重RT-PCR檢測，并對擴增產(chǎn)物進行測序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過對PEDV、TGEV、PARV 3種引物濃度及多重RT-PCR擴增溫度及時間和循環(huán)次數(shù)等的優(yōu)化，最后確定多重RT-PCR中最佳引物濃度分別為PEDV 0.4 pmol/μL、TGEV 0.6 pmol/μL、PARV 0.4 pmol/μL。多重RT-PCR的最佳反應(yīng)模式為：50℃30 min，95℃2 min，94℃30 s，52℃30 s，72℃40 s，40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

2.2 擴增產(chǎn)物的檢測

將PEDV、TGEV和PARV的核酸分別進行多重RT-PCR擴增，結(jié)果能擴增出與預(yù)期相符，PARV的241 bp，PEDV的450 bp，TGEV的609 bp的特異性片段，而對照擴增不出任何條帶，其擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。

圖1 單項RT-PCR擴增結(jié)果

2.3 特異性試驗

采用建立的多重RT-PCR方法對PEDV、TGEV、PARV、CSFV、PRRSV、JEV和PTV在相同的條件進行擴增。結(jié)果顯示，PEDV、TGEV和PARV的PCR產(chǎn)物的片段長度分別為450 bp、609 bp和241 bp，與預(yù)期大小一致，而CSFV、PRRSV、JEV和PTV均未擴增出片段，說明本研究建立的一步法多重RTPCR方法特異性強（圖2）。

圖2 一步法多重RT-PCR的特異性試驗

2.4 敏感性試驗

提取PEDV、TGEV、PARV基因組RNA，用儀器測定含量，然后做10倍梯度稀釋，每個稀釋度取1 μL，作為模板。結(jié)果顯示用10 pg的PEDV、10 pg的TGEV、1 pg的PARV可以擴增出特異性條帶（圖3），表明該多重RT-PCR敏感性強。

2.5 重復(fù)性試驗

經(jīng)3次重復(fù)操作，結(jié)果一致，表明本研究建立的一步法多重RT-PCR方法是穩(wěn)定可靠的。

圖3 一步法多重RT-PCR的敏感性試驗

2.6 臨床樣品的檢測

對67份在不同地區(qū)采集的疑似病料，用建立的多重RT-PCR和單項RT-PCR進行了檢測，兩者符合率達100%（表2），結(jié)果表明建立的多重PCR檢測體系的特異性和敏感性較好。

表2 被檢病料單項RT-PCR與多重RT-PCR檢測對比試驗結(jié)果

3 討論

豬病毒性腹瀉是目前困擾規(guī)模化豬場生產(chǎn)的主要疾病之一，對豬病毒性腹瀉進行快速、準(zhǔn)確地診斷是有效控制和消滅豬場病毒性腹瀉病前提，郭容利等[9]建立了一種同時檢測PEDV、TGEV和PARV的三重RT-PCR方法，并對其進行特異性與敏感性試驗，該法能檢測約50TCID50的混合病毒，能夠擴增出3條長度為750 bp（PEDV）、544 bp（TGEV）、275 bp（PARV）特異性片段，而其它病毒無特異性條帶。本試驗建立的多重RT-PCR檢測PEDV、TGEV和PARV方法與郭容利等的方法并不相同，具有操作簡單，減少了繁瑣的反轉(zhuǎn)錄加樣的過程，不需要單獨做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增一步完成，減少了反應(yīng)時間，使得檢測速度更快，避免了模板RNA的降解，提高了檢測的敏感性，更加方便、實用，適合基層獸醫(yī)工作者使用，優(yōu)化反應(yīng)條件后，PEDV、TGEV和PARV最佳引物濃度分別為0.4 pmol/μL、0.6 pmol/ μL和0.4 pmol/μL，最佳退火溫度為52℃。對PEDV、TGEV和PARV的擴增產(chǎn)物的片段長度分別為450 bp、609 bp和241 bp，通過電泳即可區(qū)分，該多重RT-PCR方法具有良好的特異性，對其它豬病毒的擴增結(jié)果均為陰性，對PEDV、TGEV和PARV的最低檢測量分別為10 pg、10 pg和1 pg。用本研究建立的方法對來自山東、安徽、河南和江蘇等省的67份病料進行檢測，同時進行單項RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，多重RT-PCR方法與單項RT-PCR檢測結(jié)果符合率為100%。PEDV陽性率為47.8%，TGEV陽性率為13.4%，PARV陽性率為7.5%，PEDV與TGEV混合感染2份，PEDV與PARV混合感染1份，二重混合感染率為4.5%，PEDV、TGEV與PARV三重混合感染陽性樣品1份，感染率為1.5%?？梢钥闯鯬EDV為豬場流行性腹瀉最主要的病原，與近年來PEDV在腹瀉病豬樣本中的陽性率為33.3%～84.4%相關(guān)文獻報道相一致[10]。也有一些研究指出豬病毒性腹瀉也能由豬嵴病毒和豬博卡病毒等新發(fā)現(xiàn)的病毒引起，但筆者以為這些病毒的致病機理尚不清楚，可能在豬腹瀉中起到了一定的作用，但并不起主要作用，是否具有單獨致病性還有待于進一步研究。該多重RT-PCR方法比單項RT-PCR檢測可節(jié)省70%的時間和2/3的試劑用量，減少了污染環(huán)境的機會，為豬腹瀉性病毒病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種簡單、快速的分子生物學(xué)診斷方法。

[1]何啟蓋.豬腹瀉病的鑒別診斷與防控措施[J].北方牧業(yè)，2014（9）：17.

[2]楊漢春.2013年豬病流行情況與2014年流行趨勢及防控對策[J].豬業(yè)科學(xué)，2014（2）：42-43.

[3]殷震，劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1997：681-690.

[4]于新友，李天芝，王金良，等.一步法RT-PCR快速檢測豬流行性腹瀉病毒[J].養(yǎng)豬，2014（5）：118-120.

[5]陳少華，謝三星.豬三大病毒性腹瀉區(qū)別診斷問題[J].中國動物檢疫，1995（3）：22-23.

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[9]郭容利，何孔旺，倪艷秀，等.PEDV、TGEV、PARV多重RTPCR檢測方法的建立及其應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29（5）：1065-1069.

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（編輯：郭玉翠）

Establishment and Application of One Step Multiplex RT-PCR Assay for Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus,Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus and Porcine Group A Rotavirus

YU Xinyou1,LI Tianzhi1,SHEN Zhiqiang1,2
(1.Shandong Lvdu Bio-Industry Co．,Ltd．,Binzhou 256600,China; 2.Animal Science and Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,China)

A multiplex RT-PCR was optimized to simultaneously detect three pathogens of Porcine epidemic diarrhea virus(PEDV),Porcine transmissible gastroenteritis virus(TGEV)and Porcine group A rotavirus(PARV)in this article.Three sets of specific primers were designed according to the sequences of PEDV,TGEV and PARV at the GenBank.By using three pairs of virus specific primers,three RT-PCR assay were established to amplify the conservative regions of the three viruses,respectively.Consequently,a multiplex RT-PCR method to detect the three viruses in one tube was developed.The multiplex RT-PCR system would amplify a 450 bp fragment for PEDV,a 609 bp for TGEV and a 241 bp for PARV simultaneously or separately in the samples,depending on its infection status.But not specific band amplified from other four pig pathogenic viruses.As little as 10 pg of PEDV, 10 pg of TGEV and 1 pg of PARV RNA were detected using gel electrophoresis in the multiplex PCR.To evaluate the multiplex PCR,67 clinical samples were comparatively detected.The data showed that the multiplex RTPCR method being 100%coincidence with the single RT-PCR,and it can be used for this three viruses detection and differential diagnosis.

Porcine epidemic diarrhea virus;Porcine transmissible gastroenteritis virus;Porcine group A rotavirus;one step multiplex RT-PCR

S858.28

A

1002-1957(2016)02-0105-04

2016-01-14

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-06-022-15）；山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2013CQ006）；山東省自然科學(xué)基金青年基金項目（ZR2014CQ010）

于新友（1983-），男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術(shù)研究.E-mail：yuxinyou_2006@126.com