豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

林躍華

（福建省漳州市農(nóng)業(yè)局漳州市動物疫病預(yù)防控制中心，福建漳州363000）

豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

林躍華

（福建省漳州市農(nóng)業(yè)局漳州市動物疫病預(yù)防控制中心，福建漳州363000）

從福建省某豬場發(fā)生以呼吸道病為主要特征的病死豬臟器中分離到1株可疑菌，通過細(xì)菌分離和純培養(yǎng)、涂片鏡檢、生化試驗、小鼠致死性試驗、藥敏試驗，并設(shè)計1對檢測豬多殺性巴氏桿菌的引物，對可疑菌做PCR檢測。結(jié)果表明，可疑菌對小鼠有致死毒力；PCR檢測結(jié)果與生化鑒定結(jié)果符合，可疑菌為豬多殺性巴氏桿菌；藥敏試驗檢測結(jié)果顯示，該菌對先鋒霉素Ⅴ、阿米卡星、氟哌酸、氯霉素和慶大霉素高度敏感。

多殺性巴氏桿菌；分離鑒定；PCR；藥敏試驗

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida,Pm）對多種動物均有致病性，屬于巴氏桿菌科，主要使動物發(fā)生傳染性肺炎或出血性敗血癥，感染豬后引起豬肺疫和豬傳染性萎縮性鼻炎，是誘發(fā)豬呼吸道病綜合征的重要致病因子之一，豬傳染性萎縮性鼻炎主要是由產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌或支氣管敗血波氏桿菌（主要是D型）引起的，而豬肺疫一般是由非產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌引起的。該菌正常存在于多種動物的口腔和咽部黏膜，當(dāng)動物處于應(yīng)激狀態(tài)和機體抵抗力下降時細(xì)菌大量繁殖并致病，發(fā)生內(nèi)源性感染[1]，可與豬偽狂犬病、豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病、豬喘氣病等發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染[2]。近年來，福建地區(qū)部分規(guī)模養(yǎng)殖場受多殺性巴氏桿菌與其他病毒和細(xì)菌混合感染和繼發(fā)感染的侵害呈逐年上升趨勢，為此，本次對福建地區(qū)的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了分離鑒定、PCR檢測及藥物敏感性等試驗，為該區(qū)域的豬群體感染多殺性巴氏桿菌病的治療和預(yù)防提供參考。

1 材料

1.1 病料來源及試驗時間、地點

2015年10月份，福建省某豬場的臨床患病小豬，以10%甘油生理鹽水浸潤棉簽采集鼻腔深部的分泌物，解剖病危小豬，采集肺臟、氣管和淋巴結(jié)做病原診斷。本次試驗的地點為福建省漳州市動物疫病預(yù)防控制中心，試驗時間為2015年10—11月。

1.2 試劑與試驗動物

化學(xué)藥品主要有：胰蛋白大豆瓊脂（TSA），革蘭氏染料，瑞氏染料，糖發(fā)酵管和藥敏試紙均購自杭州微生物試劑有限公司。

參照文獻(xiàn)[3-4]設(shè)計如下1對引物，該引物擴增片段為457 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。P1：5'-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3'；P2：5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3'。

Taq DNA聚合酶及PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa。

豬巴氏桿菌陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株（C48-1菌株）由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物檢疫實驗室保存并提供。

試驗健康雌性小鼠（體重20 g左右）20只，購自福建農(nóng)林大學(xué)。

2 方法

2.1 病原分離培養(yǎng)及純化

將采集的小豬鼻腔分泌物棉拭子及肺臟、氣管無菌條件下分別接種于胰蛋白大豆瓊脂平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察。挑取直徑1～2 mm，光滑、濕潤、透明的單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色和瑞氏染色，于37℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h。對革蘭氏染色為紅色的細(xì)小桿菌及瑞氏染色為兩極濃染的細(xì)菌為可疑菌落，對其傳代純化，進(jìn)一步做生化鑒定、PCR鑒定、小鼠致死試驗、藥敏試驗。

2.2 生化試驗

對純化好的可疑細(xì)菌進(jìn)行生化試驗：葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、吲哚、硝酸鹽、MR、VP，觀察結(jié)果。

2.3 PCR檢測

2.3.1 PCR模板用接種環(huán)挑取可疑菌落和豬巴氏桿菌陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株（C48-1菌株），分別懸浮于含50 μL無菌水的離心管中，100℃水煮5～10 min，然后迅速置于冰上冷卻5 min，10 000 r/min離心2 min，分別取上清液為PCR模板。

2.3.2 PCR反應(yīng)體系采用25 μL的反應(yīng)體系：10×Taq緩存液2.5 μL，25 mmol/L dNTPs 0.5 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，無菌水10 μL，模板10 μL。

2.3.3 PCR反應(yīng)條件95℃反應(yīng)5 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃40 s，進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，產(chǎn)物于8℃短時間保存。

2.3.4 PCR結(jié)果取反應(yīng)產(chǎn)物各10 μL，于含EB的10 g/L瓊脂糖凝膠中，90 V電泳30 min，然后在紫外線下觀察。

2.4 紙片擴散法藥敏試驗

對純化好的可疑細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性試驗，操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)參照杭州天和微生物試劑有限公司的操作方法與標(biāo)準(zhǔn)。藥敏紙片包括：氨芐青霉素、先鋒霉素Ⅴ、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、氟哌酸、四環(huán)素、妥布霉素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明。

2.5 小鼠致死性試驗

將可疑菌落接種于TSA平板培養(yǎng)24 h，純化檢驗合格后，用PBS液洗脫菌苔，并稀釋至1010CFU/mL，稀釋菌液超聲波破碎3次，每次10 s，破碎產(chǎn)物12 000 r/min，離心30 min，上清液依次通過0.45 μm和0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾，進(jìn)行平板計數(shù)。將上述小鼠隨機分為試驗組和對照組，每組5只，對試驗組每只小鼠分別腹腔注射0.5 mL稀釋菌液，同時對對照組每只小鼠腹腔注射0.5 mL生理鹽水，72 h內(nèi)觀察小鼠死亡情況，并解剖病死小鼠，觀察其病理變化，采集心、肺等病料組織涂片，分離細(xì)菌并鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌分離純化及染色鏡檢

經(jīng)培養(yǎng)18～24 h，胰蛋白大豆瓊脂平板上長出針尖大小、露珠狀、透明的菌落，革蘭氏染色鏡檢為紅色、兩極濃染的短小桿菌，多單個存在；瑞氏染色鏡檢為藍(lán)色、兩極明顯濃染的短小桿菌，見圖1。

3.2 生化試驗結(jié)果

純培養(yǎng)物能發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵麥芽糖、乳糖、鼠李糖；吲哚、硝酸鹽還原試驗為陽性；MR、VP試驗為陰性。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》的判定標(biāo)準(zhǔn)，分離的可疑菌落符合多殺性巴氏桿菌的生化特征。

3.3 PCR檢測結(jié)果

用引物P1、P2擴增時，分離的可疑菌落和Pm陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株（C48-1菌株）均有擴增出目的條帶，且大小基本一致，經(jīng)對分離的可疑菌落Pm陽性PCR產(chǎn)物回收測序，與NCBI上發(fā)布的序列對比，同源性為98.8%，結(jié)果見圖2。

圖2 PCR檢測結(jié)果

3.4 紙片擴散法藥敏試驗

紙片擴散法藥敏試驗結(jié)果見表1。藥物敏感試驗表明，該菌對先鋒霉素Ⅴ、阿米卡星、氟哌酸、氯霉素和慶大霉素高度敏感；對氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、紅霉素表現(xiàn)為中度敏感；對鏈霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明耐藥。

表1 藥敏試驗結(jié)果mm

3.5 動物試驗

小鼠致死試驗中試驗組5只小鼠72 h內(nèi)全部死亡，小鼠死亡時間大多在15～40 h內(nèi)，對照組小鼠沒有死亡。取死亡小鼠心、肺接種于TSA平皿，結(jié)果分離出純的經(jīng)鑒定與以上一致的細(xì)菌。

4 討論

本試驗從福建省某豬場18份疑似病料，通過分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗、動物致死試驗和PCR試驗等，共分離到1株豬多殺性巴氏桿菌。由于豬場感染率高于分離率，說明福建部分地區(qū)已感染豬多殺性巴氏桿菌，豬巴氏桿菌病作為養(yǎng)豬業(yè)重要呼吸道疾病之一，對福建地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)已構(gòu)成潛在威脅。目前，養(yǎng)殖場長期、大量使用抗生素進(jìn)行豬病防治，導(dǎo)致細(xì)菌的抗藥性強，往往引發(fā)混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致對細(xì)菌的分離培養(yǎng)難度加大，豬場的治療效果也越來越差，因此應(yīng)引起養(yǎng)豬業(yè)的高度重視。

本試驗在細(xì)菌純化和染色時，兩極濃染并不明顯，它的菌落和菌體形態(tài)特征與放線桿菌、溶血巴氏桿菌等細(xì)菌相似，都為革蘭氏陰性桿菌，因此采用常規(guī)的染色和生化試驗進(jìn)行鑒定，難度較大。本文根據(jù)文獻(xiàn)合成1對PCR引物，通過PCR鑒定技術(shù)和生化等試驗，提高了分離鑒定豬多殺性巴氏桿菌的準(zhǔn)確度，適合應(yīng)用于該菌的流行性病學(xué)調(diào)查。

動物試驗中，從試驗結(jié)果看，可疑菌落培養(yǎng)物腹腔注射感染小鼠均在15～40 h內(nèi)死亡，通過采集死亡小鼠臟器，再次進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定試驗，結(jié)果與本次試驗結(jié)果相同，說明本次分離的豬巴氏桿菌具有較強的感染率。

從藥敏試驗結(jié)果看，巴氏桿菌僅對先鋒霉素Ⅴ、阿米卡星、氟哌酸、氯霉素和慶大霉素高度敏感，與文獻(xiàn)[5-6]的報道有一定區(qū)別。由于該菌容易產(chǎn)生耐藥性，且不同時間、不同地區(qū)、不同群體分離到該菌對藥物的敏感性可能存在一定差異，而且現(xiàn)在大部分發(fā)病豬都普遍存在混合感染和多重感染，因此建議應(yīng)先通過藥敏試驗選擇敏感藥物進(jìn)行治療，達(dá)到較好的治療效果，避免因亂投藥而產(chǎn)生較強耐藥性，形成豬場難治的頑固癥。

本試驗設(shè)計的PCR引物，可直接從第1代培養(yǎng)皿上可疑菌做PCR檢查，無需提細(xì)菌的基因組，最小檢查豬巴氏桿菌病原CFU為103/mL，檢測結(jié)果若為陽性，一般可分離出Pm，若為陰性則反之，耗時只需幾小時，與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)及鑒定相比，PCR檢測大幅提升了該病的診斷速度，避免了費時、費力、漏檢、錯檢等缺陷問題，顯示了PCR技術(shù)對疾病的早期診斷、及時防治，對減少經(jīng)濟損失具有重要的意義。

[1]唐先春，吳斌，索緒峰，等.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2005，36（6）：590-595.

[2]徐引弟，王治方，朱文豪，等.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗[J].中國獸藥雜志，2011，45（5）：5-7.

[3]Townsend K M,Frost A J,Lee C W,et al.Development of PCR assays for species and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates[J].J Clin Microbiol,1998,36(4): 1096-1100.

[4]Davies R L,Mac Corquodale R,Baillie S,et al.Characterization and comparison of Pasteurella multocida strains associated with porcine pneumonia and atrophic rhinitis[J].Journal of Microbiology,2003,52:59-67.

[5]邢明偉，曾祥偉，王希彪.豬多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定[J].養(yǎng)豬，2010（2）：63-64.

[6]彭苗苗，傅勝才.豬多殺性巴氏桿菌的鑒定方法和耐藥性的研究進(jìn)展[J].河南畜牧獸醫(yī)，2015（5）：8-10.

（編輯：郭玉翠）

低脂減肥法更有利健康

【英國《每日郵報》網(wǎng)站8月13日報道】題：低碳水化合物食品最有利于減輕體重，但低脂食品更有利于健康

減少碳水化合物的攝入也許有助于減輕體重，但減少脂肪的攝入有助于健康。

一項研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人們采用“阿特金斯減肥法”等低碳水化合物減肥法時，能減去更多體重。但采用低脂減肥法時，卻能減去更多脂肪。

這是一個重要發(fā)現(xiàn)，因為減肥者往往只關(guān)注減輕體重，而對健康至關(guān)重要的是脂肪的數(shù)量。

盡管超市貨架上低脂食品琳瑯滿目，但許多減肥者都對“阿特金斯減肥法”和“杜坎減肥法”等低碳水化合物減肥法情有獨鐘，他們相信，這些減肥法對減肥特別有效。

肥胖癥專家希望這項發(fā)現(xiàn)有助于打破人們對土豆和面包等碳水化合物食品的誤解。專家說：“消費者可以不再為日常生活中適當(dāng)攝入碳水化合物而自責(zé)了?！?/p>

美國國家糖尿病、消化系統(tǒng)疾病和腎病研究所的科學(xué)家，在研究中比較了低碳水化合物減肥法與低脂減肥法的效果。

研究期間，19名患有肥胖癥的男性和女性研究對象要在醫(yī)院病房被隔離4周，其間，研究人員會觀察并記錄他們吃的每一口食物和進(jìn)行的每一項鍛煉。

研究對象在前2周攝入低碳水化合物食品，后2周攝入低脂食品。前2周和后2周攝入的熱量（卡路里）一樣多，但攝入低碳水化合物食品時要比攝入低脂食品時減少的體重略多。這也許是因為，他們在低碳水化合物減肥法期間流失了許多水分。

但研究發(fā)現(xiàn)，脂肪有害健康，而低脂減肥法可以減少更多脂肪。

據(jù)美國《細(xì)胞-代謝》月刊報道，低脂減肥法比低碳水化合物減肥法減少的脂肪幾乎多一倍。

研究人員凱文·霍爾說：“肥胖癥是一種身體脂肪過多的紊亂癥，減少脂肪對健康至關(guān)重要。人們也許會因為低碳水化合物減肥法減重效果更好而興奮，但減少的更多是水分而不是脂肪。”

但對于選擇哪種減肥法，霍爾沒給出絕對的結(jié)論。他建議減肥者找到適合自己的減肥法。

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2015-08-18）

S858.28

A

1002-1957(2016)02-0094-03

2016-02-26

林躍華（1983-），男，福建龍海人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)研究工作.E-mail：zzslyh@163.com