檢測(cè)豬口腔液中藍(lán)耳病抗體時(shí)不同采集和處理方法的比較

李守剛，沈強(qiáng)，瞿慧，余紅梅，衛(wèi)秀余

（上海市奉賢區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海奉賢201499）

檢測(cè)豬口腔液中藍(lán)耳病抗體時(shí)不同采集和處理方法的比較

李守剛，沈強(qiáng)，瞿慧，余紅梅，衛(wèi)秀余

（上海市奉賢區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海奉賢201499）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是對(duì)養(yǎng)豬業(yè)有重大影響的頑固性疾病。臨床上表現(xiàn)為懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等繁殖障礙，仔豬和肥育豬出現(xiàn)呼吸衰竭，并伴隨生長(zhǎng)緩慢，流行范圍廣，病死率高。血液中的PRRS抗體檢測(cè)在疾病診斷、免疫水平評(píng)估中有著重要作用。但血液樣品采集有工作量大、對(duì)動(dòng)物造成傷害、威脅采集人員安全等缺點(diǎn)。近年來(lái)有報(bào)道利用口腔液檢測(cè)PRRS抗體，結(jié)果與血液中PRRS抗體含量具有很好的相關(guān)性。而本試驗(yàn)主要比較不同的樣品采集處理方法對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，口腔液的稀釋倍數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，因此必須選擇敏感性較高的檢測(cè)試劑盒，如藍(lán)耳病抗體檢測(cè)試劑盒血清40倍稀釋時(shí)，與口腔液2倍稀釋的結(jié)果才有較高的相關(guān)性。

藍(lán)耳病抗體；豬口腔液；樣品處理

口腔液是一種唾液和黏膜滲出液的混合物，口腔液中的唾液主要由腮腺、頜下腺和舌下腺這3條唾液腺共同分泌，黏膜滲出物則是通過(guò)毛細(xì)血管穿越頰黏膜到達(dá)口腔，口腔液中包含來(lái)自血清和唾液腺的特異性抗體[1]。唾液中起作用的抗體主要有兩種，分泌型IgA（sIgA）和IgG。分泌型IgA由唾液腺的漿細(xì)胞分泌，而唾液中絕大多數(shù)的IgG來(lái)自血清，也有一些IgG是局部產(chǎn)生的[2]。使用口腔液進(jìn)行疾病診斷和健康評(píng)估在人醫(yī)上已經(jīng)得到廣泛運(yùn)用，口腔液可以作為麻疹、腮腺炎、肝炎等疾病初步診斷分析的樣品[3]。使用口腔液在動(dòng)物疾病檢測(cè)和疫病監(jiān)測(cè)的研究剛剛開(kāi)始?？谇灰簶悠房捎糜赑CR檢測(cè)抗原，如口蹄疫病毒、非洲豬瘟病毒、經(jīng)典豬瘟病毒、流感病毒、藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒2型、丹毒絲菌屬、胞內(nèi)勞森氏菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、豬鼻支原體、豬滑液支原體、豬肺炎支原體以及其他的一些病原體?？谇灰簶悠吠瑫r(shí)可以替代血清樣品檢測(cè)藍(lán)耳病抗體、圓環(huán)病毒2型抗體、口蹄疫抗體、偽狂犬病抗體、豬瘟抗體[4]、非洲豬瘟抗體[5]等。目前為止，口腔液在獸醫(yī)領(lǐng)域運(yùn)用最成熟的是藍(lán)耳病抗體的檢測(cè)[5]?？谇灰撼煞謴?fù)雜、在體外容易接觸污染源、抗體含量比血液低等是影響口腔液作為可靠樣品的因素。筆者于2013年10月至2015年10月在上海奉賢某豬場(chǎng)通過(guò)比較不同的口腔液采集和處理程序，降低不利因素的影響，以增加口腔液樣品與血清樣品中藍(lán)耳病抗體檢測(cè)結(jié)果的符合率和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 采樣工具

采血器，直徑1.6 cm棉繩，密封袋，5 mL和1.5 mL離心管。

1.2 藥品試劑

蛋白酶抑制劑，IDEXX藍(lán)耳病血清抗體檢測(cè)試劑盒。

1.3 樣品采集

從免疫過(guò)藍(lán)耳病疫苗的豬場(chǎng)采集50份母豬血、20份公豬血，-20℃保存血清。每頭采集過(guò)血液樣品的豬，采集對(duì)應(yīng)的口腔液樣品，50份來(lái)自母豬、20份來(lái)自公豬。采集10份藍(lán)耳病抗體陰性的豬血和對(duì)應(yīng)的10份口腔液樣品。

1.4 口腔液采集

在投飼前，取直徑1.6 cm長(zhǎng)度1.5 m的棉繩，將兩端松散，兩端下垂懸掛在飼喂欄上，繩子盡量離開(kāi)地面和污染的欄柱，繩子末端略高于豬嘴，保證豬容易接觸，讓豬自由咀嚼30 min，將棉繩濕潤(rùn)的末端放入密封袋，用力擠壓，將口腔液轉(zhuǎn)入離心管中。采集的量在2～5 mL，足夠多次檢測(cè)所用。將樣品低速離心5 min，吸取上清液。

1.5 口腔液處理

將吸取的上清液分為兩份，一份加入蛋白酶抑制劑，一份不加，樣品放入-20℃保存。

1.6 血液樣品檢測(cè)

用樣品稀釋液將血清40倍稀釋?zhuān)?00 μL對(duì)照和樣品加入反應(yīng)板，24℃孵育30 min，洗板3次，加入100 μL酶，24℃孵育30 min，洗板3次，加入100 μL底物，24℃避光反應(yīng)15 min，650 nm波長(zhǎng)讀數(shù)。

1.7 口腔液樣品檢測(cè)

口腔液樣品不稀釋或2～8倍稀釋?zhuān)?00 μL對(duì)照、100 μL含蛋白酶抑制劑和不含蛋白酶抑制劑的稀釋樣品加入反應(yīng)板，24℃孵育120 min，洗板3次，加入100 μL酶，24℃孵育30 min，洗板3次，加入100 μL底物，24℃避光反應(yīng)15 min，650 nm波長(zhǎng)讀數(shù)。其中未冷凍樣品于采集后24 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，第1次解凍樣品為冷凍后2周進(jìn)行檢測(cè)，第2次解凍樣品于冷凍后4周進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清樣品與口腔液樣品檢測(cè)結(jié)果比較

檢測(cè)結(jié)果表明，血清樣品與口腔液樣品的結(jié)果具有較高的相關(guān)性，陰性符合率100%（10/10），陽(yáng)性符合率94%（66/70）以上（表1）。

表1 血清樣品與口腔液樣品檢測(cè)結(jié)果比較（口腔液2倍稀釋?zhuān)┓?/p>

2.2 口腔液樣品中蛋白酶抑制劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

結(jié)果顯示，加入蛋白酶抑制劑的樣品未冷凍與第1次解凍和第2次解凍后檢查結(jié)果的陽(yáng)性符合率分別為100%和98%；而不加蛋白酶抑制劑的樣品其陽(yáng)性符合率僅為98%和94%（表2）。說(shuō)明蛋白酶抑制劑在反復(fù)檢測(cè)或者保存較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，能增加樣品的穩(wěn)定性。不使用蛋白酶抑制劑的樣品在采集后應(yīng)盡快檢測(cè)。

表2 口腔液樣品中蛋白酶抑制劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響份

2.3 稀釋倍數(shù)對(duì)結(jié)果的影響

表3檢測(cè)結(jié)果顯示，口腔液樣品不稀釋或2倍稀釋時(shí)，其與血清抗體的陽(yáng)性符合率為94%（66/70）；而4倍和8倍稀釋時(shí)、其陽(yáng)性符合率僅為43%（30/ 70）和14%（10/70）。說(shuō)明稀釋倍數(shù)大于2倍時(shí)，其陽(yáng)性檢出率會(huì)明顯下降，這和試劑盒的敏感性有關(guān)。

表3 稀釋倍數(shù)對(duì)結(jié)果的影響份

3 討論

（1）口腔液的采集方法簡(jiǎn)便，易學(xué)易用，速度快，費(fèi)用低，并可減少應(yīng)激，改善動(dòng)物福利，是評(píng)估豬群實(shí)時(shí)健康動(dòng)態(tài)的良好工具[6]。

（2）口腔液采集最好選用棉繩，自由咀嚼30 min就能獲得足夠的樣品。采集口腔液樣品時(shí)應(yīng)該嚴(yán)格防止樣品污染，樣品需長(zhǎng)期保存時(shí)可以加入蛋白酶抑制劑。

（3）口腔液中藍(lán)耳病抗體與血清中的藍(lán)耳病抗體具有很好的相關(guān)性，可以用于監(jiān)測(cè)豬群的感染狀態(tài)和免疫效果[7]。

（4）口腔液的稀釋倍數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，因此必須選擇敏感性較高的檢測(cè)試劑盒，如藍(lán)耳病抗體檢測(cè)試劑盒血清40倍稀釋時(shí)，與口腔液2倍稀釋的結(jié)果才有較高的相關(guān)性，口腔液稀釋倍數(shù)大于4倍以上時(shí)其檢測(cè)結(jié)果已無(wú)實(shí)際意義。

（5）推進(jìn)口腔液在獸醫(yī)檢測(cè)中的運(yùn)用還有許多問(wèn)題：包括制作專(zhuān)門(mén)的采集用具，降低檢測(cè)的成本；研發(fā)針對(duì)其他抗體的試劑盒，擴(kuò)大使用范圍；提高檢測(cè)的精密度，能夠更好地反映口腔液中抗體濃度的變化。

[1]孫泉云，夏爐明，盧軍，等.豬口腔液在疫病檢測(cè)上的應(yīng)用進(jìn)展[J].國(guó)外畜牧學(xué)-豬與禽，2015（6）：37-38.

[2]李慧，宋明則，張建明，等.豬免疫后唾液中豬瘟抗體水平的監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2014（7）：95-96.

[3]侯亞琴，張建明，李慧，等.豬唾液于血清中抗體相關(guān)性研究[J].畜牧業(yè)，2014（3）：18-19.

[4]張建明，李慧，陳長(zhǎng)寧，等.仔豬口蹄疫母源抗體變化趨勢(shì)的研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2014（4）：44-45.

[5]Mur L,Gallardo C,Soler A,et al.Potential use of oral fluid samples for serological diagnosis of African swine fever[J].Veterinary Microbiology,2013,165(1/2):135-139.

[6]Prickett J R,Cutler S,Kinyon J M,et al.Stability of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and antibody in swine oral fluid[J].Journal of Swine Health and Production, 2010,18(4):187-195.

[7]White D,Rotolo M,Olsen C,et al.Recommendations for penbased oral-fluid collection in growing pigs[J].Journal of Swine Health and Production,2014,22(3):138-141.

（編輯：富春妮）

睡得太多也會(huì)折壽？

芬蘭一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，睡眠時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易短命。研究表明，睡眠時(shí)間超過(guò)8小時(shí)的人，死亡率高出20%；睡眠時(shí)間不足5小時(shí)和超過(guò)8小時(shí)的人，都有死亡率增高的危險(xiǎn)。每晚睡眠時(shí)間都超過(guò)8小時(shí)的人，發(fā)生卒中概率增加30%。研究顯示，睡眠與壽命有一定的聯(lián)系，但目前尚不清楚是睡眠過(guò)長(zhǎng)造成了短壽，還是其他病因?qū)е率人?/p>

（摘自《上海大眾衛(wèi)生報(bào)》，2016-01-26）

S858.28

A

1002-1957(2016)02-0092-02

2016-02-22

李守剛（1989-），男，云南昭通人，獸醫(yī)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù).

衛(wèi)秀余，研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室診斷和綜合防治技術(shù).E-mail：13801850960@163.com