含蛋氨酸二肽影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)

陳 璐 常晨城 史彬林 高 民 趙艷麗 閆素梅*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特010031)

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含蛋氨酸二肽影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)

陳 璐1常晨城1史彬林1高 民2趙艷麗1閆素梅1*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特010031)

本試驗(yàn)旨在研究含蛋氨酸(Met)二肽對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)分3部分，均采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Met的添加濃度及培養(yǎng)時(shí)間分別為60 μg/mL(0.402 mmol/L)、48 h。第1部分，培養(yǎng)液添加8種含Met二肽[蛋氨酸-蛋氨酸(P-Met-Met)、蛋氨酸-賴氨酸(P-Met-Lys)、蛋氨酸-色氨酸(P-Met-Trp)、蛋氨酸-苯丙氨酸(P-Met-Phe)、蛋氨酸-蘇氨酸(P-Met-Thr)、蛋氨酸-異亮氨酸(P-Met-Ile)、蛋氨酸-亮氨酸(P-Met-Leu)、蛋氨酸-纈氨酸(P-Met-Val)]，以不添加二肽為對(duì)照，測(cè)定BMECs乳蛋白合成相關(guān)基因(αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、Ⅱ型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體和氨肽酶氮)的表達(dá)量；第2部分，培養(yǎng)液添加8種與上述二肽對(duì)應(yīng)的游離氨基酸(F-Met-Met、F-Met-Lys、F-Met-Trp、F-Met-Phe、F-Met-Thr、F-Met-Ile、F-Met-Leu、F-Met-Val)，以不添加游離氨基酸為對(duì)照，測(cè)定BMECs乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)量；第3部分，用二肽等物質(zhì)的量替代相應(yīng)游離氨基酸，測(cè)定BMECs乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)量以及細(xì)胞內(nèi)外氨肽酶含量。結(jié)果表明：P-Met-Met和P-Met-Lys組較對(duì)照組和其他二肽組上調(diào)了αs1-酪蛋白和β-酪蛋白基因的表達(dá)量，且P-Met-Met組優(yōu)于P-Met-Lys組。F-Met-Met和F-Met-Lys組較對(duì)照組和其他游離氨基酸組顯著提高了αs1-酪蛋白基因的表達(dá)量(P<0.05)。除P-Met-Val和P-Met-Leu組外，其他二肽替代游離氨基酸后均不同程度地提高了乳蛋白和Ⅱ型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)量，其中P-Met-Met表現(xiàn)出較好的促進(jìn)效果?？傊?，含Met二肽等量替代對(duì)應(yīng)的游離氨基酸能夠促進(jìn)乳蛋白基因的表達(dá)，其中尤以P-Met-Met的效果最好。

奶牛；乳腺上皮細(xì)胞；乳蛋白；蛋氨酸；二肽；基因表達(dá)

乳蛋白是評(píng)價(jià)牛奶質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。乳成分前體物的組成與含量直接影響乳腺內(nèi)乳蛋白的合成，進(jìn)而影響乳品質(zhì)。蛋氨酸(Met)作為乳蛋白前體物，是乳蛋白合成的主要必需氨基酸，是奶牛第一限制性氨基酸[1]，是乳蛋白合成翻譯開(kāi)始的第1個(gè)氨基酸，也是機(jī)體中最重要的甲基直接供體，蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程被激活的必需要素就是5′端帽子結(jié)構(gòu)連接核苷酸的核糖需要被甲基化[2]。因此，從Met的角度研究對(duì)乳蛋白合成的影響及機(jī)理，對(duì)調(diào)控乳腺內(nèi)乳成分的合成和改善乳品質(zhì)具有重要意義。Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，向奶牛飼糧中添加蛋氨酸羥基類似物能夠顯著提高奶牛的乳產(chǎn)量、乳蛋白含量。然而，用于乳蛋白合成的氨基酸并非全部由血液中的游離氨基酸來(lái)供給，乳腺組織還可以攝取小肽和蛋白質(zhì)等非游離態(tài)氨基酸以滿足乳蛋白合成的需要[4]。小肽能夠彌補(bǔ)乳腺組織對(duì)氨基酸攝取的不足，而且能在乳腺蛋白質(zhì)代謝過(guò)程中發(fā)揮作用。畢微微[5]的研究發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸-蛋氨酸(P-Met-Met)和蛋氨酸-賴氨酸(P-Met-Lys)二肽能促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)增殖以及β-酪蛋白(CSN2)基因的表達(dá)。以BMECs為模型，用P-Met-Met和P-Met-Lys等量替代與它們對(duì)應(yīng)的游離氨基酸，二肽組的αs1-酪蛋白(CSN1S1)基因表達(dá)與培養(yǎng)液中酪蛋白濃度均顯著高于游離氨基酸組[6]。這些研究結(jié)果均表明，氨基酸及小肽都在一定程度上影響了奶牛乳蛋白的合成。因此，研究二肽等量替代游離氨基酸對(duì)乳蛋白合成的影響，對(duì)深入了解乳蛋白前體物對(duì)奶牛乳蛋白合成的影響機(jī)理及不斷提高牛奶品質(zhì)具有一定理論與實(shí)際意義。然而，目前相關(guān)的研究較少。鑒于此，本試驗(yàn)以BMECs為體外培養(yǎng)模型，研究不同種類的含Met二肽對(duì)乳蛋白合成相關(guān)基因和氨肽酶氮(APN)基因表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)外氨肽酶(APA)含量的影響，篩選出促進(jìn)效果明顯的二肽組合，為建立適用于奶牛泌乳所需要的二肽營(yíng)養(yǎng)模式提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

膠原酶Ⅱ、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)和雙抗均購(gòu)自Gibco公司；氫化可的松、表皮生長(zhǎng)因子、催乳素、Met、賴氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val)均購(gòu)自Sigma公司；P-Met-Met、P-Met-Lys、蛋氨酸-色氨酸(P-Met-Trp)、蛋氨酸-苯丙氨酸(P-Met-Phe)、蛋氨酸-蘇氨酸(P-Met-Thr)、蛋氨酸-異亮氨酸(P-Met-Ile)、蛋氨酸-亮氨酸(P-Met-Leu)、蛋氨酸-纈氨酸(P-Met-Val)8種二肽均購(gòu)自上?？齐纳锕?產(chǎn)品編號(hào)分別為PO14103105、PO14103106、PO14103107、PO14103108、PO14103109、PO14103110、PO14103111、PO14103112)；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲亞基砜(DMSO)和兩性霉素均購(gòu)自Amresco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自HyClone公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、PrimeScript RT Master Mix購(gòu)自TaKaRa公司；RNAprep pure Cell/Bacteria Kit購(gòu)自TIANGEN公司。

主要儀器有：倒置顯微鏡(Olympuse公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Synergy H4，BioTek公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Cytorecon，ECI公司)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)(HF-240，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；熒光定量PCR儀(ABI-7500，ABI公司)；電泳儀(Bio-Rad公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)分為3部分，均采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)中使用的DMEM/F12培養(yǎng)基中Met的含量為17.24 μg/mL，Met的添加濃度及培養(yǎng)時(shí)間參考本課題組前期研究結(jié)果分別定為60 μg/mL(0.402 mmol/L)、48 h。第1部分，研究8種含Met二肽(P-Met-Met、P-Met-Lys、P-Met-Trp、P-Met-Phe、P-Met-Thr、P-Met-Ile、P--Met-Leu、P-Met-Val)對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，分為對(duì)照組(不添加二肽)和8個(gè)分別添加8種含Met二肽的試驗(yàn)組，使每種二肽的濃度均為0.402 mmol/L。第2部分，研究與8種二肽相對(duì)應(yīng)的游離氨基酸(F-Met-Met、F-Met-Lys、F-Met-Trp、F-Met-Phe、F-Met-Thr、F-Met-Ile、F-Met-Leu、F-Met-Val)對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，分為對(duì)照組(不添加游離氨基酸)和8個(gè)分別添加8種游離氨基酸混合溶液試驗(yàn)組。游離氨基酸混合溶液中每種氨基酸的濃度與第1部分相應(yīng)的二肽組中的氨基酸濃度一致。第3部分，研究用含Met的二肽等物質(zhì)的量替代相應(yīng)的游離氨基酸后對(duì)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，試驗(yàn)分為8個(gè)獨(dú)立的組合，每個(gè)組合為1種含Met的二肽組與相應(yīng)的游離氨基酸組構(gòu)成，將每個(gè)組合的二肽組與游離氨基酸組進(jìn)行對(duì)比分析，二肽和氨基酸添加濃度與試驗(yàn)第1、2部分一致。在3個(gè)試驗(yàn)中，每組均為6個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)基中不加FBS。

1.3 原代BMECs體外培養(yǎng)

BMECs采用膠原酶消化法獲得。取健康荷斯坦奶牛乳腺組織，去除組織表層，于深處取約1 cm3的組織塊，放入4 ℃預(yù)冷的PBS中。在超凈臺(tái)內(nèi)用PBS將組織塊初步洗凈后，再去除組織塊的表層，并將組織剪成糊狀。加入0.5%膠原酶Ⅱ溶液，于37 ℃和5% CO2的條件下消化1 h，每隔20 min緩慢搖晃離心管。消化液用孔徑為80目的細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞濾液，179×g離心5 min，棄上清。加入完全培養(yǎng)基，吹打均勻，然后轉(zhuǎn)入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，依據(jù)BMECs和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶消化敏感性不同的特點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化并傳代。將傳至第3代的BMECs懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[7]。

1.4 測(cè)試指標(biāo)與方法

1.4.1 BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)量

將第3代的BMECs，以2×105個(gè)/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板上，每組6個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后，細(xì)胞總RNA按照RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒的方法提取，總RNA的完整性和純度用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄PCR采用PrimeScriptRTMaster Mix試劑盒的方法進(jìn)行，得到的cDNA用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系為20 μL。用磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，對(duì)乳蛋白合成相關(guān)基因[αs1-酪蛋白(CSN1S1)、CSN2、κ-酪蛋白(CSN3)、β-乳球蛋白(LGB)、Ⅱ型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PEPT2)和APN]的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，引物序列及參數(shù)見(jiàn)表1。熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5.0 ℃(預(yù)變性)30 s；95.0 ℃(變性)30 s；退火溫度30 s；72.0 ℃(延伸)20 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃(延伸)7 min。熔解曲線程序?yàn)椋?0～95 ℃，每6 s升溫0.5 ℃，共51個(gè)循環(huán)，熒光定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 引物序列及參數(shù)

F：上游引物；R：下游引物。

F: forward primer; R: reverse primer.

1.4.2 BMECs內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)液中氨肽酶(APA)的含量

細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液15 000×g/min在4 ℃離心10 min，取上清；將細(xì)胞用PBS清洗3遍，向每孔加入70 μL的細(xì)胞裂解液，4 ℃孵育30 min后刮下細(xì)胞，4 ℃ 15 000 g/min離心10 min，取上清。提取出的APA采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行計(jì)算整理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，第1部分與第2部分的數(shù)據(jù)用ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較；第3部分二肽組與游離氨基酸組的數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示差異趨于顯著。

2 結(jié) 果

2.1 含Met的二肽對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

表2結(jié)果表明，對(duì)于CSN1S1基因表達(dá)量，P-Met-Met組較對(duì)照組和其他二肽組顯著提高(P<0.05)，P-Met-Lys組較對(duì)照、P-Met-Leu和P-Met-Val組顯著提高(P<0.05)；對(duì)于CSN2基因表達(dá)量，P-Met-Met、P-Met-Lys組較對(duì)照組、P-Met-Thr、P-Met-Trp、P-Met-Leu、P-Met-Ile和P-Met-Val組顯著升高(P<0.05)，P-Met-Phe組較P-Met-Thr、P-Met-Leu、P-Met-Ile和P-Met-Val組顯著升高(P<0.05)；對(duì)于CSN3基因表達(dá)量，P-Met-Met、P-Met-Lys、P-Met-Phe和P-Met-Ile組較P-Met-Thr、P-Met-Trp、P-Met-Leu和P-Met-Val組顯著提高(P<0.05)；8種二肽對(duì)LGB、PEPT2和APN基因表達(dá)量均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表2 含Met的二肽對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白、PEPT2和APN基因表達(dá)的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same column with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P< 0.05). The same as below.

2.2 游離氨基酸對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

表3結(jié)果表明，F(xiàn)-Met-Met、F-Met-Lys組的CSN1S1基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和其他游離氨基酸組(P<0.05)；F-Met-Met、F-Met-Lys、F-Met-Phe和F-Met-Leu組的CSN2基因表達(dá)量顯著高于F-Met-Thr組(P<0.05)；對(duì)于CSN3基因表達(dá)量，F(xiàn)-Met-Met、F-Met-Phe、F-Met-Trp和F-Met-Leu組較F-Met-Thr組顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)-Met-Lys組較F-Met-Phe、F-Met-Thr、F-Met-Trp、F-Met-Leu、F-Met-Ile和F-Met-Val組顯著升高(P<0.05)；對(duì)于PEPT2基因表達(dá)量，F(xiàn)-Met-Met組較F-Met-Trp、F-Met-Leu、F-Met-Ile和F-Met-Val組顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)-Met-Lys組較F-Met-Ile組顯著提高(P<0.05)；各組LGB和APN基因表達(dá)量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 二肽等量替代游離氨基酸對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)及BMECs內(nèi)外APA含量的影響

表4結(jié)果表明，與F-Met-Met組相比，P-Met-Met組顯著上調(diào)了CSN1S1、CSN2和CSN3基因的表達(dá)量(P<0.05)；P-Met-Lys組和F-Met-Lys組相比，CSN2的基因表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，PEPT2的基因表達(dá)量趨于顯著提高(P=0.09)；與F-Met-Phe組相比，P-Met-Phe組顯著提高了CSN1S1和APN基因的表達(dá)量(P<0.05)；P-Met-Trp組的CSN1S1和PEPT2基因表達(dá)量顯著高于F-Met-Trp組(P<0.05)，對(duì)APN基因的表達(dá)量有顯著提高的趨勢(shì)(P=0.06)；與F-Met-Leu組相比，P-Met-Leu組的CSN2基因的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，PEPT2基因的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，APN基因表達(dá)量有顯著升高的趨勢(shì)(P=0.06)；與F-Met-Ile組相比，P-Met-Ile組的CSN1S1、CSN3和PEPT2基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)；P-Met-Val組PEPT2和APN基因表達(dá)量顯著高于F-Met-Val組(P<0.05)。

表3 游離氨基酸對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白、PEPT2和APN基因表達(dá)的影響

在細(xì)胞外，P-Met-Met組和P-Met-Lys組的APA含量趨于顯著地低于相應(yīng)的游離氨基酸組(P=0.06，P=0.07)，其他二肽替代游離氨基酸后APA的含量變化均不顯著(P>0.05)；在細(xì)胞內(nèi)，8種二肽替代游離氨基酸后對(duì)APA含量影響不顯著(P>0.05)。

表4 二肽等量替代游離氨基酸對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白、PEPT2、APN基因表達(dá)及BMECs內(nèi)外APA含量的影響

續(xù)表4組別Groupsαs1-酪蛋白CSN1S1β-酪蛋白CSN2κ-酪蛋白CSN3β-乳球蛋白LGBⅡ型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PEPT2氨肽酶氮APN細(xì)胞外Extracellular細(xì)胞內(nèi)Intracellular氨肽酶APA/(pg/mL)F-Met-Trp0.97b0.920.941.010.93b0.971545.21937.52P值P-value<0.010.110.210.220.020.060.380.35P-Met-Leu0.980.85a0.851.001.03a1.041487.52890.09F-Met-Leu0.991.01b0.911.050.92b0.971450.84827.51P值P-value0.790.010.310.320.020.060.330.40P-Met-Ile1.11a0.841.12a1.011.08a1.021420.62782.54F-Met-Ile1.00b0.910.86b1.000.89b1.001460.92775.01P值P-value0.020.230.010.75<0.010.570.880.76P-Met-Val1.030.830.780.971.04a1.06a1595.54810.02F-Met-Val0.990.970.830.990.93b0.94b1560.09827.51P值P-value0.550.050.490.740.010.010.720.19

3 討 論

牛奶乳蛋白的90%是由奶牛乳腺組織以氨基酸為原料合成的，并且用于乳腺內(nèi)從頭合成乳蛋白的氨基酸，90%以上是從血液當(dāng)中吸收的[9]。然而有研究表明，乳腺組織不僅能從血液中單純地?cái)z取游離氨基酸合成乳蛋白，而且也能攝取以肽形式結(jié)合的必需氨基酸合成乳蛋白，但機(jī)理尚不明確[10]。周苗苗等[11]研究含Lys二肽對(duì)BMECs中乳蛋白合成的影響發(fā)現(xiàn)，添加Lys二肽能促進(jìn)乳蛋白的合成。小肽被動(dòng)物組織吸收利用依賴于其獨(dú)立的轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)，主要靠依賴H+和Ca2+的逆濃度梯度進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體具有轉(zhuǎn)運(yùn)速率快、吸收耗能低及不易飽和等特點(diǎn)[12]，而游離氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體與之相反，因此動(dòng)物組織對(duì)小肽的利用效率在理論上絕對(duì)高于游離氨基酸。PEPT2是一種低容量、高親和力的肽載體[13]，主要轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或仿肽類藥物[14]。泌乳奶牛乳腺外植體試驗(yàn)研究指出，PEPT2的轉(zhuǎn)運(yùn)功能受到抑制會(huì)明顯減少乳蛋白合成[15]。Zhou等[16]的研究指出，BMECs能攝取苯丙氨酸-苯丙氨酸(P-Phe-Phe)二肽促進(jìn)PEPT2基因的表達(dá)并用于乳蛋白的合成，說(shuō)明PEPT2可能在乳腺攝取小肽的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。BMECs的表面存在一種能夠?qū)⑿‰乃獬捎坞x氨基酸的APA，APA是乳腺組織為乳蛋白合成提供氨基酸的肽酶之一[17]，當(dāng)氨基酸水平不能滿足機(jī)體泌乳需要時(shí)，細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外會(huì)發(fā)出代謝信號(hào)調(diào)節(jié)其表達(dá)活性。因此，小肽能夠通過(guò)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體和APA水解2個(gè)途徑被乳腺組織吸收利用[17-18]。劉輝等[19]研究山羊乳腺對(duì)大豆小肽的吸收利用影響發(fā)現(xiàn)，灌注小肽促進(jìn)了APN基因的表達(dá)，同時(shí)顯著促進(jìn)了乳蛋白合成。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，P-Met-Met和P-Met-Lys組提高了CSN1S1和CSN2基因的表達(dá)，促進(jìn)了乳蛋白的合成，以P-Met-Met組的效果更好，并且除P-Met-Met、P-Met-Phe和P-Met-Thr組外，其他二肽組的PEPT2基因表達(dá)量均顯著或趨于顯著地高于游離氨基酸組；通過(guò)對(duì)APA含量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外均存在APA，且除P-Met-Met、P-Met-Lys和P-Met-Ile組外，其他二肽組的APN基因表達(dá)量均顯著或趨于顯著地高于游離氨基酸組，說(shuō)明BMECs能產(chǎn)生APA，將二肽水解為游離氨基酸為乳蛋白的合成提供底物，并且可利用二肽合成乳蛋白。

一項(xiàng)含Met的肽的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同種類的含Met二肽被BMECs利用效率不同，二肽形式結(jié)合的Met被利用的效率相當(dāng)于游離蛋基酸利用效率的35%～122%，其中P-Met-Val、P-Met-Leu和亮氨酸-蛋氨酸(P-Leu-Met)二肽的利用能力要高于對(duì)應(yīng)的游離氨基酸[20]。本試驗(yàn)得出，BMECs中用含Met的8種二肽等量替代相應(yīng)的游離氨基酸后，除P-Met-Val和P-Met-Leu外，其他二肽比游離氨基酸能更好地促進(jìn)CSN1S1、CSN2和CSN3基因的表達(dá)，尤其以P-Met-Met的促進(jìn)效果更好，與F-Met-Met相比分別增加了23.1%、15.3%和18.5%；其次是P-Met-Phe和P-Met-Lys，分別較相應(yīng)的游離氨基酸組增加了12.5%、6.1%、11.8%和8.0%、15.8%、3.7%。說(shuō)明BMECs對(duì)二肽的利用效率高于相應(yīng)的游離氨基酸。二肽組PEPT2和APN基因表達(dá)量也高于對(duì)應(yīng)的游離氨基酸組，進(jìn)一步說(shuō)明BMECs能通過(guò)既攝取二肽也攝取氨基酸來(lái)合成乳蛋白，而且小肽與游離氨基酸相比能更有效地促進(jìn)乳蛋白的合成。然而，小肽是如何進(jìn)入細(xì)胞被利用以及二肽與游離氨基酸保持多大比例更適于乳蛋白的合成，本試驗(yàn)尚未進(jìn)行研究，其確切的機(jī)理需要進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

含Met二肽等物質(zhì)的量替代對(duì)應(yīng)的游離氨基酸能夠促進(jìn)乳蛋白基因的表達(dá)，其中以P-Met-Met、P-Met-Lys、P-Met-Phe和P-Met-Ile的促進(jìn)效果較好，尤以P-Met-Met的效果最明顯。

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*Corresponding author, professor, E-mail: yansmimau@163.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Dipeptides Containing Methionine Affects Gene Expressions Involved in Milk Protein Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

CHEN Lu1CHANG Chencheng1SHI Binlin1GAO Min2ZHAO Yanli1YAN Sumei1*

(1.CollegeofAnimalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China; 2.InnerMongoliaAcademyofAgricultural&AnimalHusbandrySciences,Hohhot010031,China)

The aim of this study was to investigate the effects of dipeptides containing methionine on gene expressions involved in milk protein synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMECs). The study consisted of three parts and adopted completely random single-factor designs. Concentration of methionine and incubation time were 60 μg/mL (0.402 mmol/L) and 48 h, respectively. Part 1, eight kinds of dipeptides [methionine-methionine (P-Met-Met), methionine-lysine (P-Met-Lys), methionine-tryptophan (P-Met-Trp), methionine-phenylalanine (P-Met-Phe), methionine-threonine (P-Met-Thr), methionine-isoleucine (P-Met-Ile), methionine-leucine (P-Met-Leu) and methionine-valine (P-Met-Val)] were supplemented in culture medium, and culture medium without dipeptide supplementation was used as control; milk protein synthesis related geneα-casein (CSN1S1), β-casein (CSN2), κ-casein (CSN3), β-lactoglobulin (LGB), pep tide transporter 2 (PEPT2) and aminopeptidase nitrogen (APN) expressions in BMECs were determined. Part 2, eight kinds of free amino acids (F-Met-Met, F-Met-Lys, F-Met-Trp, F-Met-Phe, F-Met-Thr, F-Met-Ile, F-Met-Leu and F-Met-Val) corresponded with the above dipeptides, and culture medium without free amino acids supplementation was used as control; milk protein synthesis related gene expressions in BMECs were determined. Part 3, dipeptides containing methionine equimolarly substituted corresponding free amino acids; milk protein synthesis related gene expressions in BMECs and APA content inside and outside BMECs were determined. The results showed as follows: gene expressions of CSN1S1 and CSN2 were greater in P-Met-Met and P-Met-Lys groups than in other groups, and greater expressions were detected in P-Met-Met group than in P-Met-Lys group. Gene expressions of CSN1S1 was significantly increased in F-Met-Met and F-Met-Lys groups versus other groups (P<0.05). Except P-Met-Val and P-Met-Leu groups, dipeptides containing methionine substitution of corresponding free amino acids up-regulated the expressions of milk protein synthesis related genes andPEPT2 gene, and P-Met-Met had the best effect. In conclusion, dipeptides containing methionine equimolarly substitution of corresponding free amino acids can increase milk protein synthesis related gene expressions, especially P-Met-Met.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(12)：4036-4043]

dairy cow; mammary epithelial cells; milk protein; methionine; dipeptide; gene expression

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.12.039

2016-06-07

國(guó)家奶業(yè)“973計(jì)劃”項(xiàng)目(2011CB1008003)

陳 璐(1990—)，女，山西襄汾人，碩士研究生，從事奶牛營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail： 1510560671@qq.com

*通信作者：閆素梅，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： yansmimau@163.com

S823

A

1006-267X(2016)12-4036-08