山楂葉總黃酮對肥大心肌細胞線粒體功能的影響

徐穎，李勁松，孫濤

·藥理毒理·

山楂葉總黃酮對肥大心肌細胞線粒體功能的影響

徐穎1，李勁松2，孫濤1

山楂葉總黃酮為山楂葉的主要活性物質(zhì)群，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其藥理作用集中于心腦血管方向，其作用機制主要為抗氧化應激損傷，保護細胞線粒體功能等。本文采用AngII致心肌細胞肥大模型，研究山楂葉總黃酮對肥大心肌細胞線粒體功能的影響，以期為山楂葉總黃酮治療心衰的線粒體保護途徑提供研究思路。

山楂葉；總黃酮；線粒體功能

山楂葉為薔薇科山楂屬植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br.或山楂C.pinnatifida Bge.的葉，具有活血化瘀、理氣通脈的功效。在我國，早在東晉《肘后方》中就有山楂葉“莖葉煮汁，洗漆瘡”的記載，2010版《中國藥典》正式收載山楂葉。

黃酮類化合物作為山楂葉的主要活性物質(zhì)群，主要包括槲皮素、金絲桃苷、牡荊素、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷等，最新研究顯示，山楂葉總黃酮（Hawthorn leaves flavonoids，HLF）藥理作用主要集中于心血管方向，包括：調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保護血管內(nèi)皮、抗動脈粥樣硬化、對心、腦、腎等器官組織缺血再灌注損傷病理程度的改善及保護等作用，其機制主要涉及清除氧自由基，降低血清總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）量，提高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）/TC比值，改善細胞功能代謝，保護細胞線粒體功能，調(diào)節(jié)相關細胞因子及基因的表達等。

在慢性心衰的各種病理改變中，線粒體的結構與功能的改變處于中心地位。心臟通過能量代謝將儲存于脂肪酸和葡萄糖中的化學能轉化為機械能，為心臟的收縮和舒張等耗能過程提供能量。因此，本研究從心衰的線粒體功能途徑入手，研究HLF對心衰細胞模型（AngII致心肌細胞肥大）線粒體功能的干預及影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

山楂葉總黃酮（HLF，Hawthorn leaves flavonoids，純度＞90%）購于山西晉城中晉藥業(yè)公司；纈沙坦（中國食品藥品檢定研究院）；II型膠原酶、Ang II、5-溴脫氧尿嘧啶、D-Hanks溶液（Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、胎牛血清、胰蛋白酶、青-鏈霉素（Gibco公司）；細胞增殖試劑盒IIXTT（Roche公司）；96孔板、細胞培養(yǎng)瓶（Corning公司）；動物細胞/組織高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒、純化線粒體蛋白質(zhì)濃度定量測定試劑盒、線粒體內(nèi)膜功能/膜電位（JC-1）測定試劑盒、線粒體外膜功能檢測試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 儀器

電動移液器（Eppendorf公司）；電子天平（Sartorius公司）；超凈工作臺（上海博迅公司）；倒置熒光顯微鏡（Leica公司）；酶標儀、CΟ2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；低溫離心機（Beckman 公司）。

1.3 方法

1.3.1 心肌細胞分離、純化、培養(yǎng)、鑒定 參考文獻[1]并改進如下：1～3 d SD乳鼠，取出心臟，置于預冷的D-hanks溶液，眼科剪減去心臟的1/2，留心尖部心室組織；然后分別沿橫、縱兩個方向剪開剩余心室組織，放入0.1%的胰蛋白酶中，置于搖床上往復30 次/min速度，4℃冰箱震蕩過夜。第2日加入胰蛋白酶等體積的培養(yǎng)液，37℃水浴箱以往復60 次/min的速度震蕩10 min后終止消化，棄上清。加入濃度為0.08%Ⅱ型膠原酶，置37℃水浴箱以60 次/min的速度震蕩10 min，收集上清，并用等體積的培養(yǎng)液中和收集到的上清液。此步驟重復3～5次，直至組織基本消化為止。收集各次消化的液體，1500 r．min-1離心5 min，棄上清，用DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液。采用差速貼壁進行分離，收集細胞懸液，用含10%胎牛血清的DMEM稀釋，同時，每10 mL細胞懸液中加入80 μL5-溴脫氧尿嘧啶以抑制非心肌細胞增殖，細胞計數(shù)，接種細胞，培養(yǎng)3天后使用。常規(guī)免疫組化方法進行鑒定，一抗選擇大鼠α-橫紋肌動蛋白單克隆抗體，SABC染色，DAB顯色。

1.3.2 實驗分組及給藥 綜合XTT細胞活力測定實驗結果及前期預實驗，實驗分組及給藥濃度設定如下，分別為：空白對照組（心肌細胞正常培養(yǎng)）；AngII組（1 μmol．L-1）、AngII（1 μmol．L-1）+纈沙坦（1 μmol．L-1）組、AngII（1 μmol．L-1）+HLF（200 μg．mL-1）組。

1.3.3 心肌細胞直徑及總蛋白含量測定 心肌細胞常規(guī)培養(yǎng)3 d后，含1.5%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分組給藥作用72 h，倒置熒光顯微鏡觀察、拍照，圖像分析軟件測量心肌細胞直徑，計算平均值；BCA法測定心肌細胞總蛋白含量。

1.3.4 心肌細胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位測定 陽離子熒光羰花青染色劑JC-1是一種對膜電位高度敏感的染色劑。它能夠特異性地進入線粒體，分布和結合在線粒體基質(zhì)上。線粒體膜電位的高低變化決定了JC-1的分布濃度。電位高，JC-1形成聚集體，而濃度高，熒光顯色為紅色或桔紅色；反之，則為綠色。心肌細胞細預處理方法及作用時間同1.3.3，嚴格按照心肌細胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位檢測試劑盒說明書進行后續(xù)步驟操作：使用倒置熒光顯微鏡觀察紅、綠熒光，熒光條件設定如下：觀察紅色熒光（濾波器激發(fā)波長490 nm、散發(fā)波長590 nm）；觀察綠色熒光（濾波器激發(fā)波長490 nm、散發(fā)波長530 nm）；顯微鏡圖像分析軟件計算MMP（紅色熒光與綠色熒光強度比值），若MMP降低則提示心肌細胞線粒體內(nèi)膜功能損害。

1.3.5 心肌細胞線粒體膜外膜功能測定 細胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase，CΟX）存在于真核生物的細胞線粒體上，主要通過氧化磷酸化為細胞提供能量。作為線粒體外膜功能的生物標記，通過測定在去垢劑（既使CΟX酶保持活性，又使外膜充分裂解）存在與否的條件下，線粒體的酶含量變化，來衡量線粒體外膜的完整性。心肌細胞細預處理方法及作用時間同1.3.3，嚴格按照高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒及線粒體外膜功能檢測試劑盒說明書進行后續(xù)步驟操作：計算線粒體膜外損傷率（稀釋液處理的心肌細胞線粒體樣品為損傷線粒體釋放的CΟX活性，裂解液處理的為總CΟX活性，前者與后者的比值即為線粒體外膜損傷率）。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 實驗重復3次，數(shù)據(jù)用 ±s代表，采用spss15統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P ＜0.05 表示有顯著性意義。

2 結果

2.1 心肌細胞總蛋白含量測定

與空白對照組相比，AngII組能顯著增加心肌細胞總蛋白含量；與AngII比較，AngII+纈沙坦組、AngII+HLF能夠顯著降低異常升高的總蛋白含量，結果詳見表1。

表1 心肌細胞總蛋白含量測定（±s）

表1 心肌細胞總蛋白含量測定（±s）

組別 劑量 n 總蛋白含量(mg/106 cell)空白對照 — 3 0.688 ±0.082

注：與空白對照組比，**P＜0.01；與AngII組比較，△△P＜0.01

2.2 心肌細胞直徑測定

與空白對照組相比，AngII組能顯著增加心肌細胞直徑；與AngII比較，AngII+纈沙坦組、AngII+HLF能夠顯著降低異常升高的心肌細胞直徑，結果詳見表2。

表2 心肌細胞直徑測定（±s）

表2 心肌細胞直徑測定（±s）

注：與空白對照組比，**P＜0.01；與AngⅠⅠ組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量 n 細胞直徑（μm）空白對照 — 3 18.370±1.439 AngII 1 μmol．L-13 25.073±2.040** AngII+纈沙坦 1 μmol．L-1+1 μmol．L-13 21.317±1.888△△AngII+HLF 1 μmol．L-1+200 μg．mL-13 22.338±2.611△

2.3 心肌細胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位測定

與空白對照組相比，AngII組能顯著降低MMP；與AngII比較，AngII+纈沙坦組、AngII+HLF能夠顯著升高異常降低的MMP，結果詳見表3。

表3 心肌細胞粒體內(nèi)膜功能/膜電位測定（±s）

表3 心肌細胞粒體內(nèi)膜功能/膜電位測定（±s）

注：與空白對照組比，**P＜0.01；與AngII組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量 nMMP(紅/綠熒光強度)空白對照 — 3 2.900±0.639 AngII 1 μmol．L-13 1.167±0.162** AngII+纈沙坦 1 μmol．L-1+1 μmol．L-13 2.186±0.163△△AngII+HLF 1 μmol．L-1+200 μg．mL-13 1.650±0.297△

2.4 心肌細胞線粒體外膜功能測定

與空白對照組相比，AngII組能顯著升高外膜損傷率；與AngII比較，AngII+纈沙坦組、AngII+HLF能夠顯著降低異常升高的外膜損傷率，結果詳見表4。

表4 心肌細胞線粒體外膜功能測定（±s）

表4 心肌細胞線粒體外膜功能測定（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與AngII組比較，△△P＜0.01

組別 劑量 n外膜損傷率（%）空白對照 — 3 3.997±0.730 AngII 1μmol．L-13 12.377±1.494** AngII+纈沙坦 1μmol．L-1+1μmol．L-13 8.453±1.021△△AngII+HLF 1μmol．L-1+200μmol．L-13 10.042±1.305△△

3 討論

黃酮作為一種天然的抗氧化劑，對于很多細胞都能發(fā)揮抗氧化應激損傷作用。山楂葉中富含黃酮，其黃酮含量超過山楂的其它有效部位。通過色譜法研究發(fā)現(xiàn)，HLF中含有槲皮素、牡荊黃素，pinnatifidaC、pinnatifidaD等[2～4]。

目前，國內(nèi)以山楂葉總黃酮為主的制劑益心酮片、膠囊等近年來在臨床上被用于高血壓、高血脂、冠心病等疾病的治療。歐洲的最新研究結果顯示[5]，歐洲屬山楂葉提取物WS1442（從山楂葉中提取出來的一種天然的抗氧化劑，主要成分為黃酮和聚合黃烷類，在一部分歐洲國家，已被批準用于治療早期的充血性心衰）可安全延長已接受過藥物治療的充血性心衰患者的生命，歐洲的156個研究中心共同實施了隨機雙盲臨床實驗—SPICE研究。該研究中84%的受試者是男性，44%的患者心功能受損嚴重，前18個月的研究顯示，WS1442組的患者心源性死亡率減少20%，壽命延長了4個月。

在慢性心衰的各種病理改變中，線粒體的結構與功能的改變處于中心地位。心臟通過能量代謝將儲存于脂肪酸和葡萄糖中的化學能轉化為機械能，為心臟的收縮和舒張等耗能過程提供能量。

因此，本研究從心衰的線粒體功能途徑入手，研究HLF對心衰細胞模型（AngII致心肌細胞肥大）線粒體功能的干預及影響，結果顯示：山楂葉總黃酮200μg．mL濃度組，能顯著降低AngII所致異常升高的總蛋白含量、心肌細胞直徑、線粒體外膜損傷率；顯著升高AngII所致異常降低的MMP。故推測山楂葉總黃酮是通過干預及影響肥大心肌細胞線粒體功能來發(fā)揮心肌細胞保護作用。

[1] 陶靜,馬依彤,李曉梅.原代乳鼠心肌細胞培養(yǎng)方法的改進[J].中華心血管病雜志,2014,42(01):53.

[2] PC, Z. and X. SX, Flavonoid Ketohexose furanosides from the leaves of Crataegus pinnatifida Bge[J] . Var. majo r N. E. B r.Phytochemistry, 2001,57(8): 1249.

[3] Rice-Evans, C.A., et al. The relative antioxidant activities of plant-derived polyphenolic flavonoids[J]. Free Radic Res, 1995.22(4):375.

[4] Castelluccio, C., et al. Antioxidant potential of intermediates in phenylpropanoid metabolism in higher plants[J]. FEBS Letters, 1995. 368(1): 188.

[5] Vanden Hoek, T.L., et al. Significant Levels of Οxidants are Generated by Isolated Cardiomyocytes During Ischemia Prior to Reperfusion[J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 1997. 29(9): 2571.

（責任編輯：陳思敏）

The study of the effect of Hawthorn leaves flavonoids on the mitochondrial function of hypertrophic cardiomyocytes/

XU Ying1, LI Jing-song2, SUN Tao1//(1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan; 2. The first People's Hospital of Guangyuan, Guangyuan 628017, Sichuan)

The flavonoids are the main active substance groups of Hawthorn leaves. Recent study showed that the pharmacological research of Hawthorn leaves flavonoids are focused on heart and cerebral vessels. Main mechanism involved are anti-oxidative stress damage and protection of the function of mitochondria of cells. AngII-induced cardiomyocyte hypertrophy model are used to study the effect of Hawthorn leaves flavonoids on the mitochondrial function of hypertrophic cardiomyocytes, and to provide research ideas for the mitochondrial protection of Hawthorn leaves flavonoids in treatment of heart failure.

Hawthorn leaves; flavonoids; mitochondrial function

R 285.5

A

1674-926X(2016)04-011-03

四川省科技廳應用基礎研究計劃項目(編號: 2013JY0068)；四川省中醫(yī)藥管理局中藥基礎研究項目(編號:2014F013)；廣元市科技局科技支撐計劃項目(編號:14KJZCS003)；成都中醫(yī)藥大學科技發(fā)展基金(編號:030029041)；成都中醫(yī)藥大學科技發(fā)展基金(編號:030029053)

1.成都中醫(yī)藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137；

2. 廣元市第一人民醫(yī)院，四川 廣元 628017

徐穎，講師，主要從事中藥藥理研究

Email:497412855@qq.com

孫濤，副教授，主要從事中藥藥理研究

Email:suntao2178@126.com

2016-06-23