正交優(yōu)選苦紫洗劑提取工藝研究

范世忠，郭華，曾倩，談靜，袁強(qiáng)華

·炮制制劑·

正交優(yōu)選苦紫洗劑提取工藝研究

范世忠1，郭華2，曾倩1，談靜1，袁強(qiáng)華1

目的：優(yōu)選苦紫洗劑的提取工藝。方法：采用L9(34)正交試驗(yàn)，以羥基萘醌類總色素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),以乙醇用量、浸泡時(shí)間和浸泡次數(shù)為考察因素,篩選紫草的醇提工藝條件；以氧化苦參堿和苦參堿總含量及干膏收率為評(píng)價(jià)指標(biāo),以加水倍數(shù)、提取時(shí)間和煎煮次數(shù)為考察因素,篩選苦紫洗劑的水提工藝條件。結(jié)果：優(yōu)選醇提工藝為加10倍量95%乙醇,浸泡2次,每次12 h；優(yōu)選水提工藝為加8倍量水,提取3次,每次1 h。結(jié)論：優(yōu)選得到的提取工藝穩(wěn)定、合理、可行。

苦紫洗劑；羥基萘醌總色素；氧化苦參堿；苦參堿；提取工藝

苦紫洗劑為成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的在研醫(yī)院制劑，該方由苦參、紫草等藥味組成，為婦科用于治療老年性陰道炎疾病的經(jīng)驗(yàn)方,在臨床應(yīng)用多年，療效確切，具有清熱解毒，燥濕止癢，補(bǔ)益肝腎的功效。根據(jù)處方藥味的主要藥效成分的理化性質(zhì)，以羥基萘醌總色素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察紫草醇提工藝；以苦參堿和氧化苦參堿總量及干膏收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察其余藥味與醇提后藥渣的水提工藝，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝，為本制劑的開發(fā)研究提供工藝條件參數(shù)。

1 儀器與試藥

島津UV-210A紫外分光光度儀（日本島津公司）；HP-1100型高效液相色譜儀（G1322A 在線真空脫氣裝置、G1311A 四元梯度泵、G1313A 標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A 柱溫箱、G1315A DAD 檢測(cè)器、Agilent ChemStation B03.01工作站,美國安捷倫（惠普）公司),電子分析天平（SARTΟRIUS ，Bp211D）。

左旋紫草素對(duì)照品（批號(hào)：110769-200405），苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：110805-200508），氧化苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：110780-200506），均由中國食品藥品檢定研究院提供；紫草、苦參等飲片由四川新荷花中藥飲片股份有限公司提供；乙腈、甲醇、乙醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑為分析純。

2 醇提工藝研究

紫草萘醌類成分為紫草的主要有效成分，性質(zhì)極不穩(wěn)定，受溫度影響較大，根據(jù)藥效成分的理化性質(zhì)及預(yù)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參考相關(guān)文獻(xiàn)[1]，針對(duì)羥基萘醌類總色素的不穩(wěn)定性，為合理有效地進(jìn)行紫草有效部位的提取與制備，經(jīng)過預(yù)試，確定紫草用95%乙醇常溫浸提，以左旋紫草素為對(duì)照品計(jì)算羥基萘醌總色素含量，對(duì)紫草的提取條件進(jìn)行篩選。

2.1 羥基萘醌總色素含量測(cè)定

2.1.1 測(cè)定方法 采用紫外-可見分光光度法，檢測(cè)波長：516 nm。

2.1.2 線性范圍的考察 精密 量 取 左 旋 紫 草 素 對(duì) 照 品溶 液(0.06 mg．mL-1)1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置10 mL 量 瓶 中 ，用 乙 醇 定 容 至刻度；以95%乙醇 為 空 白 對(duì) 照，分別于516 nm處測(cè) 定 吸 光 度，以左旋紫草素含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸 收 度 為 縱 坐標(biāo) 進(jìn) 行 線 性 回 歸計(jì)算，得 回 歸 方程：Y＝2.2799 X＋0.0078（r＝0.9999）。結(jié)果：左 旋 紫 草 素 含量在0.006～0.030 mg．mL-1范圍內(nèi)吸 收 度 線 性 關(guān) 系良好。

2.1.3 樣品含量測(cè)定 分別精密吸取正交試驗(yàn)各樣品溶液2.0 mL置50 mL容量瓶中，加95%乙醇定容，搖勻即得。以95%乙醇為空白參比，于516 nm處測(cè)定吸光度，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出正交試驗(yàn)各紫草樣品中羥基萘醌總色素的含量。

2.2 醇提正交試驗(yàn)

選用正交試驗(yàn)法，以95%乙醇為溶媒，對(duì)影響紫草醇提的主要因素：乙醇用量、浸泡時(shí)間、浸泡次數(shù)進(jìn)行考察，根據(jù)預(yù)試結(jié)果選擇三個(gè)因素的水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，篩選紫草醇提工藝條件。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 醇提正交設(shè)計(jì)因素水平

稱取紫草飲片100 g，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表的條件進(jìn)行常溫浸提試驗(yàn)，提取液濾過，用95%乙醇定容至4000 mL。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2,方差分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

9 3 3 2 1 40.86 K1 103.41 101.88 91.94 106.27 K2 107.52 110.74 116.07 108.71 K3 112.86 111.17 115.78 108.81 R 3.15 3.10 8.04 0.85

表3 方差分析結(jié)果

結(jié)果：由表2直觀分析結(jié)果可知，影響提取效果的因素順序?yàn)椋?C（浸泡次數(shù)）＞ B（浸泡時(shí)間）＞A（乙醇用量），最佳醇提工藝為：A3B3C2；由表3方差分析結(jié)果可知，C因素（浸泡次數(shù)）有顯著影響，B因素（浸泡時(shí)間）與A因素（乙醇用量）無顯著影響；為節(jié)約資源，降低工業(yè)化生產(chǎn)的成本，A因素取中間值A(chǔ)2, B2和B3相差很小，B因素取B2，因此優(yōu)選醇提工藝為A2B2C2，即加10倍量95%乙醇，常溫浸泡2次，每次12 h。

2.3 醇提驗(yàn)證試驗(yàn)

取紫草100 g，共三份，按照正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果穩(wěn)定，羥基萘醌總色素平均含量為38.82 mg/g，RSD＝2.06%。

3 水提工藝研究

3.1 氧化苦參堿和苦參堿的含量測(cè)定

3.1.1 色譜條件[2-7]色譜柱為C18(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH=7.5）(12∶5∶83)；流速1.0 mL．min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長220 nm。

3.1.2 線性關(guān)系考察 精密吸取苦參堿(0.3704 mg．mL-1)和氧化苦參堿(0.2424 mg．mL-1)混合對(duì)照品溶液，按3.1.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣0.5 μL、1 μL、3 μL、5 μL、7 μL、10 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸，計(jì)算氧化苦參堿和苦參堿的回歸方程，氧化苦參堿回歸方程：Y＝822.83X＋12.121（r＝0.9999）；苦參堿回歸方程：Y＝1153.6X－5.1574（r＝0.9999）；結(jié)果表明，氧化苦參堿和苦參堿在0.1852～3.704 μg和0.1212～2.424 μg之間與峰面積呈良好線性關(guān)系。

3.1.3 樣品含量測(cè)定 分別精密吸取正交試驗(yàn)樣品液各5.0 mL置25 mL容量瓶中，加無水乙醇20 mL，超聲處理10 min，放至室溫，用無水乙醇定容，搖勻，微孔濾膜濾過（0.45 μm），取續(xù)濾液作為供試品溶液。陰性對(duì)照液為處方缺苦參的提取液按上述方法制得，分別進(jìn)樣對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照液各5 μL測(cè)定，陰性對(duì)照液色譜圖中無氧化苦參堿和苦參堿色譜峰，說明其它成分不干擾測(cè)定，見圖1。

圖1 苦紫洗劑中氧化苦參堿和苦參堿HPLC圖Ⅰ：樣品；Ⅱ：對(duì)照品；Ⅲ：陰性對(duì)照；A：氧化苦參堿；B：苦參堿Fig 1 HPLC of Oxymatrine and Matrine of Kuzi lotionⅠ：sample solution；Ⅱ： reference substance solution；Ⅲ：negative sample solution；A：Οxymatrine；B：Matrine

3.2 水提正交試驗(yàn)

采用水煎煮提取的方法，影響水提的主要因素有加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)，根據(jù)預(yù)試結(jié)果選擇三個(gè)因素的水平，按L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見表4。

表4 水提正交設(shè)計(jì)因素水平

按處方比例稱取苦參等飲片與紫草殘?jiān)布澹碙9(34)正交表安排試驗(yàn)提取，加水煎煮，濾過，合并濾液，濃縮至500 mL。按3.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定各正交提取液中氧化苦參堿和苦參堿總含量；精密吸取各正交樣品液25.0 mL，分別置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計(jì)算干膏率。以氧化苦參堿和苦參堿總含量（占70%）及干膏收率（占30%）兩項(xiàng)綜合加權(quán)評(píng)分為指標(biāo)，考察各因素對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果見表5、表6。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析表

結(jié)果：由表5直觀分析結(jié)果可知，影響提取效果的因素順序?yàn)椋?C（提取次數(shù)）＞ B（提取時(shí)間）＞A（加水量），最佳水提工藝為：A3B2C3；由表6方差分析結(jié)果可知，C因素（提取次數(shù)）對(duì)提取效果有極顯著性影響，B因素（提取時(shí)間）對(duì)提取效果有顯著性影響，A因素（加水量）對(duì)提取效果無顯著性影響，為節(jié)約資源，降低工業(yè)化生產(chǎn)成本，將A3調(diào)整為A1，因此優(yōu)選水提工藝為A1B2C3，即加8倍量水，提取3次，每次1 h。

3.3 水提驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱取飲片500 g，共三份，按照正交試驗(yàn)優(yōu)選的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果：氧化苦參堿和苦參堿總含量平均值為18.32 mg/g，RSD＝2.10%；干膏收率平均值為28.35%，RSD＝2.07%，表明該水提工藝穩(wěn)定可行。

4 討論

（1）乙酰紫草醌、紫草醌、去氧紫草素等萘醌類色素為紫草的主要有效成分[8]。萘醌類成分極不穩(wěn)定，受溫度影響較大，目前報(bào)道多采用高濃度的乙醇提取，但提取方法不一，有回流法、浸漬法、滲漉法等，不同方法對(duì)成分的破壞影響差別較大[9-12]，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紫草提取液加熱回流前后顏色發(fā)生改變，回流法得到的供試品溶液與飲片樣品、左旋紫草素對(duì)照品的紫外吸收?qǐng)D譜不一致，其原因是在乙醇回流溫度下，萘醌類色素被破壞。前期實(shí)驗(yàn)通過比較溫浸法（65 ℃）、滲漉、浸漬法、超聲法對(duì)羥基萘醌總色素含量的影響，4種提取方法得到的羥基萘醌總色素含量以滲漉法、溫浸法（65 ℃）最高，各方法差別不大，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致。超聲提取與浸漬提取相比，雖提取時(shí)間短，但提取率略低且超聲提取對(duì)設(shè)備要求高, 能耗大，超聲過程影響因素不易控制；浸漬法提取略低于滲漉法，但綜合比較來看，浸漬法作為提取萘醌類成分初始提取方法，可以節(jié)約能源，對(duì)設(shè)備要求低，操作簡便，轉(zhuǎn)移率高，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)，故以95%乙醇為溶媒，采用常溫浸漬法對(duì)紫草進(jìn)行提取。

（2）苦參加熱提取時(shí)，苦參堿和氧化苦參堿的含量存在動(dòng)態(tài)變化[13-14]，鑒于此原因，在水提工藝研究時(shí)，含量測(cè)定以氧化苦參堿和苦參堿的總含量為指標(biāo)。

（3）苦參為本處方的君藥，苦參堿和氧化苦參堿為本處方主要藥效成分，其含量的高低直接影響著藥效的發(fā)揮，因此水提工藝研究時(shí)給予苦參堿和氧化苦參堿的總含量70%的加權(quán)系數(shù)。

[1] 馮文文,李國玉,譚勇,等.新疆紫草中萘醌類成分的提取工藝研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,29(1):67-70.

[2] 羅美蘭,廖銀根,王文,丁志軍.復(fù)方苦蛇黃洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(13):131-133.

[3] 張善玉,姜艷玲,申英愛.抗婦炎膠囊中苦參堿和氧化苦參堿的含量測(cè)定[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2006,17(5):728-729.

[4] 李華榮,高逢喜.HPLC法測(cè)定婦舒能洗劑中氧化苦參堿的含量測(cè)定[J].中國藥師,2009,12(5):620-621.

[5] 王小龍,葉曉婭.不同提取工藝對(duì)制霉洗劑中苦參堿與氧化苦參堿含量的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2009,28(5):645-646.

[6] 張薇,陳浩浩,范華均等.不同微波輔助法提取苦參生物堿的比較[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(20):34-38.

[7] 毛 丹,陳 鈳,王 柯等.HPLC法測(cè)定苦參軟膏中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿[J].中成藥,2011,33(9):1531-1534.

[8] 陰健,郭力弓.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用[M].北京:學(xué)苑出版社,1993:6341.

[9] 吳學(xué)淵,劉萍.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選紫草的醇提工藝[J].中國醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析,2008,8(10):750-752.

[10] 校合香,萬明,陳洪燕等.均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化紫草的醇提工藝[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2008,28(1):381-384.

[11] 劉曉華,易建勇.紫草提取純化工藝優(yōu)選及穩(wěn)定性研究[J].中藥材,2001,24(5):3571-3573.

[12] 楊秀芳.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選紫草的提取工藝[J].中成藥,2005,27(3):3511-3513.

[13] 陸蘊(yùn)如,楊鐘柯,董育妹.苦參在復(fù)方中化學(xué)成分變化的研究[J].中國中藥雜志,1996,21(7):412-414.

[14] 江海燕, 陳勇, 張輝.苦參不同炮制品中苦參堿和氧化苦參堿含量測(cè)定[J].中成藥,2001,23(3):185-187.

(責(zé)任編輯：傅舒)

Study on extraction process of Kuzi lotion with orthogonal test/

FAN Shi-zhong1, GUO Hua2, ZENG Qian1, TAN Jing1, YUAN Qiang-hua1//( 1.Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan;2. Dazhu County Food and Drug Insititute, Dazhou 635100, Sichuan)

Objective: To optimize extraction process of Kuzi lotion. Method: With L9(34) orthogonal test, the investigation factors influencing Zicao alcohol extraction conditions including alcohol volume, extraction time, extraction times were optimized with hydroxy naphthoquinone content as index. The investigation factors influencing water extraction conditions of Kuzi lotion including water volume, boiling times and extraction times were optimized with the contents of oxymatrine and matrine and dry extraction rate as indexes. Result: The optimal alcohol extraction conditions were as follows: reflux extracting 2 times with 10-fold 95% alcohol, 12 hours each time. The optimal water extraction conditions were as follows: extracting 3 times with 8-fold water, 1 hour each time. Conclusion: The optimum extraction process is reasonable, feasible and stable.

Kuzi lotion; hydroxy naphthoquinone; oxymatrine; matrine; extraction process

R 284.2

A

1674-926X(2016)04-005-04

成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院基金項(xiàng)目(2009-D-YY-44)

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072 2.大竹縣食品藥品檢驗(yàn)所，四川 達(dá)州 635100

范世忠（1976－），男，本科，主管藥師，研究方向?yàn)樗巹W(xué)及藥事管理，

Tel:028-87783251 Email:fanshzh@126.com

2015-8-2