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    突觸體制備方法研究

    2016-12-19 07:28:22周榮易王嬌嬌綜述韓新民審校
    關(guān)鍵詞:密度梯度離心法蔗糖

    周榮易, 王嬌嬌綜述, 韓新民審校

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    突觸體制備方法研究

    周榮易, 王嬌嬌綜述, 韓新民審校

    突觸(synapse),即是指一個(gè)神經(jīng)元與另一個(gè)神經(jīng)元相接觸的部位,突觸是神經(jīng)元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位,也是信息傳遞的關(guān)鍵部位。由于其特殊位置和作用,突觸是探討腦功能的關(guān)鍵所在[1]。在現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)及眾多其他學(xué)科的研究中,突觸的作用日益得到重視。從中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離出形態(tài)完整,活性較高的突觸體是進(jìn)行離體神經(jīng)生理、生化和藥理研究的前提。但國(guó)內(nèi)相關(guān)制備技術(shù)卻鮮有報(bào)道。國(guó)外突觸體制備技術(shù)從發(fā)明至今已從最初的不連續(xù)性蔗糖密度梯度法發(fā)展到隨后的改進(jìn)方法及Ficoll/sucrose法直至現(xiàn)在的不連續(xù)性Percoll密度梯度離心法,其方法不斷改進(jìn),技術(shù)不斷革新,為現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)研究提供了保障。通過(guò)查閱搜集大量國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),總結(jié)國(guó)外突觸體制備技術(shù),介紹國(guó)外突觸體制備技術(shù)的發(fā)展和先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用,以備參考。

    1 突觸體

    突觸體(synaptosome),這一專有名稱最早是于1964年由Whittaker和他的團(tuán)隊(duì)提出,并被他們通過(guò)離心方法提取出來(lái)[2]。突觸體是指具有突觸區(qū)完整形態(tài)結(jié)構(gòu)的封閉顆粒,實(shí)際上它是斷裂脫落的神經(jīng)末梢或突觸連接區(qū),從某種意義上講,它可以被認(rèn)為是一個(gè)具有功能完整的活細(xì)胞[3],突觸體之所以能被離體制備,根本在于其突觸間連接的牢固性和突觸裂口區(qū)的自動(dòng)融合性,這些特性能夠使斷裂的神經(jīng)末梢完整保存突觸區(qū)的各種成分及其功能,保留著活細(xì)胞的一系列特性[3]。這就使得突觸體的分離和離體實(shí)驗(yàn)變得可能且具有研究?jī)r(jià)值。自20世紀(jì)60年代突觸體分離成功,突觸體分離技術(shù)促進(jìn)了神經(jīng)生物學(xué)的快速發(fā)展,離體突觸生理、生化及藥理研究等大大促進(jìn)了人們對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的認(rèn)知。研究報(bào)道,海馬神經(jīng)元突觸體的損傷與數(shù)量的減少與老年人的記憶力減退密切相關(guān)[4,5]。另有相關(guān)報(bào)道證實(shí)突觸體的受損與減少同樣會(huì)導(dǎo)致小鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力下降[6]。因此,制備結(jié)構(gòu)完整、高活性的突觸體是進(jìn)行神經(jīng)生物學(xué)研究的前提。

    2 制備方法

    從20世紀(jì)60年代突觸體分離成功至今,突觸體的分離和純化方法得到了不斷的改進(jìn),所提取的突觸體形態(tài)結(jié)構(gòu)保存不斷完整;生理活性不斷提高;同時(shí),隨著方法的不斷完善和革新,提取率也有所上升。突觸體為生物化學(xué)和藥理學(xué)對(duì)神經(jīng)末梢的研究和神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)體外研究提供了良好的研究對(duì)象[7]。現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)研究中,制備形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、具有生理活性和較高產(chǎn)出率的突觸體,是進(jìn)行神經(jīng)生物學(xué)進(jìn)一步分析研究的基礎(chǔ)。從突觸體命名至今,突觸體的制備與純化和其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的提取和純化方法大致相同,主要可分為不連續(xù)性蔗糖密度梯度離心法(蔗糖法)[2,8]、經(jīng)典方法的改進(jìn)型方法[9]、和不連續(xù)性Percoll 密度梯度離心法[10]3種。

    2.1 不連續(xù)性蔗糖密度梯度離心法 不連續(xù)性蔗糖密度梯度離心法,其基本原理是利用蔗糖或蔗聚糖等小分子溶液,根據(jù)所離心的組織勻漿液的不同分子量,預(yù)先配制好不連續(xù)性濃度梯度,根據(jù)不同分子量組織在離心力和重力作用下的通透性和沉降速率不同,將勻漿液等置于梯度液頂層離心,在離心力和重力作用下,不同分子量的組織會(huì)在梯度液中分層分離,根據(jù)已知所需組織的生物學(xué)特點(diǎn),判斷其分層位置后取出進(jìn)行相關(guān)研究。該方法于上世紀(jì)60年代最先由Whittaker等人運(yùn)用,被奉為突觸體制備的經(jīng)典方法,至今仍然在許多組織提取和純化實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用,運(yùn)用領(lǐng)域十分廣泛。其大致操作流程如圖1所示:

    圖1 經(jīng)典方法制備突觸體[2,8]

    1996年中國(guó)臺(tái)灣學(xué)者Tong等[7]為研究泌尿系統(tǒng)膀胱的神經(jīng)生理學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)作用,運(yùn)用該方法嘗試從膀胱組織中提取突觸體并獲得成功,簡(jiǎn)要操作步驟如下:(1)3月齡大的Wistar 大鼠,斷頭處死,沿腹白線快速取出膀胱;(2)迅速稱重,用剪刀將膀胱剪為長(zhǎng)度為2~5 mm的碎片;(3)將碎片置于含有濃度3 mmol/L,pH值為7.2的鈉磷酸鹽的0.32 mol/L的蔗糖液中勻漿;實(shí)驗(yàn)所有操作均在4 ℃條件下進(jìn)行;(4)勻漿液1000 r/min離心10min;(5)將所得顆粒物質(zhì)按上一步驟再次離心;(6)將離心后漂浮物收集17000 r/min離心20 min;(7)將顆粒物放入1.5 ml的0.32 mol/L的蔗糖液再懸浮并低速短暫離心;(8)按照Gray and Whittaker[8]的蔗糖梯度離心法將顆粒物置于梯度液;(9)梯度液超高速離心機(jī)100000 r/min離心60 min;(10)取位于0.8~1.2 M梯度帶上的微粒物質(zhì),用標(biāo)準(zhǔn)液5倍稀釋并低溫離心機(jī)5000 r/min離心30 min,將微粒物置于1 ml的標(biāo)準(zhǔn)液中再懸浮,配方如下:NaCI 132 mmol/L,KCI 5 mmol/L,CaCl21.2 mmol/L,MgCI21.3 mmol/L,NaH2PO41.2 mmol/L,glucose 10 mmol/L,Tris-base 20 mmol/L;調(diào)pH至7.4,置于室溫環(huán)境。該方法作為經(jīng)典的提取方法,應(yīng)用范圍廣泛,可以對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)末梢進(jìn)行提取和純化,在被報(bào)道后的幾十年間受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視和應(yīng)用。

    2.2 改進(jìn)型方法 經(jīng)典的蔗糖梯度離心法應(yīng)用廣泛,為突觸體制備和研究做出了巨大貢獻(xiàn)。但同時(shí)也存在制備時(shí)間長(zhǎng),高速離心次數(shù)過(guò)多和時(shí)間過(guò)長(zhǎng),無(wú)法保證突觸體結(jié)構(gòu)完整性等不足。最初階段,為了提高效率,對(duì)于需要突觸體進(jìn)行遞質(zhì)分析的工作,多數(shù)學(xué)者直接運(yùn)用P2部分(P2部分相當(dāng)于離心后粗制線粒體部分,包含突觸體、線粒體和細(xì)胞膜等)進(jìn)行。但P2部分含有線粒體和溶酶體等相關(guān)的酶類(lèi),不同程度地干擾了遞質(zhì)分泌和代謝進(jìn)程[1]。為了糾正這些缺點(diǎn),學(xué)者在運(yùn)用過(guò)程中不斷進(jìn)行改進(jìn)以縮短制備時(shí)間,提高突觸體純度。1978年,有學(xué)者運(yùn)用Ficoll/sucrose[9]方法制備突觸體。作為一種制備方法,該方法和經(jīng)典方法在原理和操作上有諸多相同,在此不做贅述。在突觸體中,突觸前神經(jīng)末梢在結(jié)構(gòu)上是比較牢固的,在勻漿時(shí),神經(jīng)元破碎而突觸區(qū)仍可保留完整性。將組織放入等滲介質(zhì)中勻漿,再用差速離心法分離勻漿液中各亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分。紋狀體在調(diào)控大腦對(duì)行為能力和其他重要的認(rèn)知能力方面具有重要作用,它主要接收來(lái)自大腦黑質(zhì)區(qū)、丘腦區(qū)和大腦皮質(zhì)的信息并加以處理,丘腦區(qū)和腦皮質(zhì)主要傳輸興奮性的信息,這一作用可能與谷氨酸受體有關(guān),為了研究證實(shí)突觸前膜促代謝性谷氨酸受體(mGlu receptor)激活調(diào)控谷氨酸的釋放,1995年,國(guó)外學(xué)者East等[11]在前人方法基礎(chǔ)上運(yùn)用了如下方法制備突觸體,具體步驟如下圖2:

    圖2 突觸體提取步驟[11]

    East等人的方法是在密度梯度離心法的基礎(chǔ)上根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室的條件和經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來(lái),采用差速離心法,部分改進(jìn)了經(jīng)典方法,降低了實(shí)驗(yàn)難度,提高了制備效率。1997年,日本學(xué)者[12]在NO抑制腦內(nèi)突觸體對(duì)5-HT的吸收作用的研究中,研究人員運(yùn)用差異離心法制備突觸體觀察突觸體與5-HT在不同劑量NO作用下的關(guān)系變化,他們所用的突觸體的制備方法和該方法大致相同,也是根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行簡(jiǎn)單修改,可供參考。

    2.3 不連續(xù)性Percoll 密度梯度離心法 Percoll 是一種含有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20 mosm/kg H2O),粘度也很小,可形成高達(dá)1.3 g/ml密度,采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力(200~1000 r/min)于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。由于 Percoll 擴(kuò)散常數(shù)低,所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外,Percoll不穿透生物膜,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害,因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒,還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。經(jīng)典的蔗糖密度梯度離心法和在運(yùn)用過(guò)程中的相關(guān)改進(jìn)方法,均可以制備出突觸體,但有諸多的不足。近年來(lái),隨著Percoll試劑的廣泛運(yùn)用和推廣,不連續(xù)性Percoll 密度梯度離心法制備突觸體技術(shù)日趨成熟,其制備的突觸體以其諸多優(yōu)勢(shì)被國(guó)外學(xué)者所采用。2008年,Nature Protocols雜志對(duì)該方法進(jìn)行詳細(xì)報(bào)道[13],并對(duì)該方法的優(yōu)勢(shì)及詳細(xì)步驟進(jìn)行介紹。這更使得該方法在國(guó)外突觸體制備技術(shù)上逐漸占據(jù)主導(dǎo)和領(lǐng)先地位。該方法自80年代被Nagy等人[10]報(bào)道以來(lái),運(yùn)用范圍不斷擴(kuò)大,并不斷改進(jìn)而趨于成熟。如Bai and Witzmann[14];Whittaker[15],Hajos[16]等都運(yùn)用Percoll密度梯度離心法成功制得符合研究要求的突觸體。根據(jù)2008年Nature Protocols雜志對(duì)該方法的詳細(xì)報(bào)道,具體實(shí)驗(yàn)步驟如圖3:

    圖3 不連續(xù)性Percoll密度梯度離心法[13]

    除此之外,近幾年不斷有人在此方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)和完善,使得該方法更加高效便捷。2011年,Westmark等人[17]根據(jù)自己的制備經(jīng)驗(yàn),對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化,使得突觸體的制備更加簡(jiǎn)便。為節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間和人力,制備出更高質(zhì)量的突觸體,2014年Murphy等人[18]發(fā)明了高通量、半自動(dòng)化的制備儀器(eg. FastPrep Tissue and Cell Homogenizer,MP Biomedical,Santa Ana,CA,USA,#116004500,et al. )來(lái)提高突觸體制備的效率。根據(jù)他們的報(bào)道,運(yùn)用這一設(shè)備,他們的制備時(shí)間降至約35 min,這和傳統(tǒng)方法的4~5 h相比,大大節(jié)省了研究人員的實(shí)驗(yàn)時(shí)間和勞動(dòng)量,為突觸體的制備提供了嶄新的途徑,這一技術(shù)可能使突觸體的制備和神經(jīng)生物學(xué)研究邁入快車(chē)道。

    3 討 論

    突觸體作為一個(gè)可被看作是具有完整結(jié)構(gòu)和功能的活細(xì)胞的脫落神經(jīng)末梢,它的成功制備是能夠進(jìn)行體外神經(jīng)生理、神經(jīng)病理和神經(jīng)遞質(zhì)分泌等相關(guān)研究的前提。制備結(jié)構(gòu)完整、具有活性的突觸體,既是完成實(shí)驗(yàn)研究的必然要求,也應(yīng)該是從事神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病實(shí)驗(yàn)研究人員的必備技能。在國(guó)內(nèi),目前這一工作的開(kāi)展還不普及,制約了相關(guān)學(xué)科實(shí)驗(yàn)研究的發(fā)展。雖然不連續(xù)性蔗糖密度梯度離心法在國(guó)內(nèi)有部分實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用比較成熟[19,20],但該技術(shù)相對(duì)比較落后,存在制備時(shí)間較長(zhǎng)、突觸體完整性較差、梯度液易混淆等不足。隨著實(shí)驗(yàn)研究的不斷進(jìn)步,經(jīng)典方法得到不斷改進(jìn)以彌補(bǔ)該方法的不足。East等人在經(jīng)典方法基礎(chǔ)上的改進(jìn)方法操作流程簡(jiǎn)單,不需要配制密度梯度液,部分糾正了經(jīng)典方法的不足。但該法制備的突觸體純度和產(chǎn)出率較低,其活性有待檢測(cè),對(duì)于一般的突觸體分析比較適宜,而對(duì)要求較高的神經(jīng)分子生物學(xué)研究則需進(jìn)一步純化。不連續(xù)性Percoll密度梯度離心法作為一種新方法,2008年,Nature Protocols[13]完整介紹了Percoll密度梯度離心法并總結(jié)了該方法的優(yōu)缺點(diǎn)。Percoll梯度液的優(yōu)點(diǎn):(1)目前最快速的制備有活性的突觸體的方法。(2)全程是在等滲條件下進(jìn)行,對(duì)突觸體有很好保護(hù)性。(3)不需超高速離心,最大限度保證突觸體結(jié)構(gòu)完整性。(4)制備的突觸體具有較高活性。(5)花費(fèi)時(shí)間較少,所制得突觸體運(yùn)用范圍廣泛。存在的不足:(1)高純度的突觸體產(chǎn)出率相對(duì)較低,主要集中在第4梯度帶,但對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)可以將3~4梯度帶一同收集。(2)Percoll梯度液配制較費(fèi)時(shí),但該梯度液可以在實(shí)驗(yàn)前不超過(guò)24 h內(nèi)提前配制備用。(3)該方法對(duì)離心機(jī)有特殊要求等。該方法作為目前較先進(jìn)的制備方法在國(guó)外應(yīng)用越發(fā)廣泛,其諸多優(yōu)勢(shì)可填補(bǔ)經(jīng)典方法的不足,但國(guó)內(nèi)對(duì)關(guān)于這一技術(shù)制備突觸體的有關(guān)文獻(xiàn)僅有兩篇[21,22],且實(shí)驗(yàn)路線介紹比較簡(jiǎn)略。此外,國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室對(duì)突觸體制備技術(shù)的報(bào)道文獻(xiàn)很少且大都限于經(jīng)典技術(shù)路線,這大大制約了國(guó)內(nèi)相關(guān)方面的研究進(jìn)程。顯而易見(jiàn),突觸體的制備是一項(xiàng)十分有意義且要求相對(duì)較高的技術(shù),它能將神經(jīng)生物學(xué)的研究帶入離體實(shí)驗(yàn)階段,從微觀上進(jìn)行深入分析。同時(shí),在此離體研究的基礎(chǔ)上,若能和整體研究相結(jié)合,必然能促進(jìn)神經(jīng)生理、神經(jīng)病理、神經(jīng)生物學(xué)的研究。相信隨著國(guó)內(nèi)研究工作的深入發(fā)展,突觸體的制備技術(shù)必然會(huì)被眾多學(xué)科重視運(yùn)用,為國(guó)內(nèi)神經(jīng)生物學(xué)的研究做出貢獻(xiàn)。

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    1003-2754(2016)03-0280-03

    Q421;R338.1+3

    2015-01-30;

    2016-02-28

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81273801)

    (南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所,江蘇 南京 210023)

    韓新民,E-mail:hxm1nj@163.com

    綜 述

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