丁基苯酞對(duì)帕金森模型小鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)及TH、TNF-α蛋白表達(dá)的影響

耿海威， 馬麗麗， 王欲立， 楊 洋， 王占友， 聶瑩雪

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丁基苯酞對(duì)帕金森模型小鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)及TH、TNF-α蛋白表達(dá)的影響

耿海威1， 馬麗麗1， 王欲立2， 楊 洋2， 王占友3， 聶瑩雪4

目的 研究丁基苯酞(dl-3n-butylphthalide，NBP)對(duì)由MPTP誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠帕金森模型中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)及TH、TNF-α蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其保護(hù)機(jī)制。方法 24只C57BL/6小鼠，隨機(jī)分成3組：正常對(duì)照組，MPTP組，NBP治療組。MPTP腹腔注射法制備帕金森模型，免疫組織化學(xué)法觀察中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)，蛋白質(zhì)印跡法觀察中腦黑質(zhì)TH、TNF-α蛋白含量的變化。結(jié)果 (1)與正常對(duì)照組比較，MPTP組可見(jiàn)帕金森病小鼠中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元明顯減少(P<0.01)；與MPTP組比較，NBP治療組帕金森病小鼠中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加(P<0.01)；(2)與正常對(duì)照組比較，MPTP組帕金森病模型小鼠中腦黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)減少(P<0.01)，而TNF-α蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；(3)與MPTP組比較，NBP治療組帕金森病模型小鼠中腦黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，而TNF-α蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。結(jié)論 丁基苯酞可能通過(guò)提高中腦黑質(zhì)中TH的含量及減少TNF-α炎性介質(zhì)表達(dá)發(fā)揮對(duì)MPTP所致C57BL/6小鼠帕金森模型的神經(jīng)元保護(hù)作用。

丁基苯酞； MPTP； TH； TNF-α

帕金森病(Parkinson disease，PD)為中老年人常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其病理基礎(chǔ)是以中腦黑質(zhì)致密部多巴胺(DA)能神經(jīng)元大量變性、紋狀體多巴胺遞質(zhì)含量顯著減少為特征，其紋狀體多巴胺遞質(zhì)含量的降低程度與多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目的減少程度相一致[1，2]。近年來(lái)，一直試圖尋找有效的神經(jīng)保護(hù)藥物，以阻止神經(jīng)元變性和疾病進(jìn)展。丁基苯酞(dl-3n-butylphthalide)可有效阻斷缺血性腦卒中的多個(gè)病理環(huán)節(jié)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)治療，在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等發(fā)病機(jī)制方面與帕金森病有共通點(diǎn)，目前尚缺乏丁基苯酞抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮對(duì)帕金森病神經(jīng)保護(hù)的文獻(xiàn)報(bào)道[3，4]。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)研究丁基苯酞對(duì)MPTP誘導(dǎo)的C57BL/6帕金森模型小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量及TH、TNF-α的蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討丁基苯酞對(duì)帕金森多巴胺能神經(jīng)元的炎性保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 24只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為3組，每組各8只。(1)正常對(duì)照組(NS+植物油)：腹腔注射與MPTP組等體積生理鹽水5 d，再注射與治療組等體積植物油14 d；(2)MPTP組(MPTP+植物油)：MPTP( 30 mg/kg) 連續(xù)5 d腹腔注射，然后改用生理鹽水注射14 d；(3)治療組( NBP+MPTP)：MPTP( 30 mg/kg) 連續(xù)腹腔注射5 d，然后NBP(40 mg/kg)腹腔注射14 d(NBP由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供，植物油溶解后使用)。

1.2 帕金森動(dòng)物模型的制備 月齡C57BL/6小鼠24只，體重20～30g，MPTP( 40 mg/kg) 連續(xù)腹腔注射5 d，間隔24 h。注射藥物后小鼠即刻出現(xiàn)步態(tài)蹣跚，易激惹，毛及鼠尾豎起，抓鼻，全身抽搐等反應(yīng)，約5～10 min 后恢復(fù)常態(tài)，即視為模型制備成功。

1.3 免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本制備 每組動(dòng)物于19 d處死后取腦組織進(jìn)行固定石蠟包埋，取中腦黑質(zhì)部位切片進(jìn)行免疫組化染色。(1)烘片( 60～65 ℃) 4 h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，0.01 mmol /L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細(xì)胞3次，5 min /次，新鮮配制的 3%過(guò)氧化氫室溫下反應(yīng) 10 min，0.01 mmol /L磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞3次，5 min/次，微波修復(fù)(檸檬酸緩沖液)，高火3.5～4 min，使其快速達(dá)到95 ℃，然后自然冷卻至室溫。0.01 mmol /L磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞3次，5 min/次，5%羊血清37 ℃封閉1 h，去掉多余羊血清后加入兔抗小鼠 TH 抗體(1∶200)、GFAP 抗體(1∶1000)，4 ℃過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫1 h，0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞3次，5 min /次，加入生物素化羊抗兔、抗鼠IgG(1∶50)，置 37 ℃室溫下反應(yīng)1 h，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的ABC復(fù)合物于37 ℃室溫下反應(yīng)1 h，0.01 mmo/L磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞3次，5 min /次，DAB顯色，室溫下反應(yīng) 5～10 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。(2)陽(yáng)性結(jié)果判定：根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中 DAB 被辣根過(guò)氧化物酶氧化后呈現(xiàn)棕黃色的原理，進(jìn)行陽(yáng)性結(jié)果判定，免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色。對(duì)每張切片中腦黑質(zhì)特定高倍視野下全部陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè) 將分離的黑質(zhì)組織按比例加入裂解液(1 mmol/L Tris，50 mmol/L氯化鈉，0.03 μmol/L焦磷酸鈉，50 mmol/L氟化鈉，1% Triton X-100，1 mmol/L苯甲基-磺酰氟，1 mmol/L釩酸鈉，20 μg/ml抑肽酶)制成 50 mg/ml勻漿液，15000 r /min、4 ℃離心15 min，上清液80 ℃保存，采用二辛可寧酸( bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定裂解液中的總蛋白質(zhì)含量；組織勻漿中加入2×樣品緩沖液對(duì)半稀釋，煮沸 5 min，6000 r/min 離心3 min，取上清液上樣，取30 μg樣品進(jìn)行10%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，分離蛋白質(zhì)；轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉2 h，加入一抗，置4 ℃過(guò)夜，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、抗鼠IgG(1∶1000，美國(guó)sigma公司)于室溫下孵育1 h，采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)(美國(guó) sigma公司)顯示蛋白條帶，感光在膠片上。

2 結(jié) 果

2.1 中腦黑質(zhì)TH免疫組織化學(xué)結(jié)果 正常對(duì)照組中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)正常，呈條帶狀；MPTP組與正常對(duì)照組比較TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目減少，稀疏、散在，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NBP組與MPTP組比較TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目增多，細(xì)胞排列較整齊，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量變化

*P<0.05，**P<0.01

圖1 中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)變化(×40倍)

圖2 中腦黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)的變化

圖3 中腦黑質(zhì)蛋TNF-α蛋白表達(dá)的變化

2.2 中腦黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)的變化 MPTP組中腦黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組降低明顯，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；NBP組與MPTP組比較中腦黑質(zhì)TH蛋白含量明顯升高，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

2.3 中腦黑質(zhì)蛋TNF-α蛋白表達(dá)的變化 MPTP組中腦黑質(zhì)TNF-α蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；NBP組與MPTP組比較中腦黑質(zhì)中TNF-α蛋白表達(dá)降低，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

3 討 論

帕金森病( Parkinson disease，PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床以靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩等為主要表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制除與多種遺傳基因突變及環(huán)境毒素有關(guān)外，氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、鈣超載、細(xì)胞凋亡等均可能參與其發(fā)病機(jī)制形成。當(dāng)前抗帕金森藥物治療主要以延緩其病情進(jìn)展為主，目前尚沒(méi)有任何一種藥物可有效阻止其進(jìn)展，考慮多種機(jī)制共同參與，因此多靶點(diǎn)協(xié)同治療可能有效[5]。在本實(shí)驗(yàn)中，丁基苯酞對(duì)MPTP所致帕金森小鼠模型有神經(jīng)保護(hù)作用，主要通過(guò)提高中腦黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶的含量及下調(diào)TNF-α的表達(dá)起作用。

帕金森病的病理改變主要是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性、缺失為主要表現(xiàn)，腦內(nèi)多巴胺含量下降至一定程度時(shí)可出現(xiàn)臨床癥狀，而酪氨酸羥化酶是中腦黑質(zhì)多巴胺合成的重要限速酶，酪氨酸羥化酶的變化與腦內(nèi)多巴胺變化呈正相關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)中，MPTP組黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量較正常對(duì)照組明顯下降，且TH蛋白表達(dá)降低更明顯，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；NBP組與MPTP組比較黑質(zhì)中多巴胺能陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量及酪氨酸羥化酶的蛋白含量明顯升高，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；因此，丁基苯酞可能通過(guò)增加黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶的表達(dá)而增加多巴胺含量對(duì)帕金森病起保護(hù)作用。

帕金森病中腦黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞含量相對(duì)較為集中，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-1等，這些細(xì)胞因子參與多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，同時(shí)參與到帕金森病發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段，而TNF-α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在帕金森病炎性機(jī)制的研究較多，是一種在文獻(xiàn)中得到證實(shí)的前炎癥因子[7，8]。本實(shí)驗(yàn)中，MPTP組中腦黑質(zhì)TNF-α蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；NBP組與MPTP組比較中腦黑質(zhì)中TNF-α蛋白表達(dá)降低，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；因此，丁基苯酞可能通過(guò)降低中腦黑質(zhì)中TNF-α蛋白表達(dá)，減輕其炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮其對(duì)帕金森病保護(hù)作用。

綜上所述，丁基苯酞可能通過(guò)提高中腦黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶含量及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)的表達(dá)發(fā)揮對(duì)MPTP誘導(dǎo)C57BL/6小鼠帕金森模型的神經(jīng)元保護(hù)作用。因此，丁基苯酞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，如帕金森病等有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究有待于進(jìn)一步探討。

[1]Jiang J，Kim JJ，Kim DY，et al. Acorusgramineus inhibits microglia mediated neuroinflammation and prevents neurotoxicity in 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced mouse model of Parkinson’s disease[J]. Ethnopharmacol，2012，144(3)：506-513.

[2]Gaven F，Marin R，Claeysen S. Primary culture of mouse dopaminergic neurons[J]. Visualized Experiments，2014(91)：e51751-e51751.

[3] Li L，Zhang B，Tao Y，et al. DL-3-n-butylphthalide protects endothelial cells against oxidative/nitrosative stress，mitochondrial damage and subsequent cell death after oxygen glucose deprivation in vitro[J]. Brain Res，2009(1290)：91-101.

[4]Rekha KR，Selvakumar GP. Gene expression regulation of Bcl2，Bax and cytochrome-C by geraniol on chronic MPTP/probenecid induced C57BL/6 mice model of Parkinson’s disease[J]. Chem Biol Interactions，2014，217：57-66.

[5]Huang JZ，Chen YZ，Su M，et al. DL-3-n-Butylphthalide prevents oxidative damage and reduces mitochondrial dysfunction in an MPP+-induced cellular model of Parkinson’s[J]. Neurosci Let，2010，475(2)：89-94.

[6]Huang DY，Ye M. Microglia and Parkinson’s disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2012，16(24)：4549-4554.

[7]Tsai SJ，Kuo WW，Liu WH，et al. Antioxidative and anti-inflammatory protection from carnosine in the striatum of MPTP-treated mice[J]. Agricultural & Food Chemistry，2010，58(21)：11510-11516.

[8]Shinji S. The association of Parkinson’s disease pathogenesis with inflammation[J]. Clinic Neurol，2014，54(12)：1125-1127.

The Effect of dl-3n-Butylphthalide on the substantia nigra of midbrain dopaminergic neurons and the protein expression of TH and TNF-α in the MPTP model of Parkinson’s disease

GENG Haiwei，MA Lili，YANG yang，et al.

(The Center Hospital of Kaifeng，Kaifeng 475000，China)

Objective To detect the Effect of dl-3n-Butylphthalide on the substantia nigra of midbrain dopaminergic neurons and the protein expression of TH and TNF-α in the MPTP model of Parkinson’s disease in C57BL/6 mice，to investigate the protection mechanism. Methods The twenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into normal group(NOR)，MPTP group and NBP group. To prepare Parkinson’s disease model through intraperitoneal injection of MPTP. The TH positive neurons cells in the substantia nigra of midbrain were observed by immunohistochemical method，the protein expression of TH and TNF-α in the substantia nigra of midbrain were observed by Western blot. Results (1)Compared with the normal group，The the TH positive neurons cells in the substantia nigra of midbrain was markedly decreased(P<0.01)；Compared with the MPTP group，The the TH positive neurons cells in the substantia nigra of midbrain was markedly increased(P<0.01)；(2)Compared with the normal group，the protein expression of TH in the substantia nigra of midbrain was markedly decreased(P<0.01)，the protein expression of TNF-α was significantly increased(P<0.05)；Compared with the MPTP group，the protein expression of TH in the substantia nigra of midbrain was markedly increased(P<0.01)，the protein expression of TNF-α was significantly decreased(P<0.05)；Conclusion dl-3n-Butylphthalide might play a neuroprotective role on the MPTP model of Parkinson’s disease in C57BL/6 mice through increase the content of TH in the substantia nigra of midbrain and reduce the TNF-α expression of inflammatory mediators.

Dl-3n-butylphthalide； MPTP； TH； TNF-α

1003-2754(2016)03-0245-03

2015-11-12；

2015-12-28

(1.開(kāi)封市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 開(kāi)封 475000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110001；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110001；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

聶瑩雪，E-mail：nieyingsnow@163.com

R742.5

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