帕金森病患者外周血Th17/Treg平衡及相關(guān)細(xì)胞因子水平測定及意義

姜立剛， 慕振興， 孫博謙

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帕金森病患者外周血Th17/Treg平衡及相關(guān)細(xì)胞因子水平測定及意義

姜立剛， 慕振興， 孫博謙

目的 探討帕金森病(PD)患者外周血Th17/Treg平衡及相關(guān)細(xì)胞因子含量變化的意義。方法 收集50例PD患者(PD組)及50例健康體檢者(Control組)，采集所有研究對象外周血。采用流式細(xì)胞儀檢測外周血中Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞含量；采用ELISA檢測血漿中細(xì)胞因子TGF-β、IL-6和IL-17水平。結(jié)果 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，PD組的外周血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞水平較Control組均顯著增加(P均<0.01)，Treg細(xì)胞的增長程度明顯大于大于Th17細(xì)胞，同時(shí)PD組Treg/Th17細(xì)胞比較Control組也明顯增加(P均<0.01)。ELISA檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，PD組的血漿TGF-β1、IL-6及IL-17含量均有顯著增加(P均<0.01)。結(jié)論 PD患者的外周血Treg/Th17平衡存在失衡，提示PD病理過程可能與其外周血Treg/Th17失衡有關(guān)。

帕金森病； Th17細(xì)胞； Treg細(xì)胞； TGF-β1； IL-6

帕金森病(PD)是一種由大腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元減少及腦區(qū)域α-突出核蛋白沉淀引起的神經(jīng)退化性疾病，腦黑質(zhì)神經(jīng)元缺少導(dǎo)致紋狀體多巴胺的減少并出現(xiàn)一些運(yùn)動(dòng)性癥狀如運(yùn)動(dòng)遲緩、僵直及震顫等[1～3]。目前PD的神經(jīng)元退化機(jī)制尚未研究透徹，可能涉及α-突出核蛋白聚集、氧化應(yīng)激、線粒體復(fù)合物I活性缺失、鐵含量增加及蛋白質(zhì)加工程序的改變等，而根據(jù)近年來流行病學(xué)和遺傳學(xué)的研究，PD的進(jìn)展也和神經(jīng)炎癥過程存在相關(guān)性[4，5]。炎癥反應(yīng)通常與免疫反應(yīng)有關(guān)，Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞作為重要的T細(xì)胞亞型，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用，Th17細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子，具有增強(qiáng)和促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，與Treg細(xì)胞的生理功能相互拮抗，因此當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥等問題時(shí)，Th17/Treg細(xì)胞平衡比例將會(huì)發(fā)生變化[6～8]。這些研究結(jié)果提示引起帕金森病的神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能也會(huì)導(dǎo)致血清中Th17/Treg細(xì)胞平衡比例發(fā)生變化，然而在目前的研究中，尚未見有關(guān)PD患者血清中Th17/Treg細(xì)胞平衡比例變化的報(bào)道。本文研究了50例PD患者及50例健康體檢者，分別比較兩組志愿者外周血Th17/Treg細(xì)胞比例差異，并檢測血清中相關(guān)細(xì)胞因子如TGF-β1、IL-6表達(dá)水平，探討血清中Th17/Treg比例及相關(guān)細(xì)胞因子如TGF-β1、IL-6在PD發(fā)生發(fā)展過程中的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Thermo Scientific公司；胎牛血清購自美國Life Technologies公司；佛波酯PMA、離子霉素、莫能菌素、抗人IL-17A的FITC標(biāo)記的單抗、抗人CD127的PE標(biāo)記單抗購自美國eBioscience公司；抗人CD3的PE-cy5標(biāo)記單抗、抗人CD8的PE標(biāo)記單抗、抗人CD4的FITC標(biāo)記單抗及抗人CD25的PE-cy5標(biāo)記單抗購自美國Beckman Coulter公司；紅細(xì)胞裂解液購自美國Invitrogen公司；TGF-β1及IL-6 ELISA檢測試劑盒購自美國Market公司；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司；全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 病例選擇 于2011～2015年期間收集北華大學(xué)附屬醫(yī)院50例PD患者(PD組)及50例健康體檢者(Control組)，患者年齡40～74歲，平均58.6±12.7歲，患病年齡36～69歲，平均54.1±12.2歲，病程1～10 y ， 平均4.48±5.62 y，健康體檢者年齡41～76歲，平均57.1±15.3歲。PD組和Control組中所有研究對象均抽取10 ml外周靜脈血。本研究在所有研究對象完全知情的情況下進(jìn)行，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞及樣品準(zhǔn)備 獲取外周血后將血細(xì)胞和血漿分離，血漿儲存于-80 ℃，用于檢測血漿中細(xì)胞因子TGF-β1和IL-6濃度，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心(室溫條件下3000 r/min離心10 min)分離單核血細(xì)胞。單核細(xì)胞采用RPMI 1640培養(yǎng)基(加入10%胎牛血清)重懸并使細(xì)胞密度保持每毫升2×106個(gè)/細(xì)胞。

1.4 流式細(xì)胞計(jì)數(shù) Th17細(xì)胞采用的是CD3陽性表達(dá)、CD8陰性表達(dá)且IL-17陽性表達(dá)的T細(xì)胞，其染色步驟如下，在1.7 μg/ml莫能菌素存在下，于六孔板中加入25 ng/ml佛波酯PMA和1 μg/ml離子霉素刺激Th17細(xì)胞懸浮液，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)5 h。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至管子中，采用PBS洗滌一次后加入10 μI抗人CD3的PE-cy5標(biāo)記單抗和20 μl抗人CD8的PE標(biāo)記單抗，在室溫條件下孵育15 min。按照說明書采用抗人IL-17A的FITC標(biāo)記的單抗對細(xì)胞進(jìn)行染色。Treg細(xì)胞采用的是CD4、CD25高表達(dá)及CD127低表達(dá)的T細(xì)胞，其染色步驟如下，將20 μI抗人CD127的PE標(biāo)記單抗、20 μI抗人CD4的FITC標(biāo)記單抗及10 μI抗人CD25的PE-cy5標(biāo)記單抗加入到Treg細(xì)胞中室溫孵育20 min，加入2 ml紅細(xì)胞裂解緩沖液繼續(xù)孵育20 min。同型的對照用于非特異性結(jié)合的校正，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分別采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.5 ELISA檢測 血漿中細(xì)胞因子TGF-β、IL-6和IL-17水平采用ELISA試劑盒檢測，具體操作按照說明書進(jìn)行，450 nm出的吸收值采用全波長酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 外周血Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞含量檢測 為檢測PD組及Control組外周血中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞水平，在熒光抗體標(biāo)記兩種細(xì)胞后采用流式細(xì)胞儀分別對Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1及圖1所示，PD組和Control組的Treg細(xì)胞水平為6.57%±0.821%和2.31%±0.412%、Th17細(xì)胞為2.32%±0.469%和1.27%±0.328%、Treg/Th17細(xì)胞比為2.83±0.437及1.82±0.312。結(jié)果顯示，與Control組相比，PD組的外周血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞水平均顯著增加(P均<0.01)，Treg細(xì)胞的增長程度明顯大于大于Th17細(xì)胞，同時(shí)PD組Treg/Th17細(xì)胞比也明顯增加(P均<0.01)。

2.2 血漿TGF-β1、IL-6及IL-17水平檢測 為考察PD組及Control組血漿中細(xì)胞因子TGF-β、IL-6和IL-17含量差異，采用ELISA法分別進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表2及圖2所示，PD組和Control組的TGF-β1含量為130±21.1 pg/ml及32.3±17.4 pg/ml、IL-6含量為42.3±7.32 pg/ml及21.4±6.47 pg/ml、IL-17含量為121±13.2 pg/ml及81.3±12.7 pg/ml。結(jié)果顯示，與Control組相比，PD組的血漿TGF-β1、IL-6及IL-17含量均有顯著增加(P均<0.01)。

表1 外周血Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞及Treg/Th17水平

表2 血漿TGF-β1、IL-6及IL-17水平檢測(pg/ml)

A、B、C分別代表外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞及Treg/Th17水平，數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析

A、B、C分別代表血漿TGF-β1、IL-6及IL-17水平(pg/ml)，數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析

3 討 論

炎癥反應(yīng)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，從而是機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的促炎和抗炎反應(yīng)，進(jìn)而使機(jī)體免疫功能產(chǎn)生異常。很多研究顯示，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中，Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能過程中具有很重要的作用，兩種細(xì)胞通過多種途徑參與免疫功能調(diào)節(jié)，其相對水平相對穩(wěn)定，使機(jī)體免疫功能達(dá)到穩(wěn)定健康的狀態(tài)，而一旦機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，則機(jī)體內(nèi)Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例將發(fā)生變化[9～12]，因此在研究炎癥反應(yīng)中，對Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例進(jìn)行檢測是一項(xiàng)比較有效的方式。近年來多項(xiàng)研究顯示，神經(jīng)炎癥與多種神經(jīng)退化性疾病如帕金森病、阿爾茨海默病、亨利頓病等存在相關(guān)性[13，14]，因此PD患者外周血中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例很可能會(huì)因?yàn)樯窠?jīng)炎癥而發(fā)生變化。

Th17細(xì)胞具有多種功能，能夠分泌IL-17，并誘導(dǎo)分泌IL-6等多種細(xì)胞因子，其中細(xì)胞因子IL-17是強(qiáng)致炎因子，因此在炎癥的發(fā)展過程中該細(xì)胞扮演重要的角色[15]。有研究顯示，在具有炎癥反應(yīng)的機(jī)體外周血和組織中均發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞和IL-17含量的顯著增加，這些發(fā)現(xiàn)提示在炎癥反應(yīng)中的免疫應(yīng)答與Th17細(xì)胞和IL-17存在很重要的關(guān)系[16]。本研究中，與Control組相比，PD組的Th17細(xì)胞含量均有顯著性增加(P均<0.01)，這一結(jié)果也提示Th17細(xì)胞與PD的發(fā)展存在相關(guān)性，并且這一結(jié)果與PD組血漿IL-17(P<0.01)相一致。

Treg細(xì)胞能夠分泌可溶性的細(xì)胞因子TGF-β1及IL-10等，其主要功能是通過下調(diào)自身免疫應(yīng)答來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答與T細(xì)胞在炎癥反應(yīng)等過程中對抗原應(yīng)答的平衡[17]。在炎癥反應(yīng)過程中，Treg細(xì)胞含量會(huì)發(fā)生變化，研究顯示，機(jī)體在病毒感染引發(fā)炎癥時(shí)血清和組織Treg細(xì)胞數(shù)會(huì)顯著增加，Treg細(xì)胞增加能夠抑制T細(xì)胞的應(yīng)答[18]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與Control組相比，PD組患者外周血中Treg細(xì)胞含量顯著增加(P均<0.01)，且血漿中TGF-β1含量也有顯著性增加(P均<0.01)，這說明PD與Treg細(xì)胞的功能也存在相關(guān)性。

機(jī)體中Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞分別具有抑制和促進(jìn)炎癥反應(yīng)的功能，這一對生理功能相互拮抗的細(xì)胞含量比例(Treg/Th17)平衡在機(jī)體正常免疫功能的發(fā)揮中具有重要的作用[19]，通常情況下其指數(shù)在1.5～2.5之間，在多種免疫性疾病發(fā)生發(fā)展過程中，都會(huì)出現(xiàn)Treg/Th17平衡變化，因此Treg/Th17平衡可以作為多種免疫性疾病包括炎癥反應(yīng)的一個(gè)主要指標(biāo)。在本研究中，較Control組，PD組外周血Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞含量均出現(xiàn)了顯著性增加(P均<0.01)，其中Treg細(xì)胞含量增加則更為顯著，這導(dǎo)致了平衡發(fā)生變化，使PD組的Treg/Th17顯著高于Control組(P<0.01)，這指示PD患者Treg/Th17平衡失調(diào)。

強(qiáng)致炎細(xì)胞因子IL-17具有促進(jìn)腫瘤壞死因子α(TNFα)及IL-6分泌的作用，而IL-6又能夠催化Th17細(xì)胞的形成，因此，Th17細(xì)胞、IL-17及IL-6含量的增加是具有因果性的。根據(jù)本研究結(jié)果，與Control組相比，PD組血漿IL-6水平也有顯著性增加(P<0.01)，這指示Th17細(xì)胞含量增加，也預(yù)示著在IL-6的催化促進(jìn)下Th17細(xì)胞含量將進(jìn)一步增加。另外本研究結(jié)果還顯示，PD組血漿TGF-β1含量也顯著增加，由于該細(xì)胞因子具有促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌更多的細(xì)胞因子，因而該細(xì)胞因子含量增加也將加重Treg/Th17平衡失調(diào)[20]。雖然細(xì)胞因子IL-6和TGF-β1水平均增加，但是顯然TGF-β1水平增加更為顯著，這提示TGF-β1促進(jìn)Treg細(xì)胞含量增加將更顯著。

本文通過研究PD患者與健康體檢者外周血Treg/Th17平衡變化及血漿細(xì)胞因子TGF-β1、IL-6和IL-17水平變化情況，發(fā)現(xiàn)PD患者的外周血Treg/Th17平衡失衡，且與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子TGF-β1、IL-6和IL-17在血漿中含量也均存在不同程度的增加。機(jī)體外周血Treg/Th17平衡失調(diào)顯示機(jī)體免疫機(jī)能的異常，而相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β1、IL-6和IL-17含量的變化不僅印證了外周血Treg/Th17平衡失調(diào)結(jié)果，也提示了PD病理過程中機(jī)體免疫功能的異常。

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The significance of Treg/Th17 balance and the associated cytokines in the peripheral blood of Parkinson’s disease

JIANG Ligang，MU Zhenxing，SUN Boqian.

(Department of Neurology，Affiliated Hospital of Beihua University，Jilin 132013，China)

Objective To explore the roles of Treg/Th17 and the associated cytokines in the peripheral blood of Parkinson’s disease (PD) patients. Method The Blood blood samples were obtained from 50 PD patients (PD group) and 50 healthy volunteers (Control group). The percentage of Treg cells and Th17 cells were assessed by flow cytometry，respectively. The levels of TGF-β1，IL-6 and IL-17 of the plasma were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Result The frequencies of Treg and Th17 cells were significantly increased in the peripheral blood of PD patients(P<0.01)，but the increase of Treg cells was less than that of Th17 cells，which led to an increased ratio of Treg/Th17 cells. The plasma levels of TGF-β1，IL-6 and IL-17 were significantly increased in PD group (P<0.01). Conclusion The imbalance of Treg/Th17 exists in the peripheral blood of PD patients，and this suggests that the imbalance of Treg/Th17 may be associated with the PD.

Parkinson’s disease； Th17 cell； Treg cell； TGF-β1； IL-6

1003-2754(2016)03-0222-04

2016-01-29；

2016-03-06

吉林省科技廳青年科研基金項(xiàng)目(No. 20130522026JH)

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 吉林 132013)

孫博謙，E-mail：beihua78726@163.com

R742.5

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