SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞中α7神經(jīng)型尼古丁受體基因沉默對(duì)CaM、CaMKⅡ蛋白水平的影響

張淑麗， 官志忠，2， 肖 雁， 吳昌學(xué)， 齊曉嵐

?

SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞中α7神經(jīng)型尼古丁受體基因沉默對(duì)CaM、CaMKⅡ蛋白水平的影響

張淑麗1， 官志忠1，2， 肖 雁1， 吳昌學(xué)1， 齊曉嵐1

目的 構(gòu)建穩(wěn)定的α7 nAChR沉默的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)細(xì)胞，研究α7 神經(jīng)型尼古丁受體(nAChR)基因沉默對(duì)鈣調(diào)蛋白(CaM)、鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)水平的影響，了解α7 nAChR神經(jīng)保護(hù)作用及其與阿爾茨海默病(AD)發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。方法 將α7 nAChR shRNA重組質(zhì)轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y，用含嘌呤霉素的培養(yǎng)液篩選，挑選陽性克隆后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡方法(Western-blot)檢測細(xì)胞中α7 nAChR mRNA 及蛋白表達(dá)水平的變化；Western-blot方法測定CaM、CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA重組質(zhì)粒的細(xì)胞克隆株，與對(duì)照組相比，α7 nAChR mRNA 及蛋白表達(dá)量分別減少了95%和80%。CaM、CaMKⅡ蛋白表達(dá)量分別減少了48.5%和35%。結(jié)論 成功構(gòu)建了α7 nAChR mRNA沉默的SH-SY5Y細(xì)胞細(xì)胞株，α7 nAChR沉默降低了CaM、CaMKⅡ的蛋白水平，可能影響信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，這可能與阿爾茨海默病 (AD) 的發(fā)病有一定的關(guān)系。

RNA干擾； α7神經(jīng)型尼古丁受體； CaM； CaMKⅡ； SH-SY5Y 細(xì)胞

阿爾茨海默病(AD) 是一種老年人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，從中年期到晚年期緩慢發(fā)生的記憶損傷和認(rèn)知功能障礙[1，2]。膽堿能系統(tǒng)功能障礙是早期AD較突出的基本特征，在AD發(fā)生中具有顯著作用[3]。神經(jīng)型尼古丁受體又稱煙堿乙酰膽堿受體(Neuronal acetylcholine receptors，nAChR)對(duì)大腦智力發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶和識(shí)別能力等功能有重要作用，并參與其他受體許多功能的調(diào)節(jié)，具有明顯神經(jīng)保護(hù)作用[4]。報(bào)道指出在AD患者中觀察到膽堿能損傷與 α7 nAChR水平下降有關(guān)[5]。α7nAChR屬于離子通道受體，對(duì)Ca2+具有良好通透性，與α7nAChR有關(guān)的很多病理及生理機(jī)制都涉及到Ca2+內(nèi)流[6]。大量神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者尸檢中都有關(guān)于Ca2+沉積的報(bào)告[7]，這引起了人們關(guān)注Ca2+在這些疾病中的調(diào)節(jié)作用。Gu[7]報(bào)道在阿爾茨海默病中鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)含量減少，且CaMKⅡ是鈣調(diào)蛋白(CaM)的作用底物。本研究用體外合成的shRNA抑制細(xì)胞 α7 nAChR的表達(dá)，研究其受抑制后CaM、CaMKⅡ表達(dá)水平，從而探討 α7 nAChR對(duì)CaM、CaMKⅡ 表達(dá)水平的影響及研究 α7 nAChR神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制及其在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)保存的人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞株；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰酶、雙抗購于 HyClone 公司；OPTI-MEM培養(yǎng)基、血清購于Gbico；由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成各模板引物序列；Genopure Plasmid Midi Kit、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 購于 Roche 公司(德國)；Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于 invitrogen 公司(美國)；兔抗CaM(FL-149)：sc-5537多克隆抗體、鼠抗CaMKⅡα(A-1)：sc-13141單克隆抗體、鼠抗 -actin單克隆抗體：sc-81178及HRP標(biāo)記的抗鼠二抗：sc-2005、Control shRNA Plasmid-B、AChR 7 shRNA Plasmid(h)、GFP shRNA Plasmid購自 Santa Cruz Biotechnology Inc (美國)；兔抗 7多克隆抗體購自Genetex(美國)；辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的抗兔二抗#7074購自CST(美國)；聚乙烯二氟膜、ECL-Plus 發(fā)光液、膠片購自 Amersham 公司；Real time RT-PCR 所用試劑均購于Roche公司；二甲亞砜(DMSO)購自 Gibco 公司；普通化學(xué)試劑均購自 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)的高糖DMEM培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃恒溫中培養(yǎng)SH-SY5Y貼壁細(xì)胞。生長良好的細(xì)胞用0.25%胰酶蛋白酶消化接種至六孔板，待其匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，在試劑說明書指導(dǎo)下進(jìn)行shGFP熒光質(zhì)控摸索最佳沉默效率，再分別將不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞中。于OPTI-MEM培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染6 h換10%血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h之后，加0.004 g/L嘌呤霉素培養(yǎng)液篩選，直至出現(xiàn)單克隆細(xì)胞。96孔板有限稀釋，挑取陽性單克隆并擴(kuò)增培養(yǎng)。收集其細(xì)胞，測定α7nAChR mRNA及蛋白表達(dá)水平。

1.2.2 細(xì)胞α7 nAChR 基因沉默效果測定 采用一步法提取總 RNA，以PCR 循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行Real- time PCR。所用試劑為Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)。引物序列參照王凡等[8](見表1)。

1.2.3 蛋白表達(dá)水平測定 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白(冰上裂解2 h，14000 r/min離心5 min)并進(jìn)行BCA方法定量，Western blot方法檢測α7 nAChR、CaM、CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)對(duì)照。ImageJ軟件分析結(jié)果，計(jì)算α7 nAChR、CaM、CaMKⅡ蛋白條帶與β-actin蛋白像素灰度的比值作為蛋白表達(dá)相對(duì)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

表1 熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物片段

在ABI Step One Plus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，采集α7 nAChR及β-actin基因擴(kuò)增各循環(huán)的熒光信號(hào)，以SDS2.1軟件收集熒光和分析數(shù)據(jù)。分析結(jié)果時(shí)以β-actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算α7 nAChR基因在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的相對(duì)水平(RQ=2-△△Ct)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié) 果

2.1 免疫熒光方法測沉默效率優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件 轉(zhuǎn)染GFP shRNA Plasmid 24 h之后用免疫熒光方法，紫光激發(fā)紅光進(jìn)行倒置熒光顯微鏡觀察GFP熒光標(biāo)記率。根據(jù)熒光值得到在轉(zhuǎn)染試劑：質(zhì)粒=3∶1，復(fù)合物的最適體積為200 μl(六孔板)，其最適孵育條件為常溫、15 min(見圖1)。

圖1 未轉(zhuǎn)染shGFP免疫熒光圖(A)；轉(zhuǎn)染shGFP的最優(yōu)條件免疫熒光圖(B)×100

2.2 轉(zhuǎn)染7尼古丁受體基因后7尼古丁受體 mRNA 及蛋白表達(dá)水平 本實(shí)驗(yàn)表明，用Real-time PCR和Western blot方法檢測到SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染nAChRα7 shRNA質(zhì)粒后mRNA 及蛋白表達(dá)水平分別減少了95%(見圖2A)及80%(見圖2B)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照與對(duì)照組相比不具有差異性。說明已將shα7nAChR成功轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細(xì)胞，且抑制了α7 nAChR mRNA和蛋白表達(dá)水平。

與對(duì)照組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義**P<0.01

圖2 轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA質(zhì)粒后α7 nAChR mRNA(A)及蛋白表達(dá)水平(B)

2.3 轉(zhuǎn)染7尼古丁受體基因后CaM、CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA質(zhì)粒后CaM、CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平分別減少了48.5%(見圖3)和35%(見圖4)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照與對(duì)照組相比不具有差異性。說明降低α7 nAChR水平能減少CaM、CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平。

3 討 論

nAChR是神經(jīng)系統(tǒng)中一類非第2信使介導(dǎo)性神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合的離子通道，由2種亞單位α和β構(gòu)成。不同的亞單位以不同的組合構(gòu)成不同的尼古丁受體亞型(五聚體)，主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外Na+、K+和Ca2+等離子的流動(dòng)[9]，其含量減少與AD的發(fā)病有關(guān)[10]。α7nAChR是其中較為特殊的亞型，其在海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元中高表達(dá)[11]，激活的α7nAChR可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)釋放[12，13]、改變突觸可塑性[14]、幫助神經(jīng)元抵御內(nèi)外因素的損傷，維持正常的生理功能，對(duì)維持記憶及認(rèn)知功能的十分重要。且最近有研究表明在老化過程中α7nAChRs對(duì)維持認(rèn)知功能、學(xué)習(xí)和記憶具有重要性及α7nAChRs對(duì)海馬突觸可塑性的重要性[15]。研究表明，α7nAChR對(duì)改善阿爾茨海默病和精神分裂癥患者的認(rèn)知障礙有顯著作用[16，17]。本研究將針對(duì)α7nAChR的shRNA片段轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y細(xì)胞中，mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降了。表明α7nAChR shRNA能有效地抑制內(nèi)源性α7nAChR的表達(dá)。

與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義**P<0.01；與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義##P<0.01

圖3 轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA質(zhì)粒后CaM蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義**P<0.01；與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義#P<0.05

圖4 轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA質(zhì)粒后CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平

配體門控型離子通道的α7nAChR對(duì)Ca2+通透性極強(qiáng)，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)具有重要的作用[18]。Ca2+流入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)與CaM相結(jié)合，進(jìn)一步激活下游的涉及長時(shí)程增強(qiáng) (LTP) 維持的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19]。鈣調(diào)蛋白CaM在細(xì)胞中是重要的多功能蛋白，激活40多種酶或通道。它不僅參與了神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)，及參與突觸可塑性、細(xì)胞分化與增生，而且還在LTP和學(xué)習(xí)記憶中起著非常重要的作用[20]。CaMKⅡ是由α、β、γ、δ4種亞基單位組成的異質(zhì)多聚體，并分別有四種不同的基因編碼[21]，是一種多功能的蛋白激酶，通過磷酸化許多底物蛋白來傳導(dǎo)Ca2+信號(hào)，在神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放、LTP以及突觸的可塑性、學(xué)習(xí)記憶中起著重要作用。CaMKIIa基因敲除小鼠LTP及空間記憶能力均受損[22]。因此，CaMKⅡ可能是學(xué)習(xí)和記憶的分子基礎(chǔ)，CaMKⅡ活性異常可能是阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制之一。

本研究旨在構(gòu)建重組α7 nAChR shRNA沉默質(zhì)粒并表達(dá)在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)，觀察其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響。本研究成功構(gòu)建的α7 nAChR shRNA真核表達(dá)載體有效地抑制了 SH-SY5Y 細(xì)胞中 α7 nAChR 的表達(dá)，為進(jìn)一步的研究是否通過α7 nAChR表達(dá)減少而影響CaM、CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平。α7 nAChR表達(dá)水平下降這可能是配體門控型離子通道的α7nAChR數(shù)目減少進(jìn)而使進(jìn)入細(xì)胞的Ca2+減少，導(dǎo)致CaM蛋白表達(dá)也減少，進(jìn)而導(dǎo)致Ca2+/CaM復(fù)合體減少，進(jìn)一步導(dǎo)致下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，CaMKⅡ表達(dá)也減少，阻斷LTP的產(chǎn)生，最終可能導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力障礙，促使AD的發(fā)生與發(fā)展。我們前期研究表明，抑制了 SH-SY5Y 細(xì)胞中 α7 nAChR 的表達(dá)能使Aβ生成增多，但AD中CaM、CaMKII變化與Aβ相互聯(lián)系還有待于進(jìn)一步的研究。這提示α7 nAChR對(duì)AD可能具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。

[1]Walsh DM，Selkoe DJ. Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimer’s disease[J]. Neuron，2004，44：181-193.

[2]Osborn GG. Current treatments for patients with Alzheimer disease[J]．Am Osteopath Assoc，2010，110(Suppl 8)：S16-26．

[3]Medeiros R，Castello NA，Cheng D，et al. α7 Nicotinic Receptor Agonist Enhances Cognition in Aged 3xTg-AD Mice with Robust Plaques and Tangles[J]. Am J Pathol，2014，184：520-529.

[4]Guan ZZ，Yu WF，Shan KR，et al. Loss of Nicotinic Receptors Induced by Beta-Amyloid Peptides in PC12 Cells：Possible Mechanism Involving Lipid Peroxidation[J]. Journal of Neuroscience Research，2003，71：397-406.

[5]D’Andrea MR，Nagele RG. Targeting the alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor to reduce amyloid accumulation in Alzheimer’s disease pyramidal neurons[J]. Curr Pharm Des，2006，12(6)：677-684.

[6]Kaur A，Gill KD. Disruption of neuronal calcium homeostasis after chronic aluminium toxicity inrats [J]. Toxicol，2005，95：118-122.

[7]Gu Z，Liu W，Yan Z. beta - amyloid Impairs AMPA receptor traffic-kingand function by reducing CaMKII synaptic distribution [J]. J BiolChem，2009，284( 16)：10639．

[8]王 凡，任家謀，齊曉嵐，等. SH-SY5Y細(xì)胞 7尼古丁受體基因抑制對(duì)APP代謝的影響[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2012，32(23)：5177-5179.

[9]Taly A，Omorringer PJ，Uedin D，et al. Icotinic receptors：llosteric transitions and therapeutic targets in the Ilervous system [J]. Nat Rev Drug Discov，2009，8(9)：733-750.

[10]Cao Y，Xiao Y，Ravid R，et al. Changed Clathrin Regulatory Proteins in the Brains of Alzheimer’s Disease Patients and Animal Models [J]. Journal of Alzheimer’s Disease，2010，22：329-342.

[11]Conejero-Goldberg C，Davies P，Ulloa L. Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor：A link between inflammation and neurodegeneration [J]. Neuroscience and Biobehavioral Reviews，2008，32 (4)：693-706.

[12]Cheng Q，Yakel JL. Presynaptic α7 nicotinic acetylcholine receptors enhance hippocampal mossy fiber glutamatergic transmission via PKA activation [J] . The Journal of Neuroscience，2014，34(1)：124-133.

[13]Komal P，Gudavicius G，Nelson C，et al. T-cell receptor activation decreases excitability of c；ortic；al interneurons by inhibiting α7 nicotinic receptors [J]. The Journal of Neuroscience，2014，34(1)：22-35.

[14]Nordman JC，Philips WS，Kodama N，et al. Axon targeting of the alpha 7 nicotinic receptor in developing hippocampal neurons by Gprinl regulates growth [J]. Journal of Neurochemistry，2014，129 (4)：649-662.

[15]Ma LY，Turner D，Zhang JF，et al. Deficits of synaptic functions in hippocampal slices prepared fromaged mice null α7 nicotinic acetylcholine receptors [J]. Neuroscience Letters，2014，570：97-101.

[16]Russo P，Del Bufalo A，F(xiàn)rustaci A，et al. Beyond acetylcholinesterase inhibitors for treating Alzheimer’s disease：α7-nAChR agonists in human clinical trials[J]. Current Pharmaorutioal Design，2014，20 (38)：6014-6021.

[17]Beinat C，Reekie T，Banister SD，et al. Structure-activity relationship studies of SEN12333 analogues：Determination of the optimal requirements for binding affinities at α7 nAChRs through incorporation of known structural motifs [J]. European Journal of Medicinal Chemistry，2015，95：277-301.

[18]Haass C，Selkoe DJ. Soluble protein oligomers in neur odegeneration less ons from the Alzheimer’s amyloid β2 peptide [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8 (2 )：101-112.

[19]Shytle RD，Mori T，Townsend K，et al. Cholinergic modulation of microglial activation by alpha 7 nicotinic receptors [J]. J Neurochem，2004，89：337-343.

[20]Breese CR，Adams C，Logel J，et al. Comparison of the regional expression of nicotinic acetylcholine receptor alpha7 mRNA and [125I]-alpha-bungarotoxin binding in human postmortem brain [J]. J Comp Neurol，1997，387：385-398.

[21]Hook SS，Means AR. Ca2+/CaM-dependent kinases：from activation function[J]. Anna Rev Pharmacol Toxieol，2001，41：471-505.

[22]Irvine EE，Vemon J，Giese KP. Alpha CaMK Ⅱ autophosphorylation contributes torapid learning but is not necessary for memory [J]. Nature Neuroscience，2005，8：411-412.

Influence of α7 neural nicotinic receptor gene silencing on the protein levels of CaM and CaMK Ⅱin SH-SY5Y cells

ZHANG Shuli，GUAN Zhizhong，XIAO Yan，et al.

(The Key Laboratory of Molecular Biology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China)

Objective Investigating that the influence of inhibited gene expression of α7 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) induced by RNA interference on the protein levels of calmodulin (CaM) and calmodulin dependent protein kinase Ⅱ(CaMK Ⅱ)，and to understand the neuroprotective mechanism of α7 nAChR and its function in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Method The recombinant α7 nAChR shRNA were transfected into SH-SY5Ycells，the stable clones were screened with puromycin，and used Real-time PCR and Western blot monitoring the levels of α7 nAChR mRNA and protein，respectively. The protein levels of the CaM and CaMK Ⅱ were also determined by Western blot. Results We got the cell clone strains with stable transfection of α7 nAChR shRNA recombinant plasmid，and as compared with controls，the expression levels of α7 nAChR mRNA and protein in such cells were decreased by the inhibitory efficiency with 95% and 80%，respectively. The protein levels of CaM and CaMK Ⅱ were decreased by 48.5% and 35% respectively. Conclusion The results indicated that the inhibited gene expression of α7 nAChR could decrease the level of CaM，CaMK Ⅱ，which may affect the signal transduction pathway，suggesting that α7 nAChR may play a crucial neuroprotective role in Alzheimer disease’s pathogenesis.

RNA interference； α7 nAChR； CaM； CaMKⅡ； SH-SY5Y Cell

1003-2754(2016)03-0207-04

2015-11-10；

2016- 01-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360178)，教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助”(IRT13058)，貴州省科技廳重大專項(xiàng)(黔科合重大專項(xiàng)字2014[6008])，貴州省科技廳項(xiàng)目(201344，黔科合SY字[2013]3020)

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

齊曉嵐，E-mail：xiaolan76@163.com

Q51；R749.1*6

A