天女木蘭不同組織總RNA提取方法的篩選與優(yōu)化

侯 哲，陸秀君，張曉林，梅 梅，魏 俊，李 昂

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

天女木蘭不同組織總RNA提取方法的篩選與優(yōu)化

侯 哲，陸秀君，張曉林，梅 梅，魏 俊，李 昂

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

試驗(yàn)以天女木蘭葉芽、幼葉、成熟葉、花芽、花瓣、種子為材料，分別采用Trizol法、改良Trizol法、CTAB-異丙醇法、CTAB-NaAc和無水乙醇法、CTAB-LiCl法、天根試劑盒法對(duì)其各器官進(jìn)行總RNA的提取?？俁NA的完整性、純度和濃度等提取效果分別通過瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：葉芽的總RNA最適合用改良Trizol法進(jìn)行提取，花瓣和花芽的總RNA最適合用改良的CTAB法提取，幼葉的總RNA可選擇試劑盒法，Trizol可用于成齡葉片的提取，而天根試劑盒最適合天女木蘭種子總RNA的提取。通過不同提取方法獲得的高質(zhì)量總RNA經(jīng)RT-PCR檢測(cè)表明：可以直接用于后續(xù)分子克隆和基因表達(dá)分析等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

天女木蘭；總RNA；提取方法；RT-PCR

天女木蘭Magnolia sieboldiiK.Koch 是中國唯一的一種野生木蘭屬M(fèi)agnolia植物，別稱天女花，在歷史上有稀世奇花的美稱。葉互生、大而肥厚，可制芳香油；花色潔白素雅，花大清香，被稱之為“木本西施”，花可制香浸膏，也是重要的香精植物資源；種子含油量很高，油是重要的日用化工原料，精油經(jīng)分析有19種成分，可藥用；同時(shí)天女木蘭具有很多木本植物的原始特征，是一種具有廣闊開發(fā)前景的珍稀野生木本植物，在中國植物紅皮書中被列為國家重點(diǎn)保護(hù)的珍稀瀕危植物[1]。

目前針對(duì)天女木蘭的研究主要集中在苗木的生長與繁育、林木的保育開發(fā)及種子的休眠與萌發(fā)方面，例如：陸秀君等[2]研究了天女木蘭種子后熟期間的生理生化變化；杜鳳國等[3]研究了天女木蘭種子形態(tài)及生物學(xué)特性；楊鐵囡等[4]研究了天女木蘭在不同生境下的葉片解剖結(jié)構(gòu)；李澎等探究天女木蘭種子深休眠的特性，從生理生化的水平上解釋了其難以萌發(fā)的原因。有關(guān)天女木蘭（乃至木蘭科）分子生物學(xué)研究報(bào)道極少。

植物相關(guān)基因的差異表達(dá)、Northern雜交分析、基因克隆、cDNA文庫的構(gòu)建、RT-PCR半定量分析等分子生物學(xué)的研究均需要以量足質(zhì)佳的RNA為基礎(chǔ)。但是，植物組織RNA的提取受到眾多內(nèi)源因素的影響，包括自身富含的大量脂肪、多糖、貯藏蛋白、酚等次生代謝物；以及外源RNase的干擾。這使得從植物器官中抽提高純度RNA變得十分困難[5-6]。

目前，植物組織總RNA提取的常用方法有CTAB法、改良的CTAB法、Trizol法、改良Trizol法、SDS法、試劑盒等。Trizol是天根生產(chǎn)的一種總RNA抽提試劑，其優(yōu)點(diǎn)是需要的時(shí)間較短、容易上手操作，最近幾年廣泛用于植物RNA的提取。CTAB法、改良的CTAB法、改良的SDS法也是提取核桃[7]、杏[8]、桃[9]、白樺[10]、山核桃[11]、側(cè)柏[12]等RNA常用的方法。天女木蘭各器官富含多糖、多酚、脂肪、貯藏蛋白等次生代謝物質(zhì)，都是干擾RNA提取的成分，使得天女木蘭總RNA的提取變得十分困難。到目前為止，關(guān)于天女木蘭總RNA提取的方法并不明確，而且同種植物的不同器官與部位、甚至同種植物的相同組織在不同的發(fā)育時(shí)期，其RNA提取的方法也不一定相同，為獲得高質(zhì)量的天女木蘭總RNA，需要針對(duì)不同的組織部位，摸索與篩選出最佳的提取方法。本研究以天女木蘭葉芽、幼葉、成熟葉、花芽、成熟花瓣、種子為試驗(yàn)材料，對(duì)比Trizol法、改良Trizol法、CTAB-異丙醇法、CTAB-NaAc和無水乙醇法、CTAB-LiCl法、天根試劑盒等六種方法的提取效果，從而有針對(duì)性的摸索出一套適宜天女木蘭各組織總RNA的提取方法，以期為今后天女木蘭后續(xù)的分子生物學(xué)研究提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)用到的天女木蘭各器官材料采于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園內(nèi)8年生的健康植株，分別于4月上旬采集天女木蘭葉芽、5月初采集幼葉、花芽采于5月中旬、成熟葉與成熟花瓣采集于6月中旬、9月末采集種子等材料并迅速冷凍于液氮中，或者冷藏于-80℃的超低溫冰箱中，直到RNA提取。

試驗(yàn)所用試劑CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）為Sanland-chem產(chǎn)品，EDTA購自上海生工，Trizol與試劑盒均為天根公司產(chǎn)品，PVP為上海生工產(chǎn)品，PVPP為Salarbio產(chǎn)品，β-巰基乙醇購自Amresco，反轉(zhuǎn)錄First stand cDNA synthesis kit試劑盒從TOYOBO購買，引物由上海生工合成。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 天女木蘭各器官總RNA的提取

RNA提取過程中所用的離心管、槍頭盒、槍頭等塑料器皿必須經(jīng)0.1%的DEPC水37 ℃浸泡過夜后于121℃高溫高壓滅菌40 min后使用，研缽、量筒等玻璃器皿、藥匙等應(yīng)用鋁錫紙包好后于烘箱中180 ℃烘6～8 h滅菌，其他試劑配置參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[12]。

1.2.1 Trizol法

按照Invitrogen公司Trizol試劑說明書進(jìn)行提取。

1.2.2 改良 Trizol法

稱取0.01 gPVPP與0.1 g的天女木蘭組織置于研缽中，液氮冷卻種子后用研杵碾碎種子后，邊加液氮邊研磨至種子成為細(xì)粉末狀，用液氮預(yù)冷過的藥匙迅速將粉末轉(zhuǎn)移到1.5 mL預(yù)冷的離心管中，加入10 μLβ-巰基乙醇和1mLTrizol，劇烈震蕩混勻后室溫靜置10 min；

①4℃，12 000 r/min離心5min，將上清小心轉(zhuǎn)入另一個(gè)預(yù)冷的離心管中，加入5 mol/L的NaCl溶液 200 μL，混勻后加入 200 μL 氯仿，混勻后室溫靜置15 min；

②4℃，12 000 r/min離心15 min，僅轉(zhuǎn)移最上層水相于另一個(gè)的預(yù)冷的離心管中，加200 μL氯仿抽提；

③4℃，12 000 r/min離心15 min，僅轉(zhuǎn)移最上層水相于另一個(gè)的預(yù)冷的離心管中，加入等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），充分混勻后室溫靜置5 min；

④4℃，12 000 r/min離心10 min，抽出上清后轉(zhuǎn)入0.5 mL異丙醇，靜置5 min沉淀RNA；

⑤4℃，12 000 r/min離心10 min，小心倒掉上清，轉(zhuǎn)入75%乙醇1 mL懸浮清洗沉淀；

⑥4℃，8 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，放置在干凈的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上徹底晾干沉淀5 min；

⑦取50 μLRNase-free dd H2O溶解沉淀得RNA溶液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 改良CTAB法

①稱取樣品0.1g至于研缽中，加液氮研磨成細(xì)粉末狀，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中，并加入1 mL65 ℃預(yù)熱30 min的CTAB提取緩沖液，渦旋振蕩充分混勻；

②放置在65 ℃水浴鍋中水浴20 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min；

③取上清溶液于新的預(yù)冷的離心管中，加入1 mL酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），混勻后冰浴10 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min；

④取上清溶液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入pH值5.5，4 mol/L，1/20體積的KAc和1/10體積的無水乙醇，充分混勻后加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）混勻后冰浴10 min；

⑤4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清于新的離心管中，用不同方法進(jìn)行RNA的沉淀。

1.2.4 異丙醇沉淀法

將上清液中加入等體積的異丙醇，置于-20℃冰浴1 h，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，加入75%乙醇，清洗并懸浮沉淀，放置于超凈工作臺(tái)晾干數(shù)分鐘，加入50 μLRNase-free dd-H2O溶解沉淀得RNA溶液；

1.2.5 LiCl沉淀法

于上清液中加入8 mol/L，1/3體積的LiCl溶液，-20℃貯藏過夜，離心等工作同上；

NaAc及無水乙醇沉淀法，于上清液中加入pH5.2，1/10體積3 mol/L的NaAc和2.5倍體積的無水乙醇，充分混勻后-20℃冰浴2 h，離心等操作同上。

1.2.6 試劑盒法

按照Invitrogen公司的植物RNA快速提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 RNA檢測(cè)

1.3.1 凝膠電泳檢測(cè) RNA完整性

分別取各器官的總RNA2 μL在1%的瓊脂糖凝膠、0.5×TBE、150 V電壓下電泳15 min，總RNA的完整性通過BioRad凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)。

1.3.2 RNA樣品含量與純度檢測(cè)

通 過 NanoDrop ND-1000（Thermo Scienti fi c，USA）酶標(biāo)儀測(cè)定RNA在260 nm和280 nm處的吸光值（以實(shí)驗(yàn)中溶解RNA的ddH2O為空白進(jìn)行調(diào)零），通過得到的RNA質(zhì)量濃度可得RNA產(chǎn)率：RNA質(zhì)量濃度（μg/mL）×體積（mL）/樣品質(zhì)量（g）。

1.3.3 RT-PCR分析檢測(cè)cDNA

采用cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA的 反 轉(zhuǎn) 錄，20 μL體 系： 總 RNA 模 板 2 μL，Oligo（dT）2 μL，ddH2O 8 μL， 離心 混勻后，70 ℃10 min后迅速冰浴2 min以上，然后開始反轉(zhuǎn)錄：上述液 12 μL，5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTPMixture 1 μL， RNase Inhibitor 0.5 μL RTaseMMLV(RNaseH-)1 μL，ddH2O 1.5 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃1 h，70 ℃15 min，冰上冷卻。

每個(gè)樣品取5 μL進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠、1%的瓊脂糖凝膠、0.5×TBE、150V電壓下電泳15 min，cDNA通過BioRad凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)。

1.3.4 半定量RT-PCR分析

反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈后，根據(jù)NCBI上其他已知的Actin基因設(shè)計(jì)同源序列，正向引物 5′-CACAGGTGGACCATCCCATC-3′； 反 向引 物：5′-TGCTAGCCATGTGATGTGGG-3′， 進(jìn)行半定量RT-PCR分析。20 μL的反應(yīng)體系：10 mmol/L dNTPs，0.5 μL；10×Buffer，2 μL；Taq DNA Polymerase，0.5 μL；10 μmol/L 的上下游引物，0.5 μL；ddH2O，15.5 μL；cDNA，0.5 μL。

各試劑加入PCR管后離心混勻。按照如下反應(yīng)程序進(jìn)行PCR：94 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性，30 s；55 ℃退火，30 s；74 ℃延伸，1 min； 循環(huán)27次；72 ℃延伸，10 min。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 天女木蘭各組織總RNA完整性的檢測(cè)

以天女木蘭幼芽、幼嫩葉片、成齡葉片、花芽、成熟花瓣及種子為試材，用Trizol法、改良Trizol法、天根試劑盒法、CTAB-異丙醇法、CTAB-醋酸鈉及無水乙醇法、CTAB-氯化鋰法分別提取總RNA，取2 μL樣品電泳檢測(cè)，凝膠由1%的瓊脂糖制成，圖1為BioRad凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果，就天女木蘭葉芽來看，只有Trizol和改良Trizol法獲得了不同品質(zhì)的RNA，其余方法均未提出葉芽總RNA，但Trizol法得到的RNA兩條帶比較模糊，且5S處拖尾嚴(yán)重，說明RNA存在嚴(yán)重降解；經(jīng)改良后，條帶清晰、完整、無拖尾，因此，最適合葉芽的提取方法為改良Trizol法。從幼嫩葉片的電泳圖可知，Trizol、改良Trizol、CTAB-異丙醇、試劑盒均得到了不同品質(zhì)的RNA，但是Trizol法提取的RNA純度較低，有明顯的多糖污染，這點(diǎn)可以從點(diǎn)樣孔明顯的亮帶看出； CTAB-異丙醇法得到的RNA條帶亮度很弱，說明RNA有少量的降解；改良Trizol法條帶清晰、完整，適合幼嫩葉片RNA的提取，天根試劑盒法同樣適用。除了CTAB-異丙醇法外，其余幾種方法均得到了不同品質(zhì)的成齡葉片RNA，然而改良Trizol法18S處彌散嚴(yán)重，說明大部分RNA發(fā)生降解；CTAB-醋酸鈉及無水乙醇法得到的條帶18S亮度是28S的兩倍，不符合完整RNA的要求；CTAB-氯化鋰法條帶呈團(tuán)簇狀，表明RNA降解；相比來說，Trizol與試劑盒得到的條帶清晰、完整，可用于提取天女木蘭成熟葉片的RNA。除試劑盒外，其余五種方法均得到了不同品質(zhì)的花芽RNA，但只有改良Trizol法和CTAB-氯化鋰法得到的RNA條帶清晰、亮度適宜，適合花芽總RNA的提取。從成熟花瓣的電泳圖得知，除了Trizol法和天根試劑盒法外，其余四種方法均得到了兩條清晰完整、亮度適宜的條帶，且每條帶之間沒有出現(xiàn)拖尾、彌散，表明提取的RNA結(jié)構(gòu)完整，得率較高，均可以用于成熟花瓣總RNA的提取。從種子的提取效果來看，只有天根試劑盒得到的總RNA點(diǎn)樣孔處無亮斑，無DNA、多糖、蛋白等的污染，條帶的亮度與清晰度達(dá)到要求，兩條帶之間干凈無彌散，最適合天女木蘭種子RNA的提取。

2.2 天女木蘭各組織總RNA的純度和產(chǎn)率的檢測(cè)

用不同提取方法獲得的天女木蘭各組織總RNA產(chǎn)率及質(zhì)量濃度見表1。從表1可得到，Trizol法提取成齡葉RNA，OD260/OD280為1.96，質(zhì)量濃度與產(chǎn)率分別達(dá)到353.04 μg/mL、176.52μg/g，說明RNA純度較高，多糖、蛋白等雜質(zhì)去除的較徹底，適用于成齡葉片RNA提取，其他組織的OD260/OD280相對(duì)較低，產(chǎn)率不高，不適宜RNA的提取。在Trizol的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良后，除了成齡葉與種子外，其他各組織的OD260/OD280值與產(chǎn)率均得到了大幅度的提高，表明改良Trizol法相比與Trizol法，得到的葉芽、幼葉、花芽、花瓣總RNA純度高，污染少，可用于RNA的提取。CTAB-異丙醇法只適用于成熟花瓣總RNA的提取，OD260/OD280為 2.03，產(chǎn)率達(dá) 118.68 μg/g，與電泳結(jié)果相一致。花芽與成熟花瓣用CTAB-醋酸鈉及無水乙醇沉淀法提出總RNA 的OD260/OD280分別為2.06與2.03，說明雜質(zhì)去除的教徹底，RNA純度相對(duì)較高，完整性也好，產(chǎn)率分別為108.80 μg/g與 108.34 μg/g。從表1得知，通過改良CTAB法中的LiCl沉淀RNA，抽提的總RNA OD260/OD280值均在2.0左右，花芽與花瓣的RNA產(chǎn)率也顯著高于其他方法，表明LiCl可以高效的沉淀RNA。通過純度與產(chǎn)率的分析，進(jìn)一步確定了來源于相同植物的不同種器官，各部位獲取高質(zhì)量RNA的方法也不同的觀點(diǎn)，不同組織的總RNA需要采取不同的方法來進(jìn)行提取。

2.3 天女木蘭各組織總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的檢測(cè)

為了進(jìn)一步檢測(cè)天女木蘭各組織通過適宜的提取方法得到的總RNA質(zhì)量，本試驗(yàn)對(duì)提取得到的RNA反轉(zhuǎn)錄后電泳檢測(cè)，通過BioRad凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)。由圖2我們可以看出，每個(gè)點(diǎn)樣孔的cDNA跑膠得到的是一條明亮清晰呈彌散狀的條帶，長度大約在150～2 000 bp之間，帶型完整，由此表明，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA比較完整，可以充分滿足后續(xù)的分子試驗(yàn)要求。

表1 不同方法對(duì)提取的天女木蘭總RNA質(zhì)量濃度和產(chǎn)率的影響?Table 1 Mass concentrations and productivities of Magnolia sieboldii total RNA with different extraction methods

2.4 天女木蘭各組織總RNA的RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)

天女木蘭不同組織通過不同方法提取的高質(zhì)量RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，利用NCBI設(shè)計(jì)天女木蘭β-Actin內(nèi)參基因的引物，以期驗(yàn)證所得的cDNA是否能夠完成特異性擴(kuò)增，這可以深度反應(yīng)出前期提取得到的RNA質(zhì)量，以及是否滿足后續(xù)分子試驗(yàn)。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，取2 μL樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)，拍照后得圖3，分析所得的電泳圖后發(fā)現(xiàn)，以高質(zhì)量的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板擴(kuò)增所得的條帶完整清晰，與預(yù)計(jì)目的片段的大小相一致，可以滿足天女木蘭后續(xù)分子試驗(yàn)要求。

3 結(jié)論與討論

圖2 天女木蘭各組織質(zhì)量?jī)?yōu)良RNA的反轉(zhuǎn)錄電泳檢測(cè)Fig.2 Electrophoresis of good quality Magnolia sieboldii total RNA reverse transcription

圖3 抽提高質(zhì)量天女木蘭總RNA的RT-PCR檢測(cè)Fig.3 RT-PCR of high quality total Magnolia sieboldii RNA extracted with different methods

時(shí)至今日，眾多學(xué)者對(duì)于如何獲取高質(zhì)量植物總RNA的方法進(jìn)行了大量的探索與研究[14-19]，不同植物及同一植物不同的部位都具有各自的特點(diǎn)，因此，不同物種或同種植物不同組織或器官RNA的提取存在差異。為確保獲得高質(zhì)量的RNA以應(yīng)用于后續(xù)分子試驗(yàn)，有必要針對(duì)天女木蘭不同器官或組織篩選出最佳RNA提取方法。

天女木蘭各組織富含多酚、多糖、蛋白質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物，隨著各器官的不斷成熟，會(huì)積累大量的水解酶，多糖和多酚的含量也隨之增加，而RNA的很多理化性質(zhì)與多糖相似，很難將它們分開；多酚容易被氧化，被氧化的褐色醌類物質(zhì)[20]會(huì)與RNA不可逆的結(jié)合，使RNA發(fā)生降解[21]；多酚水解酶與RNA酶都屬于蛋白質(zhì)，要獲得高品質(zhì)、完整的總RNA，在抑制RNase的前提下，最重要的是將RNA的干擾蛋白完全排除；RNA很容易與次生代謝產(chǎn)物結(jié)合，從而阻礙RNA的提取[22]。因此，要在天女木蘭的各器官中獲取高質(zhì)量的RNA，重中之重就是將多糖、多酚、蛋白等干擾物質(zhì)完全去除。而天女木蘭各組織或器官中多糖、多酚、蛋白質(zhì)均不完全相同，需根據(jù)不同組織材料的特點(diǎn)，進(jìn)行具體的摸索和完善。

本研究采用六種方法提取天女木蘭葉芽、幼葉、成齡葉、花芽、成熟花瓣、種子各組織總RNA，結(jié)果表明：

Trizol法抽提RNA需要的時(shí)間短，且容易上手操作，其在甜瓜、芒果、茶樹等許多植物RNA提取過程中都取得了很好的效果[23-24]。但在本研究中發(fā)現(xiàn)，僅在天女木蘭成齡葉片提取到的RNA質(zhì)量相對(duì)較好，而在其他組織中提到的RNA質(zhì)量較差，甚至不能抽提出RNA，分析可能是由于該方法步驟簡(jiǎn)單，不能有效去除多糖、蛋白等雜質(zhì)的污染，從而無法從其他組織中提取出完整的RNA。

通過對(duì)以往的Trizol法進(jìn)行改良，在研磨前將PVPP與天女木蘭樣品混合，添加液氮快速磨碎樣品，并將β-巰基乙醇混勻入裂解液中，從而徹底排除酚類物質(zhì)，雜質(zhì)和色素等對(duì)RNA的干擾，NaCl高鹽溶液沉淀RNA的基礎(chǔ)上加氯仿抽提，可以較徹底排除多糖和蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)的影響，可以看出，要獲取天女木蘭葉芽、花芽、成熟花瓣的高質(zhì)量總RNA，可以將Trizol改良后抽提，且整個(gè)提取過程耗時(shí)較短，操作簡(jiǎn)便，提取的RNA產(chǎn)量大，純度好，對(duì)具有天女木蘭類似成分的其他作物的RNA提取具有一定的借鑒意義。

CTAB一方面可以很好的打破植物細(xì)胞，釋放核酸，另一方面可以將核酸上的其他附屬物脫離核酸，并在裂解液中加入β-巰基乙醇，從而抑制RNA酶活性。沉淀RNA的方式有很多，如異丙醇法、NaAc和無水乙醇法、LiCl法，本研究對(duì)不同的方法進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明，CTAB-異丙醇法僅可以在天女木蘭的成熟花瓣中提取到高質(zhì)量的RNA；CTAB-NaAc和無水乙醇法可以在花芽與成熟花瓣中提取得到高質(zhì)量的RNA；CTABLiCl法可以在花芽、成熟花瓣、種子中提取得到RNA，但在種子中從電泳結(jié)果可以看出，質(zhì)量并不理想；由此可以看出，本研究采用的3種改良CTAB法只能在天女木蘭的花芽和成熟花瓣中提取得到質(zhì)量良好的總RNA，在其他組織中提取的RNA質(zhì)量不佳，甚至不能提到RNA，這可能是由于CTAB只可以很好的針對(duì)天女木蘭花瓣一類的植物材料，有效提取得到總RNA，而在天女木蘭其他器官中，CTAB不能很好的發(fā)揮其藥效。進(jìn)一步通過表1分析RNA的質(zhì)量濃度與產(chǎn)率我們可以看出，通過CTAB-LiCl法得到的總RNA OD260/OD280值均在2.0左右，花芽與花瓣的RNA產(chǎn)率也顯著高于其他方法，這可能是由于，LiCl本身具有沉淀大片段RNA的特點(diǎn)，得到的RNA純度好、質(zhì)量佳。進(jìn)一步證明了了同一種植物的不同組織，獲取高質(zhì)量RNA的方法也不一定相同的觀點(diǎn)，需要在了解植物特性的基礎(chǔ)上，通過不斷的探索與研究，篩選與優(yōu)化最佳方案。

天根試劑盒能夠很好的從天女木蘭種子中提到完整性好，純度高，質(zhì)量佳的總RNA，從幼葉與成齡葉提到的RNA質(zhì)量相對(duì)較低，不能從葉芽、花芽、成熟花瓣中提到總RNA，這可能與植物材料本身有關(guān)，林木種子相對(duì)于根、莖、葉來說穩(wěn)定性較高[25]，因此獲取RNA也不盡相同。而天女木蘭種子不易萌發(fā)，種子需特殊處理約4～5個(gè)月才可萌發(fā)，關(guān)于天女木蘭（乃至木蘭科）種子萌發(fā)調(diào)控分子機(jī)制的相關(guān)研究尚屬空白，因此，欲從長遠(yuǎn)和根本上解決種質(zhì)資源危機(jī)，有必要開展種子萌發(fā)分子調(diào)控機(jī)制研究。采用天根試劑盒可以提取得到高質(zhì)量的天女木蘭種子總RNA，為后續(xù)的相關(guān)分子試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

將各個(gè)器官的總RNA通過最適宜的方法提取出來后，盡快將高質(zhì)量的RNA反轉(zhuǎn)錄，因?yàn)閏DNA相對(duì)于RNA穩(wěn)定的多，可貯存于-20℃的冰箱內(nèi)保存[26]。電泳后通過BioRad凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)，每個(gè)點(diǎn)樣孔的cDNA跑膠得到的是一條明亮清晰呈彌散狀的條帶，長度大約在150～2 000 bp之間，帶型完整，證明RNA質(zhì)量較高。

綜合以上研究可知，天女木蘭葉芽與幼葉的總RNA的最佳提取方法為改良Trizol法，Trizol法可以從成齡葉中提到質(zhì)量相對(duì)較好的總RNA，3種改良的CTAB法最適宜也只能從天女木蘭的花芽與成熟花瓣中提取到高質(zhì)量的總RNA，而要從天女木蘭種子種獲得品質(zhì)優(yōu)良的總RNA，可以選擇天根試劑盒法。

本研究結(jié)果還進(jìn)一步說明了同一種植物的不同器官和組織都具有各自的特點(diǎn)，其RNA提取的最適宜方法也存在著差異，應(yīng)在熟練掌握基本操作原理的基礎(chǔ)上，根據(jù)材料自身的特點(diǎn)，并在試驗(yàn)過程中對(duì)所有的儀器設(shè)備經(jīng)過嚴(yán)格處理，防止RNA 被降解，從而選擇適宜的方法提取 RNA，才能更好地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和 cDNA 文庫建立等后續(xù)分子研究工作[27]。

[1]宋朝樞,徐榮章,張清華,等.中國珍稀瀕危保護(hù)植物[M].北京:中國林業(yè)出版社, 1989.

[2]李 澎,陸秀君,姚 飛,等.天女木蘭種子休眠原因的初步探討[J].種子, 2006, 25(2): 36-39.

[3]杜鳳國,王 歡,楊德冒,等.天女木蘭種子形態(tài)及生物學(xué)特性[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2006, (3) : 269-272.

[4]楊軼囡.不同生境天女木蘭葉片解剖結(jié)構(gòu)比較[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 12(3) : 269-272.

[5]李 宏,王新力.植物組織RNA提取的難點(diǎn)及對(duì)策[J].生物技術(shù)通報(bào), 1999, 1(1): 1-6.

[6]胡群文,陳曉玲,張志娥,等.干種子高質(zhì)量總RNA的快速提取方法[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2010, 11(3): 360-363.

[7]劉曉菊,洪海波,李 敏,等.改良CTAB法提取核桃總RNA試驗(yàn)[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(1): 97-99.

[8]李曉穎,曹 雪,房經(jīng)貴,等.杏葉片與果實(shí)總RNA提取方法研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 26(2): 152-156.

[9]王 宇,李 玲,王 慧,等.兩種桃芽總RNA提取方法的比較研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2011, 42(3):388-391.

[10]楊傳平,姜 靜,那冬辰,等.白樺花芽RNA的快速提取[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 30(3): 2-4.

[11]沈 乾,夏國華,張秋月,等.山核桃花芽總RNA提取方法研究[J].浙江林業(yè)科技, 2009, 29(3): 57-60.

[12]王暑輝,徐 倩,徐 筱,等.富含多糖多酚的側(cè)柏葉片總RNA提取方法[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(1): 76-80.

[13]J薩姆布魯克,DW拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂等譯.第3版.北京:科學(xué)出版社, 2003: 582-584.

[14]Teixeira J, Fidalgo F.Salt stress affects glutamine synthetetase activity and mRNA accumulation on potato plants in an organdependent manner[J].Plant Physiology and Biochemistry, 2009,47(9): 807-813.

[15]Niu Y Y, Luo H M, Sun C,et al.Expression profiling of the triterpene saponin biosynthesis genes FPS, SS, SE, and DS in the medicinal plant Panax notoginseng[J].Gene, 2014, 533(1): 295-303.

[16]Yamaguchi H, Hasegawa K, Esumi M.Protein from the fraction remaining after RNA extraction is useful for proteomics but care must be exercised in its application[J].Experimental and Molecular Pathology, 2013, 95(1): 46-50.

[17]Djami-Tchatchou A T, Straker C J.The isolation of high quality RNA from the fruit of avocado[J].South Afican Journal of Botany, 2012, 79: 44-46.

[18]陳宏偉,萬里紅,楊進(jìn)軍,等.鹽膚木葉片總RNA提取方法的比較研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(5): 27-30.

[19]王 偉,李立芹,鄒 雪,等.馬鈴薯塊莖總RNA提取方法的比較研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(1): 38-40.

[20]Su X, Gibor A.A method for RNA isolation from marine macroalgae[J].Anal.Biochem., 1991, 197: 91-95.

[21]Schneiderbauer A, Sandermann H, Ernst D.Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds[J].Anal.Biochem., 1991, 197: 91-95.

[22]裴 東,谷瑞升.幾種提取木本植物中RNA方法的比較和改進(jìn)[J].植物生理學(xué)通訊, 2002, 38(4): 362-365.

[23]林金科,開國銀.茶樹RNA的提純與鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 32(1): 70-73.

[24]趙繼榮,畢 陽,劉紅霞,等.Trizol法提取厚皮甜瓜果實(shí)RNA條件的篩選[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 44(2): 56-59.

[25]王旭軍,張日清,許忠坤,等.紅櫸不同種源種子形態(tài)性狀變異[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(1):1-7.

[26]劉美蘭,譚曉風(fēng),龍洪旭,等.油桐丙二酰單酰CoA:ACP轉(zhuǎn)?；傅目寺∨c序列分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究, 2014, 32(4): 1-7.

[27]魏琦琦,馮延芝,林青,等.適于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的棗不同器官總RNA提取方法篩選[J].經(jīng)濟(jì)林研究, 2015, 33(2): 63-67.

Selection and optimization of total RNA extraction methods fromMagnolia sieboldiidifferent tissues

HOU Zhe, LU Xiu-jun, ZHANG Xiao-lin, MEI Mei, WEI Jun, LI Ang
（College of Forestry, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China）

Six extraction methods, including modi fi ed CTAB, Trizol, modi fi ed Trizol, TIANGEN extraction kit, were studied in the RNA extraction fromMagnolia sieboldiibuds, leaves, mature leaves, flower buds, petals and seeds.Integrity, purity and concentration of total RNA were examined by agarose gel electrophoresis and nucleic acid analyzer.Of these six methods, the method of modi fi ed Trizol was better for buds isolation, the method of modi fi ed CTAB was better for fl ower buds and petals isolation, Trizol method can be used to extract mature leaves, while the RNA extracted by TIANGEN kit is effective to the leaves and seeds.High quality total RNA obtained by different extraction methods through RT-PCR analysis indicated that the RNA satis fi ed the standard for gene cloning and other molecular biological experiments,

Magnolia sieboldii; total RNA; extraction methods; RT-PCR

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.07.019

http: //qks.csuft.edu.cn

S722.1

A

1673-923X(2016)07-0109-07

2015-09-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070561;31570621）

侯 哲，碩士研究生

陸秀君，教授；E-mail：353020376@qq.com

侯 哲，陸秀君，張曉林，等.天女木蘭不同組織總RNA提取方法的篩選與優(yōu)化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2016, 36(7):109-115.

[本文編校：吳 毅]