以草莓花藥培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)脫毒的研究進(jìn)展

陳玉波，張學(xué)明，姚環(huán)宇，鄭亞杰

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹所，吉林 公主嶺 136100）

1 草莓脫毒植株培育的發(fā)展現(xiàn)狀及意義

草莓病毒病是草莓生產(chǎn)的主要病害，一般可造成20%～30%的減產(chǎn)，甚至50%以上。侵染草莓的病毒種類多達(dá)60種以上，其中草莓斑駁病毒（Strawberry mottle virus，SMoV）、草莓輕型黃邊病毒（Strawberry mild yellow edge virus，SMYEV）、草莓鑲脈病毒（Strawberry vein band virus，SVBV）和草莓皺縮病毒（Strawberry crinkle virus，SCrV）是我國侵染草莓的4種主要病毒，總侵染率為80.2%，其中單病毒的侵染率達(dá)41.6%，兩種以上病毒的復(fù)合侵染率達(dá)38.6%[1]。由于病毒病的危害，植株生長衰弱，結(jié)果期推遲，產(chǎn)量減少，果品質(zhì)量明顯降低，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此應(yīng)用脫毒苗進(jìn)行草莓生產(chǎn)勢在必行。

組培脫毒主要包括莖尖培養(yǎng)脫毒和花藥培養(yǎng)脫毒。1952年Morel首先利用莖尖分生組織培養(yǎng)獲得大麗菊無病毒植株[2]，同時建立了莖尖培養(yǎng)脫毒的技術(shù)體系?；诖?，莖尖脫毒培養(yǎng)在20世紀(jì)60年代得到研究和應(yīng)用[3～5]。 在草莓生產(chǎn)上，1962年Miller首先用莖尖培養(yǎng)方法脫除SMYEV、SCrV、SVBV[6]。莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)的脫毒效果與莖尖大小密切相關(guān)。莊子孝一通過實(shí)驗證明，以莖尖培養(yǎng)脫除草莓病毒，莖尖應(yīng)為0.3～0.5mm，含一個葉原基較好[7]。高慶玉（1993）通過接種不同大小的莖尖，認(rèn)為莖尖越小脫毒效果越好，但成活率低[8]。重復(fù)切取莖尖也是獲取無病毒苗、提高脫毒效果的一種手段。實(shí)驗證明，重復(fù)切取莖尖次數(shù)越多，脫毒效果越好，但所需時間較長，工作效率低[9]。

1974年大澤勝次通過花藥培養(yǎng)獲得再生植株，經(jīng)鑒定證明，再生植株為脫毒植株，脫毒率為100%[10]。此后，草莓花藥培養(yǎng)作為脫毒手段有了一定的研究進(jìn)展。宮崎正則等對草莓花藥培養(yǎng)的脫毒率進(jìn)行了研究，品種‘America’的脫毒率達(dá) 50%～81%，品種‘Empire’的脫毒率達(dá)到100%[11]。在我國，1988年覃蘭英等最早利用花藥愈傷組織誘導(dǎo)再生植株的方法，培育了‘春香’‘寶交早生’‘達(dá)娜’等品種的花藥脫毒苗[12]。薛光榮用指示植物對 ‘沙爾普斯’‘紅崗利德’‘寶交早生’‘春香’‘索非亞’5個品種的花藥培養(yǎng)植株進(jìn)行了病毒鑒定，檢測結(jié)果表明，不帶SMYEV、SVBV、SCrV、SMoV 4種主要病毒，證明為無病毒植株。再生植株在長勢、結(jié)果性、可溶性固形物含量等方面均超過對照株，果實(shí)總產(chǎn)量和平均果重增長幅度分別為21.2%和44.9%[13]。高慶玉通過花藥培養(yǎng)所獲得的植株脫毒率為100%，而幼葉和莖尖培養(yǎng)所獲得的植株脫毒率僅為20%，因此認(rèn)為花藥培養(yǎng)是獲得無病毒植株的最好途徑[8]。

2 影響草莓花藥培養(yǎng)效果的各種因素

2.1 供試材料的基因型、生理狀態(tài)和發(fā)育時期

不同草莓基因型花藥再生能力不同。侯喜林對‘女峰’等4個草莓品種進(jìn)行的花藥培養(yǎng)表明，‘女峰’花藥的再生能力明顯高于其他3個品種；‘豐香’花藥再生能力最差，沒有獲得再生植株[14]。

生理狀態(tài)方面，查中萍等研究認(rèn)為，‘豐香’草莓第1級花序具有較好的培養(yǎng)效果，其愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于第2、第3級花序，且培養(yǎng)效果穩(wěn)定，誘導(dǎo)率高；而第2、第3級花序的花藥不僅誘導(dǎo)頻率較低，不同年份的培養(yǎng)效果也不一致[15]。趙志惠等在‘寶交早生’草莓上的研究顯示，第1、第2級花序愈傷組織誘導(dǎo)率較高，一般在60%左右；第3級花序誘導(dǎo)率較低，均在25%左右[16]。

發(fā)育時期的研究表明，單核期花粉是誘導(dǎo)愈傷組織和分化不定芽的最適宜時期，此時花蕾直徑為4mm左右，花瓣尚未開裂，花藥直徑約為1mm且呈淡黃色。此時接種愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于單核靠邊期或接近雙核期[17，18]。

2.2 預(yù)處理措施

低溫處理是提高花藥培養(yǎng)再生率的預(yù)處理措施之一，4～8℃處理3d被認(rèn)為是最適宜的低溫處理措施，其再生率高于不處理、＜3 d的低溫處理和5 d的低溫處理[15，19，20]。也有研究結(jié)果顯示，最佳低溫處理時間以 1d為好[21]。

消毒措施方面，牛建新等研究認(rèn)為，75%酒精浸泡4s+0.1%升汞處理6～10min是滅菌的最佳組合[22]。而喬奇等研究認(rèn)為，最佳處理措施是用70%酒精浸泡1s，然后用0.1%升汞消毒4min，最后用無菌水沖洗三四次[23]。

2.3 基本培養(yǎng)基及外源激素配比

草莓花藥培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基一般為MS。徐振南等研究認(rèn)為，B5適合作為愈傷組織誘導(dǎo)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其誘導(dǎo)率明顯高于 MS、N6、E1[24]。而張敏在‘法蘭地’草莓的花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基要優(yōu)于B5、N6、W14培養(yǎng)基[25]。王玉民的研究認(rèn)為，再生植株培養(yǎng)基以1/2A為好[26]。造成上述不同結(jié)果的原因可能是草莓基因型存在差異。

草莓花藥培養(yǎng)基通常分為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基。晁慧娟等以‘甜查理‘為試材研究顯示，誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基是MS+BA1.0mg/L+2，4-D2.0mg/L；不定芽分化最適培養(yǎng)基為MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L[19]。查中萍以‘豐香’草莓為試材研究顯示，最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+BA0.5mg/L+KT0.1mg/L+NAA2.0mg/L；分化培養(yǎng)基為MS+BA0.5mg/L+ZT2.0mg/L+NAA0.2mg/L[27]。不同草莓基因型具有不同的最適激素配比，因此培養(yǎng)基激素最佳配比仍需進(jìn)一步的試驗摸索和總結(jié)。

一些新型的細(xì)胞分裂素也被用于草莓花藥培養(yǎng)試驗。吳偉民等將CPPU用于草莓愈傷組織誘導(dǎo)和分化，結(jié)果表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加CPPU 1 mg/L有利于草莓花藥愈傷組織的形成，但植株的分化率較低，仍需分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)[28]。王敬東等將TDZ用于草莓花藥培養(yǎng)，結(jié)果顯示，MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.5mg/L適用于草莓愈傷組織的分化，分化率高達(dá)75%；但TDZ對草莓愈傷組織的誘導(dǎo)無顯著作用[29]。

2.4 糖、培養(yǎng)基添加物及培養(yǎng)基固化劑

草莓花藥培養(yǎng)采用的碳源通常為蔗糖，濃度以3.0%為好[27]。其他碳源也有所應(yīng)用。徐振南的研究顯示，乳糖作為碳源的愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于蔗糖、甘油、葡萄糖，培養(yǎng)基最適乳糖濃度為3.0%～5.0%[24]。張敏等研究了果糖、麥芽糖、蔗糖和葡萄糖對‘法蘭地’草莓的愈傷組織誘導(dǎo)效果，結(jié)果顯示，3.0%麥芽糖是最優(yōu)碳源[25]。不同碳源及濃度與蔗糖效果的比較還有待于進(jìn)一步研究。

無機(jī)或有機(jī)添加物對草莓花藥培養(yǎng)也有不同程度的促進(jìn)作用。吳偉民在品種‘碩香’和品系88-16-5愈傷組織分化培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，添加5～15mg/LAgNO3均可提高不定芽的分化率，以8mg/LAgNO3較為適宜[30]。王玉民研究發(fā)現(xiàn)，三十烷醇2.0mg/L對誘導(dǎo)草莓花藥愈傷組織再生植株有一定的促進(jìn)作用[26]。

草莓固化劑一般采用瓊脂，也有學(xué)者對新型固化劑結(jié)冷膠（Gelrite）進(jìn)行了應(yīng)用研究。吳偉民的研究結(jié)果顯示，隨著結(jié)冷膠濃度的提高，愈傷組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢，以1～2g/L結(jié)冷膠處理愈傷組織誘導(dǎo)率較高，形成的愈傷組織松軟，生長速度快；在3～8 g/L結(jié)冷膠培養(yǎng)基上，愈傷組織呈致密顆粒狀，改變了愈傷組織的形態(tài)，但并未提高其分化率。因此，有必要進(jìn)一步研究不同形態(tài)愈傷組織的分化條件[31]。

2.5 培養(yǎng)條件

溫度對草莓花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率和分化率都有不同程度的影響。查中萍等的研究結(jié)果表明，20℃下培養(yǎng)形成的愈傷組織比25℃下形成的愈傷組織狀態(tài)好，有利于芽分化[15]。顧玉成等的研究結(jié)果表明，22℃和25℃培養(yǎng)時，愈傷組織誘導(dǎo)率分別為61.30%和68.36%，前者的愈傷組織優(yōu)于后者[20]。

暗培養(yǎng)對于草莓花藥愈傷組織的誘導(dǎo)也有一定作用。牛建新等用遮光方法暗培養(yǎng)1周后發(fā)現(xiàn)，同一種培養(yǎng)基暗培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)率均較光培養(yǎng)高[21]。這與用莖葉切塊誘導(dǎo)愈傷組織具有相同的規(guī)律，可能與草莓愈傷組織的形成需要弱光有關(guān)。

3 草莓花藥培養(yǎng)脫毒存在的問題與展望

脫毒率高、操作簡單是草莓花藥培養(yǎng)再生的優(yōu)點(diǎn)。然而將其應(yīng)用于生產(chǎn)仍然有一些需要解決的問題。首先是遺傳穩(wěn)定性?；ㄋ幵偕仓甑倪z傳變異是客觀存在的[27]，因此將其用于生產(chǎn)必需嚴(yán)格評價，確保其與取材品種基因型的一致。除田間鑒定外，可以利用開發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合細(xì)胞學(xué)觀察技術(shù)予以鑒定。其次是花藥培養(yǎng)再生率較低，目前不同的品種再生率有很大的差異，不少品種難以獲得花藥再生植株。因此，迫切需要一套標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)規(guī)程或數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)來解決這個問題，這有待于今后基礎(chǔ)理論的發(fā)展和培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化。相信解決了上述問題，草莓花藥培養(yǎng)脫毒技術(shù)將能夠更好地服務(wù)于我國草莓產(chǎn)業(yè)。

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