載脂蛋白J對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的影響*

李利娟，馬彥卓，孔令鋒，陳 瑜，王冬梅△

(1.河北北方學(xué)院研究生部，河北張家口 075000；2.白求恩國際和平醫(yī)院心內(nèi)科,石家莊 050000)

?

載脂蛋白J對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的影響*

李利娟1，2，馬彥卓2，孔令鋒2，陳 瑜2，王冬梅2△

(1.河北北方學(xué)院研究生部，河北張家口 075000；2.白求恩國際和平醫(yī)院心內(nèi)科,石家莊 050000)

目的 觀察載脂蛋白J(ApoJ)對(duì)缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的乳鼠心室肌細(xì)胞損傷的影響及其相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。方法 用攜帶ApoJ基因的重組腺病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞使ApoJ高表達(dá)。利用三氣培養(yǎng)箱建立H/R模型，SOD類似物Mn(Ⅲ)TBAP和真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(eIF2α)去磷酸化抑制劑Salubrinal提前預(yù)處理，將心肌細(xì)胞分成對(duì)照組、H/R組、ApoJ組、ApoJ+H/R組、Mn(Ⅲ)TBAP+H/R組、Salubrinal+H/R組。利用MTT法檢測細(xì)胞的存活率；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量、凋亡蛋白酶半胱天冬酶-3/7(caspase-3/7)及細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性；Western blot檢測ApoJ、氧化酶Nox2/gp91phox、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性凋亡蛋白caspase-12、CHOP的表達(dá)及eIF2α的磷酸化水平。結(jié)果 ApoJ 基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染后，心肌細(xì)胞ApoJ蛋白高表達(dá)。與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞存活率和SOD的活性明顯下降，LDH的漏出量及caspase-3/7的活性升高，Nox2/gp91phox、caspase-12、CHOP蛋白的表達(dá)明顯升高，eIF2α的磷酸化水平升高。與H/R組相比，ApoJ組、Mn(Ⅲ)TBAP組及Salubirnal組LDH的漏出量及caspase-3/7的活性明顯降低,ApoJ高表達(dá)使細(xì)胞存活率和SOD的活性顯著升高，Nox2/gp91phox、caspase-12、CHOP蛋白的表達(dá)明顯下降，而eIF2α的磷酸化水平顯著升高。結(jié)論 ApoJ通過抗氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用，減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

載脂蛋白J；缺氧/復(fù)氧；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡

心肌缺血/再灌注(MI/R)損傷是心肌組織缺血一段時(shí)間后再恢復(fù)血流，反而使心肌細(xì)胞損傷加重，表現(xiàn)為再灌注后缺血的心肌出現(xiàn)舒縮功能降低、心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結(jié)構(gòu)的變化和血管無復(fù)流等現(xiàn)象。心肌細(xì)胞凋亡是MI/R損傷心肌細(xì)胞死亡的主要方式之一。載脂蛋白J(Apolipoprotein-J,ApoJ)又被稱為凝集素，是一種新型多功能分泌型糖蛋白，廣泛存在于人體大部分組織與體液中[1]。該蛋白參與多種不同的病理生理過程，如膜的再利用、精子成熟、補(bǔ)體防御、脂質(zhì)運(yùn)輸、抗炎、抗細(xì)胞凋亡、組織分化和重構(gòu)、神經(jīng)退行性變和腫瘤的形成等[2-3]。ApoJ是急性期反應(yīng)蛋白，正常生理狀態(tài)下表達(dá)量很少，但在應(yīng)激的病理狀態(tài)下表達(dá)增多，如急性心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌炎和氧化應(yīng)激等。研究表明當(dāng)心臟受到損傷時(shí)，ApoJ通過高表達(dá)發(fā)揮抗凋亡的作用[4]。Jun等[5]發(fā)現(xiàn)ApoJ通過Akt和GSK-3β的激活保護(hù)H9C2心肌細(xì)胞對(duì)抗由過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ApoJ通過高表達(dá)對(duì)抗由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]，但目前針對(duì)ApoJ對(duì)H/R誘發(fā)的心肌細(xì)胞損傷影響的研究較少見。本研究通過建立離體乳鼠心肌細(xì)胞H/R損傷模型模擬MI/R，觀察ApoJ對(duì)MI/R誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的影響及其相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠，雌雄不拘，1～3 d齡，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。攜帶ApoJ基因的重組腺病毒購自Invitrogen；ApoJ抗體購自EterLife,Birmingham；CHOP、caspase-12、Nox2/gp91phox抗體購自ABcam；eIF2α、p-eIF2α購自Cell Signaling Technology；GAPDH、tublin抗體購自Sigma；LDH、SOD、caspase-3/7活性測定試劑盒購自Promega公司；PVDF 膜購自Santa Cruz；增強(qiáng)型ECL發(fā)光液購自Vazyme；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原蛋白酶、高糖DMEM培養(yǎng)基、新生胎牛血清(FBS)購自Gibco；MTT、二甲基亞砜(DMSO)、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、Tween-20、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)均購自美國Sigma公司；RIPA裂解液、PMSF及BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；其余化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[7]的方法并結(jié)合實(shí)際改進(jìn)。在無菌條件下用眼科剪取出心臟置于預(yù)先盛有AD液的無菌平皿內(nèi)。去除心房和大血管，剪成1 mm×1 mm×1 mm左右大小的碎塊，加入含有0.06%胰酶和0.025%的Ⅱ型膠原酶的AD液中，37 ℃水浴振蕩箱反復(fù)消化直至組織塊完全消化為止。將含有血清的細(xì)胞離心(1 500 r/min,5 min)后棄上清液，加入適量的完全培養(yǎng)液(含高糖DMEM，10%的胎牛血清，1%青鏈霉素)重懸心肌細(xì)胞，接種至100 cm2培養(yǎng)皿。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h以純化心肌細(xì)胞(差速貼壁法)，然后平均接種于60 cm2的培養(yǎng)皿中。調(diào)整細(xì)胞密度后，按5×105/mL接種至24孔板，每組6孔，共6個(gè)復(fù)組，4×104/mL接種至96孔板，每組6孔，共6個(gè)復(fù)組。

1.3 Apo J的轉(zhuǎn)染 去除完全培養(yǎng)液，用高糖DMEM沖洗細(xì)胞2次，以1∶200的濃度將攜帶ApoJ基因的腺病毒加入高糖DMEM(加病毒時(shí)關(guān)風(fēng)機(jī))混勻，ApoJ轉(zhuǎn)染組加入適量腺病毒和高糖DMEM的混勻液，未攜帶ApoJ基因的腺病毒作為對(duì)照組。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h后更換為完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染36～48 h后提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測。

1.4 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立及分組 用純氮(N2)以1 L/min的流速充分飽和不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，30 min后換液并置于缺氧培養(yǎng)箱中，同樣以1 L/min的流速通入含95%N2和5%CO2的混合氣體，缺氧培養(yǎng)4 h后更換正常培養(yǎng)基放回正常含95%空氣和5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)12 h，構(gòu)建乳鼠原代心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組(在正常含95%空氣和5%CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng))、H/R組(按上述操作給予缺氧/復(fù)氧處理)、ApoJ組(用攜帶ApoJ基因的重組腺病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞使ApoJ高表達(dá)，在正常含95%空氣和5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng))、ApoJ+H/R組(用攜帶ApoJ基因的重組腺病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞使ApoJ高表達(dá)，然后給予缺氧/復(fù)氧處理),Mn(Ⅲ)TBAP+H/R組[Mn(Ⅲ)TBAP提前預(yù)處理1 h后再給予缺氧/復(fù)氧干預(yù)]，Salubrinal+H/R組(Salubrinal提前預(yù)處理1 h后再給予缺氧/復(fù)氧干預(yù))。

1.5 MTT檢測細(xì)胞的存活率 取生長狀態(tài)良好的乳鼠原代心肌細(xì)胞接種于96孔板中，并按照分組分別處理各組細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后在各孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，在搖床上作用1 min，搖勻，在37 ℃下繼續(xù)正常培養(yǎng)4 h后，棄上清液后各孔加入150 μL的DMSO，加樣器吹打均勻(勿出氣泡)后在酶標(biāo)儀上檢測570 nm處各孔的吸光度值，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.6 ELISA法測定細(xì)胞中乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量、細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性及caspase-3/7的活性 取生長狀態(tài)良好的乳鼠原代心肌細(xì)胞接種于24孔板中，并按照分組分別處理各組細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后收集各組細(xì)胞上清液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，按照檢測試劑盒的說明步驟，檢測各組心肌細(xì)胞上清液中LDH的分泌量。同時(shí)用PBS沖洗貼壁的細(xì)胞2遍，加入胰酶(0.25%)消化3～5 min，顯微鏡下觀察消化程度，加入完全培養(yǎng)液終止消化，將上述液體1 500 r/min離心5 min，棄上清液，PBS清洗1遍后用少量的PBS重懸細(xì)胞，利用超聲裂解細(xì)胞膜(40～60 W，30 s，間隔10 s，重復(fù)2次)，顯微鏡下觀察細(xì)胞已裂解，5 000 r/min離心15 min后取上清液，按照檢測試劑盒的說明步驟，檢測各組心肌細(xì)胞內(nèi)SOD、caspase-3/7的活性。

1.7 Western blot法檢測ApoJ、CHOP、caspase-12、Nox2/gp91phox、eIF2α、p-eIF2α蛋白表達(dá) 分別取各組心肌細(xì)胞，提取蛋白，用BCA法測定各組樣本蛋白質(zhì)濃度，樣本經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗(ApoJ、CHOP、caspase-12、Nox2/gp91phox、eIF2α、p-eIF2α)和二抗，用GBOX成像，灰度值用Image J軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 ApoJ對(duì)細(xì)胞存活率、細(xì)胞損傷及凋亡的影響 用攜帶ApoJ基因的腺病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞，ApoJ的表達(dá)明顯升高，見圖1A，表明ApoJ高表達(dá)模型建立成功。與對(duì)照組相比，H/R損傷后心肌細(xì)胞存活率明顯下降；與H/R組對(duì)比，ApoJ高表達(dá)可使心肌細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05)，見圖1B。與對(duì)照組相比，H/R損傷后，心肌細(xì)胞上清液LDH的漏出量及caspase-3/7的活性顯著升高(P<0.05)；與H/R組對(duì)比，ApoJ高表達(dá)、Mn(Ⅲ)TBAP 和Salubirnal可使細(xì)胞上清液LDH的漏出量及caspase-3/7的活性明顯下降(P<0.05)，見圖1C和1D。

2.2 ApoJ通過PERK-eIF2α通路抑制H/R損傷誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 與對(duì)照組相比較，H/R損傷后心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白caspase-12和CHOP的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，高表達(dá)ApoJ后，與H/R組對(duì)比，ApoJ+H/R組心肌細(xì)胞凋亡蛋白caspase-12和CHOP的表達(dá)顯著下降(P<0.05)見圖2A和2B。與對(duì)照組相比較，H/R損傷后心肌細(xì)胞eIF2α的磷酸化水平升高(P<0.05)，高表達(dá)ApoJ后，與H/R組對(duì)比，APOJ+H/R組心肌細(xì)胞eIF2α的磷酸化水平進(jìn)一步升高(P<0.05)，見圖2C。

2.3 ApoJ抑制H/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激 與對(duì)照組相比較，H/R損傷后心肌細(xì)胞SOD的活性明顯下降，Nox2/gp91phox的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，ApoJ高表達(dá)后，與H/R組對(duì)比，ApoJ+H/R組心肌細(xì)胞SOD的活性明顯升高，Nox2/gp91phox的表達(dá)明顯下降(P<0.05)，見圖3。

A:通過Western blot的方法觀察ApoJ重組腺病毒感染的心肌細(xì)胞ApoJ的表達(dá)。B:通過MTT檢測細(xì)胞的活力。C:通過檢測培養(yǎng)液中心肌細(xì)胞LDH的漏出量來確定心肌細(xì)胞的損傷程度。D:通過檢測caspase-3/7的活性明確H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。**:P<0.05，與對(duì)照組比較,##:P<0.05,與H/R組比較；1：對(duì)照組；2：Apo J組；3：H/R組；4：Apo J+H/R組；5：Mn(Ⅲ)TBAP+H/R組；6：SaJubriani+H/R組。

圖1 高表達(dá)ApoJ減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

A、B:Western blot檢測caspase-12和CHOP的表達(dá)。C:Western blot檢測eIF2α的磷酸化水平。**:P<0.05，與對(duì)照組比較；##:P<0.05，與H/R組比較。

圖2 ApoJ通過PERK-eIF2α通路抑制H/R損傷誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

A:Western blot檢測心肌細(xì)胞Nox2/gp91phox蛋白的表達(dá)。B:通過SOD試劑盒檢測心肌細(xì)胞SOD的活性。**:P<0.05 與對(duì)照組比較,##:P<0.05 與H/R組比較。

圖3 ApoJ抑制H/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

3 討 論

目前急性心肌梗死仍是全世界死亡和致殘的主要原因之一。盡早開通梗死相關(guān)血管，恢復(fù)血流可以減少梗死面積、改善臨床結(jié)果。然而，無論是溶栓或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PCI)治療，MI/R損傷都是無法回避的問題及難以克服的治療難點(diǎn)，因此如何減輕MI/R損傷一直是研究熱點(diǎn)。

給予缺氧/復(fù)氧處理后心肌細(xì)胞的存活率明顯下降，LDH的漏出量明顯升高，表明H/R模型構(gòu)建成功。ApoJ 基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染組ApoJ蛋白的表達(dá)明顯升高，表明ApoJ高表達(dá)模型構(gòu)建成功。心肌細(xì)胞LDH漏出量變化是反映心肌壞死的重要指標(biāo)。caspase是細(xì)胞死亡的關(guān)鍵性中介，而caspase-3是公認(rèn)的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者。本試驗(yàn)測定了心肌細(xì)胞的存活率、LDH的漏出量和caspase-3/7的活性，結(jié)果顯示H/R損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞的存活率明顯下降，LDH漏出量和caspase-3/7活性升高，ApoJ高表達(dá)可顯著升高心肌細(xì)胞的存活率，降低LDH漏出量和caspase-3/7活性。表明ApoJ可減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

既往研究表明，心肌缺血再灌注損傷可促進(jìn)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)過度生成，產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激，進(jìn)一步加重心臟病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。在I/R心肌中NADPH氧化酶是最重要的超氧化物酶，Nox2/gp91phox是NADPH氧化酶的關(guān)鍵組成部分。SOD是機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，通過清除自由基而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用,SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。Jun等[5]研究表明ApoJ能減輕I/R損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。本研究發(fā)現(xiàn)H/R損傷使Nox2/gp91phox的表達(dá)明顯增高，SOD活性顯著下降，而ApoJ高表達(dá)可顯著降低Nox2/gp91phox的表達(dá)，使心肌細(xì)胞SOD活性增加。以上結(jié)果表明，ApoJ可減少超氧化物的過量產(chǎn)生，減輕H/R損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是細(xì)胞的內(nèi)源性自我保護(hù)性機(jī)制，有利于恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和維持生存，但過強(qiáng)的或長時(shí)間的ERS 反應(yīng)可以引起細(xì)胞的凋亡[10]。既往研究已證實(shí)，由H/R損傷誘導(dǎo)的過度ERS可通過下游的凋亡信號(hào)分子CHOP、caspase-12或JNK途徑激活凋亡機(jī)制，進(jìn)而激活下游的caspase-3等引起細(xì)胞凋亡，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，且caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路的特異性蛋白[11-14]。本研究發(fā)現(xiàn)H/R損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞caspase-12、CHOP的表達(dá)明顯升高，而ApoJ高表達(dá)可降低caspase-12、CHOP的表達(dá)，表明ApoJ可通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來減少M(fèi)I/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。H/R損傷后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)試圖恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)保護(hù)細(xì)胞，PERK途徑是UPR保護(hù)性機(jī)制中重要的信號(hào)通路。PERK通路激活后，真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(eIF2α)發(fā)生磷酸化，使細(xì)胞內(nèi)的大多數(shù)mRNA的翻譯下降，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白的折疊功能，阻止錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的進(jìn)一步聚集，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)[15-16]。Zhu等[17]研究表明eIF2α的磷酸化水平升高可使大腦缺氧/復(fù)氧造成的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷降至最低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)H/R損傷后eIF2α的磷酸化水平升高以減少未折疊蛋白及錯(cuò)誤蛋白的合成，ApoJ高表達(dá)后eIF2α的磷酸化水平進(jìn)一步升高使此保護(hù)作用增強(qiáng)，提示ApoJ是通過PERK/ eIF2α通路來減輕心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。

Salubrinal是一種由細(xì)胞合成的，誘導(dǎo)eIF2α磷酸化和抑制其去磷酸化的選擇性抑制物，能通過抑制eIF-2α去磷酸化和JNK磷酸化，減輕ERS和細(xì)胞凋亡。Mn(Ⅲ)TBAP是SOD的類似物、ROS的清道夫，可通過減少ROS而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R損傷導(dǎo)致LDH漏出量和caspase-3/7活性明顯升高，ApoJ高表達(dá)、Mn(Ⅲ)TBAP、Salubrinal可顯著降低心肌細(xì)胞LDH的漏出量和caspase-3/7活性。表明抑制H/R損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可減輕細(xì)胞損傷和凋亡。以上這些結(jié)果為ApoJ減輕H/R損傷誘導(dǎo)的心肌損傷提供了直接證據(jù)。

綜上所述，ApoJ通過抗氧化應(yīng)激和抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕H/R引起的心肌細(xì)胞損傷。

[1]Wilson MR,Easterbrook SB.Clusterin is a secreted mammalian chaperone[J].Trends Biochem Sci,2000,25(3):95-98.

[2]Jeong S,Ledee DR,Gordon GM,et al.Interaction of clusterin and matrix metalloproteinase-9 and its implication for epithelial homeostasis and inflammation[J].Am J Pathol,2012,180(5):2028-2039.

[3]Chaiwatanasirikul KA,Sala A.The tumour-suppressive function of CLU is explained by its localisation and interaction with HSP60[J].Cell Death Dis,2011,2(4):e219.

[4]Li Y,Sagar MB,Wassler M,et al.Apolipoprotein-J prevention of fetal cardiac myoblast apoptosis induced by ethanol[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,357(1):157-161.

[5]Jun HO,Kim DH,Lee SW,et al.Clusterin protects H9c2 cardiomyocytes from oxidative stress-induced apoptosis via Akt/GSK-3β signaling pathway[J].Exp Mol Med,2011,43(1):53-61.

[6]Ma Y,Kong L,Nan K,et al.Apolipoprotein-J prevents angiotensin Ⅱ-induced apoptosis in neonatal rat ventricular cells[J].Lipids Health Dis,2015(14):114.

[7]龐勇軍，孫莉，謝文娟，等．新生大鼠心肌細(xì)胞分離、純化及培養(yǎng)方法的改進(jìn)[J]．上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，4(4)：520-523．

[8]Ji L,Fu F,Zhang L,et al.Insulin attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury via reducing oxidative/nitrative stress[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2010,298(4):E871-E880.

[9]Zweier JL,Talukder MA.The role of oxidants and free radicals in reperfusion injury[J].Cardiovasc Res,2006,70(2):181-190.

[10]Schr?der M,Sutcliffe L.Consequences of stress in the secretory pathway:The ER stress response and its role in the metabolic syndrome[J].Methods in Moleculor Biology,2010,648:43-62.

[11]Groenendyk J,Sreenivasaiah PK,Kim do H,et al.Biology of endoplasmic reticulum stress in the heart[J].Circ Res,2010,107(10):1185-1197.

[12]Miyazaki Y,Kaikita K,Endo M,et al.C/EBP homologous protein deficiency attenuates myocardial reperfusion injury by inhibiting myocardial apoptosis and inflammation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(5):1124-1132.

[13]Ron D,Walter P.Signal interaction in the endoplasmic reticulum unfolded protein response[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(7):519-529.

[14]Higa A,Chevet E.Redox signaling loops in the unfolded protein response[J].Cell Signal,2012,24(8):1548-1555.

[15]Hetz C.The unfolded protein response:controlling cell fate decisions under ER stress and beyond[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2012,13(2):89-102.

[16]Belaidi E,Decorps J,Augeul L,et al.Endoplasmic reticulum stress contributes to heart protection induced by cyclophilin D inhibition[J].Basic Res Cardiol,2013,108(4):363.

[17]Zhu Y,Fenik P,Zhan G,et al.Eif-2a protects brainstem motoneurons in a murine model of sleep apnea[J].J Neurosci,2008,28(9):2168-2178.

Effect of apolipoprotein-J on hypoxia/reoxygenation induced myocardial cells injury in neonatal rat*

LiLijuan1,2，MaYanzhuo2，KongLingfeng2，ChenYu2，WangDongmei2△

(1.DepartmentofPostgraduates，HebeiNorthUniversity，Zhangjiakou，Hebei075000,China； 2.DepartmentofCardiology，BethuneInternationalPeaceHospital，Shijiazhuang，Hebei050000，China)

Objective To evaluate the effects of apolipoprotein-J(ApoJ)on hypoxia/reoxygenation(H/R)induced neonatal rat ventricular cells(NRVCs)injury and its related signaling pathways. Methods ApoJ high expression was achieved by infection with recombinant adenovirus in NRVCs. The three gas incubator was used to establish H/R model，SOD mimetic Mn(Ⅲ)tetrakis(4-benzoic acid)porphyrin chloride and eIF2α dephosphory inhibitor Salubrinal were performed the pretreatment. The NRVCs were divided into four groups:normal control group, H/R, ApoJ group, ApoJ+H/R group, Mn(Ⅲ)TBAP+H/R group and Salubrinal+H/R group. The cell viability was measured by MTT assay; the leakages of LDH, the expression of SOD and caspase-3/7 activity were detected by ELISA. The protein expression levels of ApoJ, Nox2/gp91phox, caspase-12, CHOP, and the phosphorylation level of eukaryotic initiation factor 2α(eIF2α)were determined by Western blot. Results ApoJ protein in myocardial cells was highly expressed after infection by recombinant adenoviru. Compared with the control group, the cell viability and the activity of SOD were significantly decreased, the leakages of LDH and the activity of caspase-3/7 were increased in the H/R group, the protein expression level of Nox2/gp91phox,caspase-12 and CHOP and the phosphorylation level of eIF2α were increased. Compared with the H/R group, the leakages of LDH and the activity of caspase-3/7 in the ApoJ overexpression group, Mn(Ⅲ)TBAP group and Salubirnal group were significantly decreased. ApoJ overexpression significantly increased the cell viability and the activity of SOD. Moreover, the protein expression level of Nox2/gp91phox, caspase-12 and CHOP were significantly decreased, while the phosphorylation level of eIF2α was markedly increased.Conclusion ApoJ alleviates H/R induced myocardial cellular injury by anti- oxidative stress and endoplasmic reticulum stress.

ApoJ；hypoxia/reoxygenation；endoplasmic reticulum stress；oxidative stress；cell apoptosis

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.002

河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(13967710D)。 作者簡介：李利娟(1988-)，在讀碩士，主要從事心血管內(nèi)科方面的研究?！?/p>

R331

A

1671-8348(2016)33-4612-04

2016-05-18

2016-07-13)