Alcalase對高溝捆蹄肌肉蛋白質(zhì)水解變化規(guī)律研究

張迎陽,強 敏,章建浩

(1.常州大學食品學院,江蘇常州 213164;2.鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,江蘇鎮(zhèn)江 212132;3.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

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Alcalase對高溝捆蹄肌肉蛋白質(zhì)水解變化規(guī)律研究

張迎陽1,強 敏2,章建浩3,*

(1.常州大學食品學院,江蘇常州 213164;2.鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,江蘇鎮(zhèn)江 212132;3.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

以豬后蹄肉為原料,在腌制過程添加Alcalase作為酶解劑,并通過響應(yīng)曲面實驗法優(yōu)化酶解工藝;通過SDS-PAGE電泳分析及游離氨基酸組分分析Alcalase對捆蹄蛋白質(zhì)的酶解作用規(guī)律。結(jié)果表明,Alcalase在腌制溫度為4～16 ℃時,對促進高溝捆蹄蛋白質(zhì)水解及提高其感官品質(zhì)有顯著的促進的作用(p<0.05),過量的Alcalase(大于1.6 U/g)會導致蛋白質(zhì)過度水解,不利于產(chǎn)品的感官品質(zhì)。響應(yīng)曲面法優(yōu)化捆蹄加工工藝結(jié)果為:Alcalase添加量1.32 U/g、腌制溫度14.2 ℃、腌制時間21.3 d,產(chǎn)品蛋白質(zhì)水解指數(shù)為14.81%,感官評分92.47。另外,添加Alcalase蛋白酶后,捆蹄中高分子蛋白(≥120 ku)有明顯的分解作用,并且在30～40 ku及50～70 ku處,蛋白質(zhì)條帶逐漸累積;Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Ile、Gly、His有顯著的增加,而Pro、Glu含量顯著降低(p<0.05)。因此,Alcalase能顯著促進捆蹄中蛋白質(zhì)的分解,提高產(chǎn)品的感官品質(zhì),可以應(yīng)用于捆蹄產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)加工。

捆蹄,Alcalase酶解,工藝優(yōu)化,蛋白質(zhì)水解

高溝捆蹄是江蘇省淮安市著名特產(chǎn),歷史悠久且加工過程精細,在全國范圍內(nèi)享譽盛名[1-2];其加工原料為豬蹄髈肉及其他調(diào)味料,具有原料廉價、食用方便的特點,深受消費者的喜歡[3-4]。但是隨著消費者生活水平的提高,在豐富產(chǎn)品風味品質(zhì)及營養(yǎng)成分的同時,消費市場對捆蹄的食用品質(zhì)也提出了更高的要求[5]。主要是因為捆蹄中含有較多的肌纖維蛋白質(zhì)及膠原蛋白質(zhì),影響了產(chǎn)品的嫩度,影響了現(xiàn)代消費者對產(chǎn)品的食用品質(zhì)[6]。因此,提高捆蹄的食用品質(zhì),以適應(yīng)現(xiàn)代消費理念,對促進高溝捆蹄的發(fā)展具有重要的推動作用。研究表明,在捆蹄腌制過程中添加的天然香辛料等對肉制品的嫩度改善作用較小[7-8];因此,本研究以酶解作用專一性較弱的Alcalase作為外源蛋白酶,利用其酶解作用專一性較弱的特點改善捆蹄的食用品質(zhì)。研究報道,Alcalase酶切作用位點主要為Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Trp[9-10],并且酶解條件溫和、產(chǎn)物安全性高、營養(yǎng)價值高、易消化、易與其他風味物質(zhì)搭配,是改造蛋白質(zhì),提高蛋白質(zhì)價值的最有效途徑之一,在風雞及肉的副產(chǎn)品加工領(lǐng)域中已有廣泛的應(yīng)用[11-13],但是在捆蹄等豬肉產(chǎn)品中的研究中還未見報道。本研究通過在腌制過程中添加Alcalase作為酶解腌制劑,通過響應(yīng)曲面實驗法優(yōu)化捆蹄酶解加工工藝,并且通過捆蹄產(chǎn)品的蛋白質(zhì)分解及游離氨基酸釋放規(guī)律驗證該工藝的可行性,以期為捆蹄產(chǎn)業(yè)的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬后蹄肉 同批豬肉,豬齡11個月,購自淮安蘇食肉品有限公司;食鹽、香辛料及調(diào)味料均為高溝市售;堿性蛋白酶(Alcalase)2.4L(酶活力>200×104U/g) 丹麥諾維信公司;考馬斯亮藍、過硫酸胺、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)、溴酚藍、巰基乙醇均為Sigma試劑公司;消化片(5.5 g硫酸鉀和0.5 g無水硫酸銅)、三氯乙酸(TCA)、硫酸(H2SO4)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、水楊酸、鹽酸等常規(guī)化學試劑均為國藥集團分析純級。

HH-W420數(shù)顯三用恒溫水箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;TM自動凱氏定氮儀 丹麥Foss分析儀器公司;FR-980生物電泳圖象分析系統(tǒng) 上海復日科技有限公司;Beckman Allegra 64R冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;2300型Kjeltec 101-O-S電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠;602S穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠;JA2203N電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;氨基酸自動分析儀 日本日立公司;SPX-250C型恒溫恒濕箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 捆蹄加工工藝 原料肉→清洗切碎→修整→腌制→捆扎→蒸煮→冷卻包裝

工藝加工點:腌制,將配制好的香辛料及調(diào)味料等與碎肉混勻,在所需的溫度條件下腌制;捆扎,將腌制好的原料肉用腸衣包裹,用長約蒸煮消毒過的麥草繩將包裹好的捆蹄先扎緊(間距約2 cm),成圓形蹄髈形狀(直徑約4 cm)。

1.2.2 單因素實驗 腌制溫度:在捆蹄腌制階段固定Alcalase添加量為1.2 U/g(酶溶液為10 U/g的磷酸緩沖液),分別在腌制溫度為0、4、8、12、16、20 ℃條件下,腌制20 h,分析產(chǎn)品蛋白質(zhì)的分解情況及感官評價結(jié)果。對照組:未添加Alcalase。

Alcalase添加量:在捆蹄腌制階段固定Alcalase添加量為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 U/g(酶溶液為10 U/g的磷酸緩沖液),在12 ℃條件下腌制20 h,分析產(chǎn)品蛋白質(zhì)的分解情況及感官評價結(jié)果。

腌制時間:在捆蹄腌制階段固定Alcalase添加量為1.2 U/g(酶溶液為10 U/g的磷酸緩沖液),在腌制溫度為12 ℃條件下分別腌制16、18、20、22、24、26 h,分析產(chǎn)品蛋白質(zhì)的分解情況及感官評價結(jié)果。對照組:未添加Alcalase。

1.2.3 響應(yīng)面法實驗設(shè)計 在Alcalase酶解捆蹄肌肉蛋白質(zhì)的單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上,以Alcalase添加量、腌制溫度及腌制時間為因素(以X1、X2、X3表示),具體取值范圍見表1;以產(chǎn)品的蛋白質(zhì)水解指數(shù)及感官評分值為響應(yīng)值采用design-expert8.0.6設(shè)計響應(yīng)曲面實驗。

表1 因素水平表Table 1 Levels and factors of test

1.2.4 蛋白質(zhì)水解指數(shù)測定 蛋白質(zhì)水解指數(shù)測定按照如下方法[14]:

總氮(TN)測定:將解凍的樣品剔除可見脂肪、肌內(nèi)膜和肌間膜并絞碎,稱取1.000 g上述樣品以及1塊消化片和12 mL濃硫酸于消化管中,消化1.5 h(420 ℃),用凱氏定氮儀測定樣品中氮的含量。

非蛋白氮(NPN)含量測定:將解凍的樣品剔除可見脂肪、肌內(nèi)膜和肌間膜并絞碎,稱取5.000 g上述樣品于離心管中,并加入25 mL的10% TCA(m/V)溶液混勻,10000 r/min下分三次高速勻漿20 s,4 ℃下放置過夜后5000 g冷凍離心5 min,過濾取濾液于消化管中,用5 mL硫酸于220 ℃下烘干水分,再將7 mL硫酸加入消化管中于420 ℃下消化1.5 h,用凱氏定氮儀測定樣品中氮的含量。

蛋白質(zhì)水解指數(shù)(P.I.%)=NPN/TN%

1.2.5 游離氨基酸組成測定 參照Virgil的方法測定[15]:準確稱取樣品6.00 g,加入60 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5),勻漿(6000 r/min,3 min),離心(10000×g,4 ℃,20 min),定容至100 mL,取上清液5 mL,用3%水楊酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.0,離心(15000×g,4 ℃,20 min),用雙蒸水定容至10 mL,取溶液0.5 mL,使用0.02 mol/L鹽酸稀釋5倍,用氨基酸自動分析儀檢測。檢測條件:洗脫液為檸檬酸緩沖液(pH3.3～4.9),顯色液為茚三酮∶乙二醇甲醚∶乙酸鈉緩沖液=2.75∶25∶1,除羥脯氨酸在440 nm檢測外,其余氨基酸均在570 nm檢測。

表2 感官評價指標及標準Table 2 Evaluation and standards of sensory evaluation

1.2.6 SDS-PAGE電泳分析 SDS-PAGE實驗方法[16-17]:將酶解后的蛋白產(chǎn)物配制成蛋白樣品并與標準分子量蛋白進行SDS-PAGE,分離膠濃度為10%,濃縮膠濃度為5%,用考馬斯亮藍G-250染色,Quantity-One分析蛋白質(zhì)分子量。

1.2.7 感官評定方法 分別請具有捆蹄生產(chǎn)經(jīng)驗的技術(shù)人員10人參加產(chǎn)品的感官評定,產(chǎn)品的感官評價方法采用趙接紅[1]對淮陽捆蹄的感官評定方法,分別從顏色、氣味、滋味、質(zhì)地四個方面分析。具體指標見表2(n=3)。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)整理及作圖分析。不同平均值之間用SAS 9.2(SAS Institute Inc,Cary,North Carolina,USA)統(tǒng)計軟件的GLM程序(General Linear Model procedure)中的鄧肯氏多重比較法(Duncan’s Multiple Range Test)進行差異顯著性檢驗(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alcalase酶解捆蹄肌肉蛋白質(zhì)過程的單因素分析

肉制品中蛋白質(zhì)水解指數(shù)是非蛋白氮與蛋白氮的比值,是衡量肉制品品質(zhì)的重要指標;研究表明,在肌肉中蛋白質(zhì)水解指數(shù)超過15.0%時會明顯增加其嫩度,但可能會出現(xiàn)變粘、不成形等不良現(xiàn)象[2,18],因此調(diào)控捆蹄中蛋白質(zhì)的水解程度也是提高產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素。圖1為腌制溫度對捆蹄品質(zhì)的影響。隨著腌制溫度的升高,捆蹄的蛋白質(zhì)水解指數(shù)呈顯著的升高趨勢(p<0.05),并且在腌制溫度大于8 ℃后,實驗組蛋白質(zhì)水解指數(shù)顯著高于對照組(p<0.05);因此可以看出,Alcalase對捆蹄蛋白質(zhì)水解有促進作用;當腌制溫度為20 ℃時,該指標為16.35%±0.18%。對應(yīng)產(chǎn)品的感官品質(zhì)可以看出,伴隨著蛋白質(zhì)水解程度的增加,在一定腌制溫度范圍內(nèi)(4～16 ℃),實驗組感官評分顯著高于對照組。因此,在一定腌制溫度范圍內(nèi)(4～16 ℃),Alcalase可顯著提高捆蹄產(chǎn)品的感官品質(zhì)(p<0.05)。

圖1 不同腌制溫度對捆蹄蛋白質(zhì) 水解指數(shù)及感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of temperature on PI and sensory evaluation of bundle hoof

由圖2可以看出,隨著Alcalase添加量的增加,捆蹄蛋白質(zhì)水解指數(shù)呈顯著的增加趨勢(p<0.05),并且在添加量大于1.2 U/g后,蛋白質(zhì)水解指數(shù)急劇增加,對應(yīng)的產(chǎn)品的感官品質(zhì)隨著Alcalase添加量的增加呈顯著的增加(p<0.05)。但是,當酶添加量大于1.6 U/g后,感官品質(zhì)顯著降低(p<0.05)。主要是因為過量的Alcalase導致捆蹄蛋白質(zhì)過度水解,從而降低了產(chǎn)品的感官品質(zhì)[14]。

圖2 Alcalase添加量對捆蹄蛋白質(zhì) 水解指數(shù)及感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of Alcalase dosage on PI and sensory evaluation of bundle hoof

表3 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果Table 3 Results of response surface

注:同列中不同字母(a.b.c…)表示差異顯著(p<0.05)。由圖3可以看出,隨著腌制時間的延長,捆蹄的蛋白質(zhì)水解指數(shù)呈顯著的增加趨勢,并且實驗組顯著高于對照組(p<0.05);在腌制26 d時,實驗組蛋白質(zhì)水解指數(shù)為15.56%±0.19%;而對于產(chǎn)品的感官品質(zhì),對照組在腌制過程中呈顯著的增加趨勢;但是對于實驗組,在腌制22 d后出現(xiàn)顯著的下降趨勢(p<0.05),可能是因為隨著腌制時間的延長,Alcalase導致蛋白質(zhì)過度水解,從而影響了產(chǎn)品的風味品質(zhì)[14]。

圖3 不同腌制時間對捆蹄蛋白質(zhì) 水解指數(shù)及感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of time on PI and sensory evaluation of bundle hoof

綜合上述分析可以看出,在捆蹄的腌制過程中,外源蛋白酶Alcalase能顯著的促進捆蹄蛋白質(zhì)水解的進程,并且與腌制條件呈顯著的相關(guān)性。進一步優(yōu)化腌制工藝對捆蹄生產(chǎn)加工有重要的意義。

2.2 高溝捆蹄腌制工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果 從響應(yīng)曲面實驗結(jié)果可以看出,部分處理組能顯著提高蛋白質(zhì)水解指數(shù),并且對捆蹄的感官評分有顯著的促進作用。

2.2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

2.2.2.1 回歸模型建立及顯著性分析 對表3中的數(shù)據(jù)分別以PI(Y1)及感官評分(Y2)為響應(yīng)值,以Alcalase添加量(X1)、腌制溫度(X2)、腌制時間(X3)為自變量建立二次回歸模型如式(1)、式(2)。為了進一步分析回歸模型的顯著性及變量因素對響應(yīng)值的影響程度,對模型系數(shù)進行檢驗結(jié)果見表4。

Y1=15.040+1.883X1-0.432X2-0.711X3+0.180X1X2+0.213X1X3+0.083X2X3-2.624X12-0.044X22-5.766×10-3X32

式(1)

Y2=-93.511+40.946X1+3.935X2+12.310X3+0.143X1X2-0.057X1X3+0.027X2X3-15.840X12-0.166X22-0.296X32

式(2)

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Test for significance of regression coefficients

注:p<0.01水平極顯著,用**表示,p<0.05水平顯著,用*號表示。

表5 不同處理捆蹄中游離氨基酸含量分析Table 5 Analysis of hydrophobic amino acids in bundle hoof

注:同行中不同字母(a.b)表示差異顯著(p<0.05)。2.2.2.2 模型的交互作用分析 腌制溫度與腌制時間對PI的交互作用分析:在固定Alcalase添加量為1.2 U/g時,腌制溫度及腌制時間對捆蹄蛋白質(zhì)水解指數(shù)影響的交互作用結(jié)果見圖4。從圖中可以看出,在腌制溫度為12～18 ℃時,腌制時間存在臨界值約為20～22 ℃;并且從圖中可以看出,隨著腌制溫度的升高,影響捆蹄蛋白質(zhì)水解指數(shù)的腌制時間的臨界值呈顯著的降低趨勢。

圖4 腌制溫度和腌制時間 對蛋白質(zhì)水解指數(shù)的交互作用影響Fig.4 Interactive effect between temperature and time on PI

2.2.2.3 工藝優(yōu)化 綜合上述分析,利用design-expert8.0.6自帶的回歸分析程序?qū)嶒炛薪⒌幕貧w模型進行優(yōu)化分析,在固定蛋白質(zhì)水解指數(shù)為13%～15%時,以感官評分的最大值為優(yōu)化目標,得到捆蹄腌制優(yōu)化工藝為:Alcalase添加量1.32 U/g、腌制溫度14.2 ℃、腌制時間21.3 d,得到PI為14.81,感官評分92.47。以該工藝腌制捆蹄進行驗證實驗得到,PI為14.73%±0.21%,感官評分為93.11±0.86,相對誤差小于5%。因此該工藝可以用于捆蹄的生產(chǎn)加工。

2.3 捆蹄肌肉蛋白質(zhì)Alcalase酶解規(guī)律分析

2.3.1 SDS-PAGE電泳分析 研究表明,Alcalase對蛋白質(zhì)的酶解作用主要集中于大于72 ku的分子條帶,并且小于30 ku的分子條帶逐漸累積[19]。通過SDS-PAGE電泳分析后可以看出,相比于對照組,實驗組中高分子蛋白(≥120 ku)有明顯的分解作用,表現(xiàn)為該處蛋白條帶逐漸變暗;另外,在30～40 ku及50～70 ku處,也存在蛋白質(zhì)逐漸變暗。因此進一步證明,Alcalase對促進捆蹄蛋白質(zhì)分解有明顯的促進作用。

圖5 捆蹄蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.5 Result of SDS-PAGE electrophoresis of bundle hoof proteins注:a為實驗組;b為對照組。

2.3.2 游離氨基酸釋放規(guī)律研究 Alcalase是一種專一性較弱的蛋白酶,能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)深度酶解,并且在肌肉蛋白質(zhì)酶解中,Alcalase作用位點主要集中于Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Trp,可顯著增加肌肉中游離氨基酸含量[10,20]。從表5可以看出,實驗組捆蹄中游離氨基酸總量顯著高于對照組(p<0.05),并且Ala、Leu、Val、Tyr、Phe均有顯著的增加(p<0.05),進一步證明了Alcalase嫩化捆蹄肌肉成分的作用。但是對捆蹄中游離氨基酸的結(jié)果可以看出,與對照組相比,除了Ala、Leu、Val、Tyr、Phe外,Ile、Gly、His也有顯著的增加。另外,在實驗組中,Pro、Glu含量顯著低于對照組(p<0.05),可能是因為在腌制過程中轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌L味成分。

3 結(jié)論

Alcalase在腌制溫度為4～16 ℃時,對促進高溝捆蹄蛋白質(zhì)水解及提高其感官品質(zhì)有顯著的促進的作用(p<0.05),并且過量的Alcalase(大于1.6 U/g)會導致蛋白質(zhì)過度水解,從而降低了產(chǎn)品的感官品質(zhì);腌制溫度及腌制時間對捆蹄蛋白質(zhì)水解指數(shù)有顯著的交互作用,表現(xiàn)為隨著腌制溫度的升高,影響捆蹄蛋白質(zhì)水解指數(shù)的腌制時間的臨界值呈顯著的降低趨勢。響應(yīng)曲面法優(yōu)化捆蹄加工工藝為:Alcalase添加量1.32 U/g、腌制溫度14.2 ℃、腌制時間21.3 d,得到PI為14.81%,感官評分92.47。SDS-PAGE電泳分析后可以看出,實驗組中高分子蛋白(≥120 ku)有明顯的分解作用,并且在30～40 ku及50～70 ku處,也存在蛋白質(zhì)條帶逐漸變暗。腌制結(jié)束后,Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Ile、Gly、His有顯著的增加,而Pro、Glu含量顯著降低(p<0.05)。

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Study on muscle protein hydrolysis by Alcalase and optimization pickled process of Gaogou bundle hoof

ZHAGN Ying-yang1,QIANG Min2,ZHANG Jian-hao3,*

(1.College of Food Science,Changzhou University,Changzhou 213164,China;2.Zhenjiang product quality supervision and inspection center,Zhenjiang 212132,China;3.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Inthisstudy,hindhoofmeatwasusedtoproducebundlehoofwithAlcalaseascuringagentandtheprocesswasoptimizedbyresponsesurfacemethod.EnzymatichydrolysisofAlcalaseonbundlehoofproteinwasanalyzedbythemethodofSDS-PAGEelectrophoresisandfreeaminoacidsreleased.TheresultshowedthatAlcalasecouldpromoteproteolysisandimprovethesensoryqualityofbundlehoofwithpickledtemperatureat4～16 ℃.BundlehoofproteincouldbeexcessivehydrolysisandhadbadsensoryqualitywiththeAlcalasedosagehigherthan1.6U/g.TheresultofbundlehoofprocessingoptimizedbytestofresponsesurfacewasAlcalasedosagewas1.32U/gandpickledtemperaturewas14.2 ℃andpickledtimewas21.3d,thenPIwas14.81%andsensoryevaluationwas92.47.SDS-PAGEelectrophoresisshowedproteinhandswithhigherthan120,30～40kuand50～70kuweredecompositionsignificantly,thenAla,Leu,Val,Tyr,Phe,Ile,Gly,HiswassignificantincreasedandPro,Glu(p<0.05)wasdecreasedsignificantly.ItwascouldbeconcludethatAlcalasecouldsignificantlypromotethedecompositionofbundlehoofproteinandimprovethesensoryqualityoftheproduct.SotheAlcalasecouldbeappliedtobundlehoofproduction.

bundlehoof;Alcalase;processoptimization;proteolysis

2016-06-06

張迎陽(1980-)，男，博士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制，E-mail:callfull@163.com。

*通訊作者:章建浩(1961-)，男，博士，教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制，E-mail:nau_zjh@njau.edu.cn。

淮安市科技計劃項目(HAN2014030)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303082-2)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)21-0249-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.039