5種海棠葉茶抗氧化成分組成及品質(zhì)差異性分析

劉天慶,李厚華,辛轉(zhuǎn)霞,劉小微,李 果,湯努爾·瓦力拜

(西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

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5種海棠葉茶抗氧化成分組成及品質(zhì)差異性分析

劉天慶,李厚華*,辛轉(zhuǎn)霞,劉小微,李 果,湯努爾·瓦力拜

(西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

以5種海棠葉制成的茶為材料,利用高效液相色譜法(HPLC),DPPH·,ABTS+·清除力測(cè)定以及總還原力測(cè)定等方法對(duì)其抗氧化成分及能力進(jìn)行差異性分析,并按照《GB/T23776-2009茶葉感官評(píng)審方法》對(duì)海棠葉茶進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。結(jié)果表明:五種海棠葉茶總酚含量變化范圍為(69.32±2.16)～(89.54±1.14) mg/g,雪球海棠最高,鉆石海棠最低。5種海棠葉茶檢測(cè)出酚類物質(zhì)有沒食子酸、原花青素B2、根皮苷、綠原酸、蘆丁、櫟素、矢車菊素半乳糖苷,其中根皮苷含量最高。抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,王族海棠,湖北海棠,雪球海棠在DPPH·,ABTS+·清除能力,以及總還原力上均明顯高于草莓果凍與鉆石海棠。茶葉感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,與傳統(tǒng)湖北海棠葉茶比較,王族海棠、雪球海棠葉茶色澤均勻,香氣濃耐聞,口感醇香,具有茶澀味,整體品質(zhì)佳。結(jié)果表明,王族海棠、雪球海棠葉茶抗氧化能力強(qiáng),茶葉品質(zhì)佳,開發(fā)成新型茶葉潛力大。

海棠葉茶,抗氧化能力,成分含量,感觀品質(zhì)

隨著社會(huì)的發(fā)展,人們對(duì)茶的認(rèn)識(shí)已經(jīng)涵蓋了可用來沖泡、保健的一切飲品,例如近年研制成的枸杞葉茶、梨棗葉茶、香椿葉茶等。梨棗葉與香椿葉之所以能開發(fā)成茶葉,與其富含多酚及較強(qiáng)的抗氧化能力密不可分[1-2]。多酚是植物體中重要的次生代謝產(chǎn)物,具有生物活性及藥理功能,其含量與抗氧化能力具有相關(guān)性,長(zhǎng)期飲用富含多酚的茶葉能改善老齡化神經(jīng)細(xì)胞,降低癌癥發(fā)病率及死亡率[3-5]。據(jù)記載,海棠葉作為茶飲已有400多年歷史,在三峽地區(qū)廣為飲用[6]。其中湖北海棠又名茶海棠、花海茶,俗稱花紅茶,屬于無毒物質(zhì),國(guó)家衛(wèi)計(jì)委于2014年批準(zhǔn)其葉為新食品原料[7-9],但對(duì)湖北海棠葉茶多酚含量及抗氧化能力研究鮮有報(bào)道[10-11]。前期我們對(duì)王族海棠(Malus‘Royalty’)成色色素分析中發(fā)現(xiàn),其葉也富含多酚成分且比湖北海棠葉茶高[12],這些研究為多種海棠葉開發(fā)成保健茶提供了可能性。

湖北海棠(Malushupehensis)、‘雪球’海棠(Malus‘Snow Drift’)、‘王族’海棠(Malus‘Royalty’)、‘鉆石’海棠(Malus‘Sparkler’)、‘草莓果凍’海棠(Malus‘Strawberry Parfait’)均屬薔薇科蘋果屬[13]。本研究將5種海棠葉制作茶,測(cè)定其總酚、單體酚、清除DPPH·能力、ABTS+·清除能力、總還原能力、水浸出物、可溶性糖、氨基酸的含量多少,并對(duì)5種海棠葉茶感觀品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià),為5種海棠葉茶的制作進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海棠嫩葉 采摘于西北農(nóng)林科技大學(xué)海棠種質(zhì)資源圃,4月初采摘各品種嫩葉,當(dāng)天制茶。色譜級(jí)甲醇及乙腈購(gòu)自品譜公司;標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、原花青素B2、根皮苷、綠原酸、蘆丁、櫟素、矢車菊素半乳糖苷 購(gòu)自天津金測(cè)分析技術(shù)有限公司;福林酚試劑、DPPH 西格瑪奧德里奇公司,ABTS 沃爾森公司;Trolox Sigma公司;乙酸乙酯、無水甲醇、鹽酸、無水乙醇、碳酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁及亞硝酸鈉等分析純?cè)噭?品譜公司。

SIGMA3-18K高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)西格瑪;JD200-3電子天平 沈陽龍騰電子有限公司;UV-2450分光光度計(jì) 日本島津;L-2000高效液相色譜儀 日本日立;LGJ-100冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)儀器公司;MS-100恒溫混勻儀 美國(guó)賽默飛;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗氧化活性物質(zhì)提取 稱取茶葉5 g,450 mL沸水沖泡10 min,室溫下冷卻過濾后定容到500 mL,6000 r/min 離心5 min,取上清液冷藏備用[2]。

1.2.2 總酚含量測(cè)定 總多酚含量測(cè)定參考YI等[14]的方法并稍作修改。取5 μL提取液于試管中,分別加入1.58 mL ddH2O、100 μL FC(Folin-ciocalteu∶H2O=1∶1),混勻充分反應(yīng)1 min,再加入300 μL 20%水合碳酸鈉(w/v)混勻,室溫黑暗中放置30 min,于波長(zhǎng)765 nm處測(cè)量混合液的吸光度?？偡右詻]食子酸當(dāng)量(mg GAE/100 g DW)表示。

1.2.3 酚類物質(zhì)分析 酚類物質(zhì)分析參考LI等[15]液相色譜檢測(cè)參數(shù):Inertsil ODS-3柱:4.6 mm×250 mm,5 μm(GL,Japan),柱溫30 ℃,流速1.0 mL/min。流動(dòng)相參數(shù);A:10%的甲酸水溶液,B:色譜級(jí)乙腈包含10%的甲酸,1.36%的水。采用梯度洗脫,洗脫程序?yàn)?95% A(0 min),85% A(25 min),78% A(42 min),64% A(60 min),95% A(75 min)。酚類物質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)280,320,365、525 nm。

1.2.4 抗氧化活性測(cè)定 DPPH·清除能力測(cè)定參考FRIEDMAN等[16]并稍作修改。取10 μL甲醇提取液和2 mL的62.5 μmol/L DPPH溶液,混勻后立即測(cè)517 nm波長(zhǎng)下的吸光度A1。將其在室溫黑暗下放置30 min,再次測(cè)定吸光度A2。以Trolox 為標(biāo)準(zhǔn)品,樣品DPPH·清除能力以100 g 干樣中所含Trolox 的當(dāng)量毫摩爾數(shù)表示(μmol Trolox eq./100 g DW)。

ABTS+·清除能力測(cè)定參考TAI等[17]方法并稍作修改。配制7 mmol/L的ABTS+·溶液,用0.2 mol/L pH4.5的醋酸鈉緩沖液將其稀釋至吸光度為0.7±0.02。取1 mL稀釋后的ABTS+·溶液和5 μL甲醇提取液,混勻后于734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A1。反應(yīng)2 min后,再次測(cè)定吸光度A2。以Trolox(水溶性VE)作為標(biāo)準(zhǔn)品,結(jié)果以每100 g茶樣樣品中含有Trolox的當(dāng)量(μmol TE/100 g)表示。

總還原力測(cè)定:將10 μL的樣品溶液與0.2 mol/L的磷酸鈉溶液(pH6.6)2 mL和1%鐵氰化鉀溶液2 mL混合后,于50 ℃水浴鍋下保溫反應(yīng)20 min,再快速冷卻后加入10%三氯乙酸2 mL混勻,于3000 r/min離心10 min,得到上清液。取1 mL上清液,然后加入0.1%的三氯化鐵溶液0.2 mL和1 mL蒸餾水混勻于試管中,反應(yīng)30 min后于700 nm下測(cè)定吸光值。以維生素C為標(biāo)準(zhǔn)品,樣品中所含維生素C的當(dāng)量毫克數(shù)表示(mg vitamin C eq./g DW)。

1.2.5 海棠葉茶感官品質(zhì)審評(píng) 制作工藝:嫩葉采摘→清洗→瀝干萎蔫→殺青→揉捻攤晾→烘干→冷卻干燥→檢驗(yàn)包裝。按照《GB/T23776-2009茶葉感官評(píng)審方法》[18]稍作修改對(duì)海棠葉茶沖泡及評(píng)價(jià)評(píng)分。沖泡方式為:每樣品4克,放入200 mL透明的茶杯中,倒入開水沖泡,封口靜置4 min,樣品匿名。由具有感官評(píng)價(jià)技能的7人組成評(píng)價(jià)小組對(duì)海棠葉茶進(jìn)行感官評(píng)價(jià),采用權(quán)重值對(duì)香氣、滋味、湯色進(jìn)行評(píng)分。觀察評(píng)判后記錄數(shù)據(jù)。感官品質(zhì)計(jì)算公式:百分制×權(quán)重值(U),U={香氣(30%),滋味(40%),湯色(30%)},總分=香氣+滋味+湯色,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard

1.2.6 海棠葉茶滋味品質(zhì)分析 水浸出物含量測(cè)定參照GB/T 8305-2002《茶水浸出物測(cè)定》;可溶性糖含量測(cè)定參照蒽酮比色法;氨基酸含量測(cè)定參照GB/T 8314-2002;《茶游離氨基酸總量測(cè)定》采用茚三酮比色法測(cè)定。

茶多酚含量測(cè)定參考Yao L H等[19]的方法,稱取2 g(精確到0.001 g)茶葉樣品于250 mL錐形瓶中,加入200 mL煮沸蒸餾水,90 ℃水浴中浸提10 min,過濾,殘?jiān)脽嵴麴s水洗滌2～3次,合并濾液,冷卻至室溫、定容。準(zhǔn)確吸取茶葉提取液2 mL,注入25 mL的容量瓶中,加入蒸餾水4 mL,酒石酸鹽溶液5 mL,用pH7.5磷酸鹽緩沖溶液稀釋定容至25 mL,混勻后,在540 nm處,以試劑空白溶液作參比,測(cè)定吸光度。

表2 不同品種海棠葉茶單體酚含量(mg/100 g DW)Table 2 Comparative contents of polyphenols in crabapples leaf tea(mg/100 g DW)

茶多酚(%)=3.914×E×V0×100/1000/V1/W

式中:E:吸光值;V0:茶葉浸提液總體積(250 mL);V1:測(cè)定所用茶葉浸提液體積(2 mL);W:茶葉樣品的干物質(zhì)質(zhì)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、SPSS Statistics19進(jìn)行顯著性分析,0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚含量分析

5種海棠葉茶的總酚含量測(cè)定結(jié)果表明:含量范圍為(69.32±2.16)～(89.54±1.14) mg/g,不同品種海棠葉茶之間總酚含量存在著明顯的差異性(p<0.05)。鉆石海棠葉茶含量最低(69.32±2.16) mg/g,雪球海棠葉茶總酚含量最高,達(dá)到(89.54±1.14) mg/g,比鉆石海棠高出29.17%。湖北海棠、王族海棠、草莓果凍海棠葉茶多酚含量分別比鉆石海棠高出10.68%、22.39%、20%,但均超過了梨棗葉[(31.37±0.21) mg/g][2],說明這5種海棠葉茶總酚含量整體上最高(圖1)。

圖1 不同海棠葉茶總酚含量比較Fig.1 Comparative contents of total phenols of different varieties of crabapples leaf tea注:不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05)，圖3～圖5同。

2.2 海棠葉茶單體酚類物質(zhì)成分定性分析

經(jīng)高效液相色譜儀定性分析,在不同的波長(zhǎng)檢測(cè)下,還存在未知的酚類物質(zhì),說明海棠葉茶中酚類物質(zhì)成分比較復(fù)雜。其中,5種海棠葉茶中已檢測(cè)到的酚類物質(zhì)有:沒食子酸、原花青素B2、根皮苷、綠原酸、蘆丁、櫟素、矢車菊素半乳糖苷。5種海棠葉茶已知的單體酚中,根皮苷含量最高且在不同海棠中差異性顯著(p<0.05),蘆丁、矢車菊素半乳糖苷及櫟素含量其次,綠原酸、沒食子酸、原花青素B2含量較少。沒食子酸能有效降低食管癌細(xì)胞的增殖與侵襲[20],其中王族海棠葉茶沒食子酸含量最高;原花青素B2對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[21],其中雪球海棠葉茶原花青素B2最高,是含量最低的王族海棠葉茶的4倍;綠原酸能輔助降血糖[22],其中雪球海棠葉茶綠原酸含量最高,是含量最低的湖北海棠葉茶的10倍左右;蘆丁能保護(hù)硝普鈉誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷[23],其中草莓果凍海棠葉茶蘆丁含量最高,是含量最低的鉆石海棠4.7倍;櫟素具有止瀉作用的一種黃酮類化合物[24],其中湖北海棠葉茶櫟素含量最高,是含量最低的王族海棠葉茶的5倍;矢車菊素半乳糖苷是紅色葉的主要色素,在食品與藥品方面開發(fā)具有廣闊前景[25],其中草莓果凍海棠葉茶矢車菊素半乳糖苷含量最高,是含量最低的雪球海棠葉茶的203倍(表2)。

圖2 HPLC分析海棠葉茶酚類物質(zhì)Fig.2 HPLC of phenolic compositions in pear crabapples leaf tea注：A-1、A-2、A-3、A-4分別代表標(biāo)準(zhǔn)樣品在280、320、365、520 nm吸收峰值;B-1、B-2、B-3、B-4分別代表樣品(王族海棠葉茶)在280、320、365、520 nm吸收峰值;1.沒食子酸;2.原花青素B2;3.根皮苷;4.綠原酸;5.蘆丁;6.櫟素;7.矢車菊素半乳糖苷。

圖3 5種海棠葉茶DPPH·清除率Fig.3 DPPH· clearance rate of 5 kinds of crabapples leaf tea

圖4 5種海棠葉茶ABTS+·清除能力Fig.4 ABTS+· clearance capacity of 5 kinds of crabapples leaf tea

表3 海棠葉茶主要品質(zhì)分析Table 3 Crabapples leaf tea major quality analysis

表5 5種海棠葉茶感官評(píng)分結(jié)果Table 5 Results for the sensory evaluation of five tea of leaves crabapples

2.3 海棠葉茶抗氧化能力分析

由圖3可知,5種海棠葉茶均具有較強(qiáng)的清除DPPH·的活性,清除率具有明顯的差異性(p<0.05)。其中,王族海棠葉茶清除能力最強(qiáng),比清除率最差的草莓果凍海棠高78.41%。雪球海棠葉茶與湖北海棠葉茶的ABTS+·清除能力明顯高于王族海棠、草莓果凍海棠、鉆石海棠葉茶(圖4)。5種海棠葉茶總還原力具有明顯的差異性(p<0.05),湖北海棠、雪球海棠、王族海棠葉茶總還原能力明顯高于草莓果凍海棠與鉆石海棠葉茶(圖5)。說明湖北海棠、雪球海棠與王族海棠葉茶具有較高的抗氧化能力。

圖5 5種海棠葉茶總還原能力Fig.5 The total capacity of 5 kinds of crabapples leaf tea

2.4 海棠葉茶主要品質(zhì)分析

5種海棠葉茶水浸出物含量在40.66%±0.01%～44.49%±0.02%,5種海棠葉茶浸出物差異性不明顯(p>0.05)。5種海棠葉茶可溶性糖含量差異性明顯(p<0.05),草莓果凍海棠葉茶可溶性糖含量最高,雪球海棠含量最低,最高者含量比最低者高出26.22%。茶多酚含量,湖北海棠含量最高,雪球海棠含量最低,王族海棠、草莓果凍海棠茶多酚含量差異性不明顯(p>0.05)。5種海棠葉茶氨基酸含量中,湖北海棠葉茶含量最高7.43%±0.17%,鉆石海棠含量最低3.35%±0.21%,最高者比最低者高出1.22倍。5種海棠葉茶酚氨比值大小順序?yàn)殂@石海棠>草莓果凍海棠>湖北海棠>王族海棠>雪球海棠。

2.5 5種海棠葉總酚及酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性的相關(guān)分析

總酚及酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性的相關(guān)分析見。海棠葉茶5種酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性差異性大,總酚含量與還原力相關(guān)性明顯(p<0.01),r值為0.91,其他單體酚相關(guān)性未見顯著,這表明海棠葉茶中的多酚與對(duì)抗氧化起主要作用(表4)。

表4 5種海棠葉總酚及酚類物質(zhì)含量 與抗氧化活性的相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis of five kinds crabapples leaf total phenols,flavonoids and polyphenols content and antioxidant activity

注:*相關(guān)性在0.05水平顯著;**相關(guān)性在0.01水平顯著。2.6 5種海棠葉茶感官評(píng)價(jià)

對(duì)5種海棠葉茶在同一條件下沖泡,分別按照茶湯香氣、滋味和湯色3項(xiàng)因子評(píng)分,結(jié)果表明湖北海棠與雪球海棠、王族海棠葉茶差異性不顯著(p>0.05),與草莓果凍海棠、鉆石海棠葉茶差異性顯著(p<0.05)。王族海棠葉茶在總評(píng)分中最高,總分達(dá)到81.54,其色澤均勻,香氣濃耐聞,口感醇香具茶澀味,品質(zhì)最佳,同時(shí)具有相對(duì)較高的抗氧化能力。雪球海棠與湖北海棠葉茶評(píng)分相近,也適宜制茶。鉆石海棠、草莓果凍海棠制作的茶香氣較淡,有草腥味,湯色渾濁等缺點(diǎn),茶感官評(píng)分較低(表5)。

3 結(jié)論

湖北海棠葉茶具有治療消化不良、抗菌消炎、降血糖等功能,這些治療功效與其葉富含多酚關(guān)系密不可分[26-27]。湖北海棠多酚含量為(84.84±1.23) mg/g,而王族海棠與湖北海棠多酚含量相差無幾,雪球海棠總酚含量比湖北海棠多出5.53%。說明與湖北海棠葉茶相比較,這2種海棠葉茶也富含多酚成分。已檢測(cè)酚類物質(zhì)中,發(fā)現(xiàn)5種海棠葉茶中含有沒食子酸、原花青素B2、根皮苷、綠原酸、蘆丁、櫟素、矢車菊素半乳糖苷等成分,后期的實(shí)驗(yàn)中還需要對(duì)未知的單體酚物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。在本實(shí)驗(yàn)中根皮苷含量在幾種酚類物質(zhì)中含量最高的,草莓果凍海棠葉茶含量最低為(165.93±7.67) mg/100 g,最高為湖北海棠葉茶(1423.77±115.35) mg/100 g,說明海棠葉茶具有高根皮苷含量的特點(diǎn),在董華強(qiáng)的研究中表明高含量的根皮苷對(duì)防治糖尿病效果顯著[28]。海棠葉茶總酚與總還原能力之間存在較高相關(guān)性(p<0.01),對(duì)于DPPH自由基和ABTS+酚類的相關(guān)性不明顯。與湖北海棠相比較,雪球海棠與王族海棠葉茶也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力,且對(duì)于DPPH自由基、ABTS+,總還原能力等不同測(cè)定方法中表現(xiàn)出一致性。

有研究表明茶葉水浸出物的含量在30%～47%與茶葉品質(zhì)呈正相關(guān),且可溶性糖使茶湯具有甜味,對(duì)茶湯的滋味影響呈負(fù)相關(guān)[29-30],5種海棠葉茶浸出物均在40%上,說明浸出物含量比較豐富。與湖北海棠相比,雪球海棠、王族海棠可溶性糖含量較低,這有利于其提高品質(zhì)。茶多酚使茶湯呈苦澀,氨基酸含量越多,茶湯越呈鮮爽性,茶葉品質(zhì)越高,茶多酚和氨基酸的比值(酚氨比)反映茶湯的生化指標(biāo)[31-33]。因此,雪球海棠、王族海棠與湖北海棠相比較,兩者也具有低含量茶多酚、高氨基酸的特點(diǎn),這使雪球海棠與王族海棠茶湯具有了苦澀味較輕,滋味鮮爽,品質(zhì)優(yōu)良的物質(zhì)保證。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,草莓果凍海棠與鉆石海棠雖具有一定的抗氧化能力,但其制作的茶缺點(diǎn)明顯,口感略差,而王族海棠,雪球海棠與傳統(tǒng)的湖北海棠葉茶相比,抗氧化能力更強(qiáng),且制出的茶綜合評(píng)價(jià)更高,可開發(fā)為新型的健康茶飲。

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Differences in antioxidant components and activity of 5 crabapples(Malus)leaf tea

LIU Tian-qing,LI Hou-hua*,XIN Zhuan-xia,LIU Xiao-wei,LI Guo,Walibai Tangnuer

(College of Landscape Architecture and Arts,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

Thephenoliccompoundsandantioxidantactivityof5kindsofteafromtheleavesofcrabappleweredeterminedusingHighPerformanceLiquidChromatography(HPLC),DPPH·andABTS+·radicalscavengingmethods.ThesensoryevaluationsofcrabapplesleafteawereassayedbyGB/T23776-2009methods.Theresultsindicatedthatthetotalphenolsrangedfrom(69.32±2.16)to(89.54±1.14)mg/g,andthehighestwasMalus ‘SnowDrift’,whilethelowestwasMalus ‘Sparkler’.Phenoliccompoundsmainlyweregallicacid,procyanidin-B2,phlorizin,chlorogenicacid,rutinum,quercitrin,Cyanidin-3-galactoside,inwhichthehighestcontentwasphlorizin.TheteaantioxidantcapacityofMalus hupehensis,Malus ‘SnowDrift’,Malus ‘Royalty’leafweresignificantlyhigherthantheMalus ‘StrawberryParfait’,Malus ‘Sparkler’leafteainallthreemethods.ComparedwiththetraditionalMalus hupehensisleaftea,Malus ‘Royalty’,Malus ‘SnowDrift’leafteahaduninformedcolor,strongeraromaresistantsmell,bettermellowtaste,teaastringentandoverallquality.AlltheresultsshowedthatMalus ‘Royalty’andMalus ‘SnowDrift’hadgreatpotentialinantioxidantabilityandbeingnewhealthyleafteainfuture.

Crabapplesleaftea;antioxidantcapacity;ingredientcontent;sensoryquality

2016-05-16

劉天慶(1988-)，男，碩士研究生，主要從事園林植物分子生物學(xué)研究工作，E-mail:491539762@qq.com。

*通訊作者:李厚華(1973-)，男，博士，教授，主要從事植物基因工程和類黃酮次生代謝研究，E-mail:lihouhua73@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(3050215130)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基礎(chǔ)科研業(yè)務(wù)費(fèi)(Z109021563)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)21-0060-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.003