不同pH對(duì)嗜酸乳桿菌分選酶相關(guān)基因表達(dá)及菌體黏附能力的影響

王 剛,吳 振,彭劉楊,潘道東,2,*,王文文,曾小群

(1.寧波大學(xué)浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波 315211;2.南京師范大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系,江蘇南京 210097)

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不同pH對(duì)嗜酸乳桿菌分選酶相關(guān)基因表達(dá)及菌體黏附能力的影響

王 剛1,吳 振1,彭劉楊1,潘道東1,2,*,王文文1,曾小群1

(1.寧波大學(xué)浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波 315211;2.南京師范大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系,江蘇南京 210097)

為探究嗜酸乳桿菌在小腸中黏附調(diào)控機(jī)制,嗜酸乳桿菌黏附與細(xì)胞壁分選酶及其相關(guān)蛋白的基因表達(dá)之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建體外模型研究了不同pH培養(yǎng)條件下嗜酸乳桿菌的黏附能力、測(cè)定了分選酶基因和分選酶相關(guān)蛋白基因相對(duì)表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在pH5.5～7.5培養(yǎng)條件下,隨著pH升高嗜酸乳桿菌菌體黏附性顯著增加,srt基因及其相關(guān)蛋白的基因表達(dá)量顯著上調(diào)。研究結(jié)果為pH對(duì)嗜酸乳桿菌的黏附效應(yīng)的影響機(jī)制提供了相關(guān)理論依據(jù)。

嗜酸乳桿菌,pH,黏附性,分選酶,表達(dá)差異

乳酸菌被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中,尤其是酸乳、泡菜等[1-2]。乳酸菌作為一類(lèi)重要的腸道定植型益生菌,能夠促進(jìn)、維護(hù)人體腸道健康。乳酸菌的黏附一方面可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性占位形成生物屏障,阻止病原菌與腸黏膜和上皮細(xì)胞的結(jié)合[3-5];另一方面可以提高乳酸菌在宿主體內(nèi)的駐留時(shí)間,有助于乳酸菌的益生功能發(fā)揮[6]。乳酸菌的益生性,主要通過(guò)平衡宿主腸道內(nèi)的微生物群落,提高機(jī)體利用乳糖的能力,增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腸道內(nèi)膽汁的耐受性等方面,來(lái)提升機(jī)體的免疫功能[7-9]。目前研究主要認(rèn)為菌體表面黏附蛋白對(duì)乳酸菌的黏附有重要影響。關(guān)于pH對(duì)乳酸菌黏附差異的研究目前主要集中在表面凝聚力和疏水性方面,而對(duì)黏附蛋白影響研究較少。

菌體黏附功能發(fā)揮需要黏附蛋白的參與,其中分選酶相關(guān)黏附蛋白(Sortase-dependent proteins,SDPs)主要包括黏液黏附蛋白(Mucus binding protein,mub),甘露糖特異性黏附蛋白(Mannose-specific adhesin,msa),脂蛋白信號(hào)肽酶(Lipoprotein signal peptidase,lspA)在黏附中發(fā)揮重要作用[10-11]。這類(lèi)菌體表面蛋白在菌體細(xì)胞壁上的錨定過(guò)程,需要這類(lèi)與膜結(jié)合的分選酶(Sortase,Srt)催化完成[12-14]。這類(lèi)蛋白具有保守的C端信號(hào)肽LPXTG的表面蛋白,分選酶負(fù)責(zé)酶切蘇氨酸和甘氨酸(TG)之間的肽鍵,然后將表面蛋白中暴露的蘇氨酸末端與肽聚糖肽橋結(jié)構(gòu)中的氨基酸催化形成肽鍵,從而將分選酶相關(guān)的蛋白錨定在菌體細(xì)胞壁上發(fā)揮黏附作用[15-18]。研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌中與Srt酶相關(guān)的含有LPXTG肽段的蛋白在其定植到腸道中起到重要作用[6];植物乳桿菌中的mub蛋白可以幫助其駐留腸道及在宿主腸道與致病菌形成競(jìng)爭(zhēng)性占位[19]。還有研究將分選酶srt基因敲除后,缺失的分選酶基因的乳酸桿菌、金黃色葡萄球菌等用于動(dòng)物模型毒力檢測(cè)時(shí),出現(xiàn)了毒力減弱的現(xiàn)象[20-21]。

圖1 分選酶催化G+菌表面蛋白錨定的過(guò)程[15]Fig.1 The process of Sortase catalyzed surface protein anchoring in Gram-positive bacteria[15]

目前研究證明嗜酸乳桿菌可以通過(guò)胃部酸性環(huán)境進(jìn)入小腸[22],食物和嗜酸乳桿菌進(jìn)入小腸后長(zhǎng)時(shí)間小腸環(huán)境對(duì)嗜酸乳桿菌的黏附性影響還不清楚。小腸道環(huán)境呈弱堿性(pH7.4～7.6),當(dāng)機(jī)體腸道出現(xiàn)炎癥及潰瘍等疾病時(shí)pH會(huì)降低,腸道功能發(fā)生紊亂[23]。為此探究小腸酸堿度對(duì)嗜酸乳桿菌黏附調(diào)控的關(guān)系,實(shí)驗(yàn)用磷酸鹽緩沖液配制不同pH的培養(yǎng)基以維持菌體營(yíng)養(yǎng)供給和實(shí)驗(yàn)所需酸堿環(huán)境,建立體外模型評(píng)價(jià)不同pH條件下的菌體黏附能力,測(cè)定srt基因及Srt相關(guān)蛋白基因表達(dá)情況。探究不同pH環(huán)境下的菌體黏附能力、黏附能力與分選酶相關(guān)蛋白基因表達(dá)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LactobacillusacidophilusATCC4356、HT-29細(xì)胞 均為本實(shí)驗(yàn)室保存;srt基因、mub基因、msa基因、lspA基因及gapdh基因引物 英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司;黏液蛋白Ⅱ型 美國(guó)SIGMA公司;細(xì)菌總RNA提取試劑盒 美國(guó)OMEGA公司;DNA Mark、Trans DNA Mark II、細(xì)菌基因組DNA試劑盒、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、qRT-PCR試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司;南美胎牛血清 上海依科賽生物制品有限公司。

Multigene Thermal Cycler型PCR儀 Labnet公司;Centerifuge 5415R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Eppendorf公司;Universal HoodⅡ型凝膠成像分析系統(tǒng) Bio-Rad公司;M200 PRO型TECAN酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司;Mini Drop ExCell Bio公司;IX53型熒光倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司;LightCycler? 96型熒光定量PCR 瑞士Roche公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同pH條件下嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)曲線和pH曲線測(cè)定 將嗜酸乳桿菌菌種活化后,以2%的接種量接種到使用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制的pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的200 mL MRS培養(yǎng)基中。37 ℃連續(xù)靜置培養(yǎng),每隔3 h使用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)各實(shí)驗(yàn)組菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)并測(cè)定培養(yǎng)基的pH,記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后繪制各實(shí)驗(yàn)組的嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)曲線和pH變化曲線。

1.2.2 蛋白黏附性實(shí)驗(yàn) 用PBS(50 mmol/L,pH7.2)將豬II型黏蛋白稀釋至濃度為2 mg/mL。100 μL/孔的蛋白液量加入Costar 96孔透明板中,37 ℃孵育1 h后,用PBS洗三次以除去未與板孔結(jié)合的蛋白。移除孔中上層液后,將96孔板在55 ℃烘箱中烘干20 min。在各pH條件下培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)10 h,離心PBS洗滌三次,調(diào)整菌液密度至1.0(OD600)。100 μL/孔加入菌懸液,恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃孵育3 h,使得菌體沉降至黏蛋白表面,板孔中未黏附的菌體用50 mmol/L PBS(0.05% Tween 20,pH7.2)洗滌3次。用1 mg/mL的結(jié)晶紫溶液對(duì)黏附菌體染色100 μL/孔,室溫下孵育45 min,過(guò)量的結(jié)晶紫用PBS洗滌三次,100 μL/孔,后在板孔中加入100 μL/孔的PBS于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃搖動(dòng)孵育1 h,酶標(biāo)儀中595 nm處測(cè)定所得溶液的吸光值,吸光值與黏附細(xì)菌數(shù)量成正比,統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[24]。

1.2.3 細(xì)胞黏附性實(shí)驗(yàn) HT-29細(xì)胞培養(yǎng)皿加入含有雙抗(青霉素和鏈霉素1×)的細(xì)胞全培,置于5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃常規(guī)貼壁培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿底面積的80%后傳代培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均用指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

各實(shí)驗(yàn)組嗜酸乳桿菌培養(yǎng)10 h,離心(5000 r/min,15 min)PBS洗滌菌體兩次,并將菌液密度調(diào)至1.0(OD600)。取10 mL菌液,離心(5000 r/min,15 min)加入10 mL無(wú)雙抗細(xì)胞培養(yǎng)基,震蕩混勻后于細(xì)胞六孔培養(yǎng)皿中每孔加入1 mL菌液,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃混合培養(yǎng)2 h,移除上層菌液后PBS清洗三次。置于顯微鏡下觀察各組嗜酸乳桿菌的黏附情況,統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組平均每?jī)蓚€(gè)細(xì)胞所黏附的菌數(shù)[25]。

1.2.4 嗜酸乳桿菌在不同pH條件下srt基因及分選酶相關(guān)蛋白基因表達(dá)差異 NCBI中獲得目的基因和內(nèi)參基因的基因序列,使用primer 5.0軟件進(jìn)行相應(yīng)分選酶及分選酶相關(guān)蛋白基因和內(nèi)參基因gapdh基因的引物設(shè)計(jì),引物設(shè)計(jì)結(jié)果如表1所示:

嗜酸乳桿菌總RNA的提取及cDNA合成,使用OMEGA公司提供的細(xì)菌總RNA提取試劑盒(Bacterial RNA kit),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)10 h的菌體總RNA。

表1 qRT-PCR基因引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design for qRT-PCR

然后根據(jù)核酸電泳RNA純度鑒定結(jié)果及各組測(cè)得總RNA濃度,按照Transgen cDNA合成試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA。實(shí)驗(yàn)采用20 μL反應(yīng)體系,體系各組份組成如下:Total RNA 1000 ng;5×TransScript? All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL;gDNA Remover 1 μL;RNase-free Water To 20 μL。將各組樣品輕輕混勻,點(diǎn)甩離心后放入普通PCR儀中,實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置:42 ℃孵育15 min,85 ℃加熱5 s失活TransScript? RT/RI和gDNA Remover,冷卻階段4 ℃恒溫放置。cDNA樣品,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)用qRT-PCR LightCycler? 96儀器,采用20 μL反應(yīng)體系,體系各組份組成如下:Template(cDNA)1 μL;Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μL;Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL;2×TransStart? Top/Tip Green qPCR SuperMix 10 μL;ddH2O 8.2 μL;Toal volume 20 μL;實(shí)驗(yàn)用Roche專(zhuān)用96孔板加樣后封膜,點(diǎn)甩后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置:94 ℃預(yù)變性30 s,循環(huán)一次;94 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,循環(huán)45次;在60 ℃退火30 s時(shí)采集熒光值。之后增加熔解曲線分析步驟:95 ℃變性10 s,65 ℃退火60 s,97 ℃變性1 s,循環(huán)一次;在97 ℃變性1 s時(shí)連續(xù)采集熒光值。冷卻階段:37 ℃孵育600 s,不進(jìn)行熒光信號(hào)采集。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SAS V8版本統(tǒng)計(jì)軟件分析,方差分析采用Duncan's Multiple Range Test分析比較,用origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH條件下嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)曲線和培養(yǎng)基pH變化曲線測(cè)定結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)曲線及對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基pH變化曲線測(cè)定分析結(jié)果如圖2所示:

圖2 嗜酸乳桿菌不同條件下的生長(zhǎng)曲線及pH變化曲線Fig.2 The growth and pH variation curves for Lactobacillus acidophilus in different MRS medium

由圖2可知,pH過(guò)低和過(guò)高培養(yǎng)條件下嗜酸乳桿菌調(diào)整期較長(zhǎng),靜置培養(yǎng)5 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)菌大量增殖,25～30 h各組活菌數(shù)達(dá)到最大,最大菌數(shù)有差異。連續(xù)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)10 h各組菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌液pH與初始pH偏差均小于0.25,pH處于穩(wěn)定可控范圍。

培養(yǎng)基pH在10 h內(nèi)穩(wěn)定可控主要由于緩沖溶液能中和菌體代謝產(chǎn)生的H+,后期嗜酸乳桿菌大量繁殖,產(chǎn)生大量乳酸、乙酸超出了緩沖溶液緩沖能力,導(dǎo)致培養(yǎng)基環(huán)境pH急劇下降。嗜酸乳桿菌能夠在低pH條件下生長(zhǎng)繁殖,主要原因是低pH下細(xì)胞膜對(duì)H+轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高和產(chǎn)堿酶活力提高,降低了環(huán)境對(duì)菌體產(chǎn)生危害[22]。

2.2 黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 蛋白黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果 體外模型下的蛋白黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示:

圖3 黏蛋白對(duì)各處理組嗜酸乳桿菌的黏附情況Fig.3 Adhesion conditions of Lactobacillus acidophilus under differnt treatment groups on the mucin注：標(biāo)注不同字母表示差異極顯著(p<0.01), 標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(p>0.05),圖5同。

表2 各實(shí)驗(yàn)組嗜酸乳桿菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附情況Table 2 Adhesion conditions to HT-29 cell of different groups

注:黏附細(xì)胞數(shù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;a、b、c表示差異性顯著(p<0.01)。由圖3可知pH5.5～6.5各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間黏附于黏蛋白的菌體數(shù)量無(wú)顯著差異(p>0.05),由于嗜酸乳桿菌具有較強(qiáng)耐酸性,而在弱酸性低梯度范圍內(nèi)培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)影響較小,所以差異并不顯著。在pH7.0～7.5培養(yǎng)條件下,菌體黏附于黏蛋白的數(shù)量相對(duì)于其他組顯著增加(p<0.01),菌體對(duì)黏蛋白黏附隨著pH的增加逐漸增強(qiáng)。

2.2.2 細(xì)胞黏附性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)組嗜酸乳桿菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附情況,統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示:

圖4 各基因的熔解曲線Fig.4 The dissociation curve of each gene注:a、b、c、d、e分別是srt、mub、msa、lsp、gapdh基因的熔解曲線。

由表2可知各組對(duì)比結(jié)果表明pH7.5時(shí)菌體的黏附數(shù)量最多,pH6.5～7.5與其他各實(shí)驗(yàn)組相比細(xì)菌黏附數(shù)量顯著增加(p<0.01),嗜酸乳桿菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附性增強(qiáng)。

菌體黏附到黏蛋白是與宿主細(xì)胞相互作用引起特定反應(yīng)的第一步[26]。蛋白黏附實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定在pH4.5～7.5黏附能力增強(qiáng),菌體更多的黏附于腸道蛋白上則有利于菌體進(jìn)一步于小腸道細(xì)胞相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王彥,孟祥晨等人研究pH對(duì)雙歧桿菌的黏附能力研究結(jié)果具有一致性,但引起黏附能力改變的因素除表面凝聚力和疏水性方面外還有待進(jìn)一步的證實(shí)[27]。由于菌體在腸道黏附定植需要菌體表面黏附蛋白的參與,據(jù)此探究了菌體表面相關(guān)黏附蛋白基因表達(dá)量的變化。

2.3srt基因與相關(guān)蛋白基因相對(duì)表達(dá)差異結(jié)果

LightCycler 96分析軟件,編輯樣品孔后導(dǎo)出各基因熔解曲線(如圖4所示)及擴(kuò)增的Cq值。采用2-ΔΔCt法,以gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因,計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于pH5.5組的各基因相對(duì)表達(dá)量,分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果如圖5所示:

圖5 不同pH培養(yǎng)條件下各基因相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The relativity quality of each gene in different pH

由圖5可以看出:在從pH5.5～7.5變化過(guò)程中,srt基因、mub基因、msa基因及l(fā)spA基因相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)。在pH7.5時(shí)相對(duì)于pH4.5條件下srt基因、mub基因、msa基因、lspA基因表達(dá)量分別顯著上調(diào)了17.1倍、5.9倍、2.6倍、2.5倍(p<0.01)。

Emma K. Call等人研究將乳酸桿菌中分選酶基因敲除后菌體黏附性降低[20]。由于分選酶負(fù)責(zé)分選酶相關(guān)蛋白的加工錨定,因此分選酶基因表達(dá)量及分選酶相關(guān)蛋白基因表達(dá)量的變化可影響菌體黏附性。嗜酸乳桿菌細(xì)胞壁分選酶及相關(guān)黏附蛋白基因表達(dá)量增加,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與菌體黏附性變化趨勢(shì)一致。

3 結(jié)論

嗜酸乳桿菌的黏附性研究對(duì)了解乳酸菌益生作用機(jī)制具有重要意義。嗜酸乳桿菌在pH5.5～7.5的培養(yǎng)條件下,菌體對(duì)黏蛋白和HT-29細(xì)胞的黏附性增強(qiáng)。原因可能是分選酶基因表達(dá)上調(diào)后,分選酶合成量增加,能夠催化錨定較多SDPs蛋白到嗜酸乳桿菌細(xì)胞壁表面。由于嗜酸乳桿菌在機(jī)體腸道內(nèi)黏附功能的發(fā)揮需要SDPs的參與,所以在正常小腸弱堿性環(huán)境中菌體更易黏附定植于人體小腸上皮細(xì)胞表面,延長(zhǎng)嗜酸乳桿菌在小腸內(nèi)的駐留時(shí)間,促進(jìn)益生功能發(fā)揮。實(shí)驗(yàn)為pH對(duì)分選酶及分選酶相關(guān)基因表達(dá)和嗜酸乳桿菌黏附性影響提供相關(guān)理論依據(jù),對(duì)于pH對(duì)嗜酸乳桿菌黏附效應(yīng)影響除分選酶相關(guān)黏附蛋白因素外,還可以通過(guò)基因組學(xué)及蛋白組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探究pH對(duì)菌體黏附差異影響的機(jī)制。

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Influence of pH on expression of sortase related genes and adhesion ability ofLactobacillusacidophilus

WANG Gang1,WU Zhen1,PENG Liu-yang1,PAN Dao-dong1,2,*,WANG Wen-wen1,ZENG Xiao-qun1

(1.Key Laboratory of Animal Protein Food Deep Processing Technology of Zhejiang Province,Ningbo University,Ningbo 315211,China;2.Food Science & Nutrition Department of Nanjing Normal University,Nanjing 210097,China)

TostudytheadhesionmechanismofLactobacillus acidophilusinthegutandtherelationshipofbetweenadhesionmechanismwithsortaseandsortasedependentproteinsgenes. In vitro,theadherencewasevaluated.Meanwhile,thesrtgeneandrelatedgenesexpressionweredeterminateunderdifferentpH.TheresultsshowedthatthegeneexpressionlevelsofsrtandrelatedproteinsincreasedsignificantlywiththerangeofpHfrom5.5to7.5.Also,theadhesivenessofLactobacillus acidophiluswasalsoenhanced.ItrevealedsomemechanismsofadhesionabilityinLactobacillus acidophilusupondifferentpHvalues.

Lactobacillus acidophilus;pH;adhesion;enzymeactivity;differentialexpression

2016-06-06

王剛(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：乳品微生物，E-mail:mcgangwang@163.com。

*通訊作者:潘道東(1964-)，男，博士，教授，研究方向：乳品科學(xué)，E-mail:daodongpan@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31471598；41276121)；浙江省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(LQ16C200002)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20141447)；國(guó)家科技部/星火計(jì)劃(2015GA701043)；浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金 (ZX2015000928)；學(xué)校人才工程項(xiàng)目(理)/人才引進(jìn)(ZX2015000594)。

TS252.1

A

1002-0306(2016)21-0166-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.024