經(jīng)典名方澤瀉湯基準(zhǔn)樣品HPLC特征指紋圖譜分析研究*

姜恒麗，鐘鑫，王雙雙，馬向慧，劉燁，康亞娟，黃馥，張永和，曹麗娟

（1.盛實(shí)百草藥業(yè)有限公司，天津市中藥飲片炮制技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300301；2.天津津村制藥有限公司，天津 300301）

2008年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布“關(guān)于印發(fā)中藥注冊(cè)管理補(bǔ)充規(guī)定的通知”，明確了“經(jīng)典名方”的概念，是指目前仍廣泛應(yīng)用、療效確切、具有明顯特色與優(yōu)勢(shì)的清代及清代以前醫(yī)籍所記載的方劑[1]。2018年國(guó)家中醫(yī)藥管理局官網(wǎng)公布包含澤瀉湯在內(nèi)的第一批100首古代經(jīng)典名方目錄[2]。澤瀉湯始載于漢代張仲景的《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治第十二》，原文載“心下有支引，其人苦冒眩，澤瀉湯主之”[3]，處方由澤瀉、白術(shù)組成，方中澤瀉氣平，味甘、淡，利水滲濕，化濁降脂，引水濕從小便排出而治其標(biāo)，為君藥，白術(shù)苦、甘，健脾益氣、利水消腫，助脾運(yùn)化水濕，則痰飲不得生，而治其本，為臣藥，兩者相須為用，祛濕又健脾，具有利水除飲、健脾制水的功效[4]，后代因襲不衰。據(jù)文獻(xiàn)研究報(bào)道，從澤瀉中分離出的化合物達(dá)200多個(gè)，三萜和倍半萜類化合物是澤瀉的主要化學(xué)成分，其他還包括二萜類、含氮化合物、黃酮、糖類、脂肪烴及其衍生物、苯丙素等化合物。原萜烷型四環(huán)三萜類是澤瀉中研究最多的特征性成分，根據(jù)生物途徑，澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇C等單體及其衍生物等均可通過(guò)23-乙酰澤瀉醇B衍生獲得[4-6]。相關(guān)藥理研究顯示，澤瀉醇類成分如澤瀉醇A、澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B等是澤瀉發(fā)揮降血壓、降血脂、利尿及抗炎等作用的主要成分[7]。白術(shù)的化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油、多糖、內(nèi)酯類、多種氨基酸和維生素等，其中重要的活性成分為白術(shù)內(nèi)酯類，主要有白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和雙白術(shù)內(nèi)酯等?，F(xiàn)代研究顯示，白術(shù)中的多種活性成分具有抗腫瘤、抗炎、改善胃腸功能、調(diào)節(jié)免疫等眾多藥理作用[8]。澤瀉湯組方雖簡(jiǎn)，但臨床療效頗佳，中醫(yī)臨床主要用來(lái)醫(yī)治水停心下，清陽(yáng)不升，濁陰上犯，頭目昏眩證，現(xiàn)代臨床多用于治療高血壓、高血脂癥、梅尼埃病、內(nèi)耳性眩暈病等，經(jīng)多年臨床實(shí)踐具有較好的臨床效果[9-10]。

經(jīng)典名方主要為復(fù)方制劑，由多種化學(xué)成分復(fù)雜的中藥組成，在疾病治療方面不同于以單一化合物為主的化學(xué)制劑，通過(guò)“多靶點(diǎn)、多成分”進(jìn)行協(xié)同作用。有研究表明，澤瀉湯包含多種藥效成分，僅用單一的化學(xué)成分對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制研究，不能準(zhǔn)確地反映其有效性和安全性[11-12]。隨著中藥質(zhì)控體系的不斷完善，可以利用HPLC特征指紋圖譜，該方法技術(shù)十分成熟、穩(wěn)定、科學(xué)和可靠，是一種可以表征中藥產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量整體變化的評(píng)價(jià)手段，對(duì)全面控制中藥產(chǎn)品質(zhì)量具有十分關(guān)鍵的意義，現(xiàn)在經(jīng)常被用于中藥材、中藥飲片及中藥制劑的質(zhì)量分析[13-15]。經(jīng)典名方基準(zhǔn)樣品研發(fā)是制劑研發(fā)的關(guān)鍵組成部分，為研發(fā)制劑提供了基準(zhǔn)參照，保證古今工藝制劑的質(zhì)量一致性[16-18]。本研究采用高效液相色譜法建立18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品的特征指紋圖譜，以期為澤瀉湯基準(zhǔn)樣品及復(fù)方制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 Series高效液相色譜儀、Agilent ZORBAX SB-Aq（250 mm×4.6 mm）色譜柱（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；LQ-C30002電子天平（上?，幮码娮涌萍加邢薰荆?；SKG便攜式電陶爐（廣東艾詩(shī)凱奇智能有限公司）；全自動(dòng)陶瓷壺（2 L，夏新科技有限責(zé)任公司）；FDU1110型冷凍干燥機(jī)、PFR-100預(yù)備凍結(jié)槽（東京理化器械株式會(huì)社）；1-14離心機(jī)（Sigma儀器有限公司）；VORTEX 3000渦旋混合器（WIGGENS有限責(zé)任公司）；XP205電子天平、PL403電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；AS30600BDT超聲波清洗器（AUTO SCIENCE有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑與試藥 試劑：乙腈（色譜純，德國(guó)默克股份有限公司）；超純水（制水機(jī)型號(hào)為Milli-Q Reference）。對(duì)照品：白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)：111975-201501，純度為99.9%），23-乙酰澤瀉醇B（批號(hào)：111846-201705，純度為99.7%）均購(gòu)買于中國(guó)食品藥品檢定研究院；澤瀉醇A（批號(hào)：B21638，純度≥98%），澤瀉醇 B（批號(hào)：B21640，純度≥98%）均購(gòu)買于上海源葉生物科技有限責(zé)任公司。樣品：18批次澤瀉藥材分別購(gòu)于四川眉山、四川五通橋、湖北宜昌、湖北枝江4個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)盛實(shí)百草藥業(yè)有限公司曹麗娟研究員鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alisma plantago-aquatica Linn.的干燥塊莖。18批次白術(shù)藥材分別購(gòu)于浙江磐安、安徽亳州、安徽譙城3個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)盛實(shí)百草藥業(yè)有限公司曹麗娟研究員鑒定為菊科植物白術(shù)Astractylodes macrorephala Koide.的干燥根莖。澤瀉、白術(shù)對(duì)應(yīng)飲片均按照2020年版《中國(guó)藥典》（一部）各藥材項(xiàng)下飲片的炮制要求加工。經(jīng)檢驗(yàn)均合格。18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品原料澤瀉和白術(shù)的批號(hào)和產(chǎn)地明細(xì)如表1所示。

表1 18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品原料的批號(hào)和產(chǎn)地明細(xì)Tab.1 Origin details of the raw materials of 18 batches of Zexie Decoction benchmark samples

2 方法與結(jié)果

2.1 澤瀉湯基準(zhǔn)樣品的制備 稱取澤瀉15 g，白術(shù)6 g，加水 400 mL，加蓋，浸泡 30 min，以武火煮沸后，調(diào)節(jié)火力，保持微沸煎煮45 min，趁熱用150目濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液冷凍干燥，即得。

2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）和超純水（B）；梯度洗脫程序：0～5 min，35%～35%B；5～15 min，35%～55%B；15～30 min，55%～65%B；30～40 min，65%～75%B；40～47 min，75%～85%B。流速：1.0 mL/min；波長(zhǎng)：208 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃。理論塔板數(shù)按23-乙酰澤瀉醇B峰計(jì)算不低于10 000。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取澤瀉醇A、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品適量，加甲醇配制成每1mL含澤瀉醇A、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇 B分別為20、30、100和500 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 稱取約1 g的澤瀉湯基準(zhǔn)樣品粉末，進(jìn)行精密稱定，加10 mL水，稱得質(zhì)量，超聲30 min，冷卻至室溫，稱質(zhì)量，用溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，精密吸取5 mL，置于10 mL的容量瓶?jī)?nèi)，加乙腈定容至刻度，搖勻，離心（12 000 rpm，5 min，離心半徑 20 cm），取上清液，用 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3.3 單味藥材及飲片煎煮液的制備 按組方用量分別稱取澤瀉和白術(shù)藥材和飲片，按澤瀉湯基準(zhǔn)樣品制法制備凍干粉末，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，所得供試品溶液即為單味藥材和飲片溶液。

2.3.4 單味飲片陰性供試品溶液的制備 按處方量稱取缺澤瀉、缺白術(shù)陰性處方，并按“2.1”項(xiàng)下澤瀉湯基準(zhǔn)樣品制法制得相應(yīng)的陰性凍干粉末，再按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，所得相應(yīng)的單味飲片陰性供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察 取同一份澤瀉湯（S1號(hào)）供試品試液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄圖譜數(shù)據(jù)。選取23-乙酰澤瀉醇B（9號(hào)峰）作為參照，計(jì)算11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.08%，相對(duì)峰面積的RSD值為1.08%，結(jié)果顯示儀器精密度符合要求。

2.4.2 穩(wěn)定性考察 取同一份澤瀉湯（S1號(hào)）供試品試液，分別在 0、2、4、6、8、12、24、32 h，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣1次檢測(cè)，記錄特征指紋圖譜數(shù)據(jù)。選取23-乙酰澤瀉醇B（9號(hào)峰）作為參照，計(jì)算11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.09%，相對(duì)峰面積的RSD值為1.77%，結(jié)果顯示該樣品在32 h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

2.4.3 重復(fù)性考察 稱取6份澤瀉湯基準(zhǔn)樣品（S1號(hào)），制備供試品試液，分別按照”2.2”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣1次檢測(cè)，記錄特征指紋圖譜數(shù)據(jù)。選取23-乙酰澤瀉醇B（9號(hào)峰）作為參照，計(jì)算11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.03%，相對(duì)峰面積的RSD值為1.59%，結(jié)果顯示該方法重復(fù)性符合要求。

2.5 澤瀉湯基準(zhǔn)樣品特征指紋圖譜測(cè)定

2.5.1 特征指紋圖譜建立 取按“2.1”項(xiàng)下澤瀉湯基準(zhǔn)樣品制備方法所得的18批樣品，配置供試品試液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄圖譜數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012版），對(duì)18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，圖譜見(jiàn)圖1。從圖譜中可見(jiàn)其中11個(gè)峰為18批基準(zhǔn)樣品所共有，因此確定這11個(gè)色譜峰為各基準(zhǔn)樣品的共有峰，以平均值法確定共有模式，結(jié)果如圖2所示。

圖1 18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品特征指紋圖譜Fig.1 Characteristic fingerprint of 18 batches of Zexie Decoction benchmark samples

圖2 澤瀉湯基準(zhǔn)樣品特征圖譜（共有模式圖譜）Fig.2 HPLC characteristic of benchmark samples of Zexie Decoction(mutual mode)

2.5.2 色譜峰歸屬和確認(rèn) 取“2.3”項(xiàng)下澤瀉湯基準(zhǔn)樣品供試品試液、澤瀉和白術(shù)單味藥材及飲片溶液、單味飲片陰性溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜方法檢測(cè)，獲得各HPLC圖譜，結(jié)果如圖3和圖4所示。通過(guò)對(duì)比相對(duì)保留時(shí)間，對(duì)澤瀉湯基準(zhǔn)樣品進(jìn)行色譜峰追溯，確定了峰 1、峰 4、峰 7、峰 8、峰9、峰10 和峰11來(lái)自澤瀉，峰5和峰6來(lái)自白術(shù)，峰2和峰3為澤瀉和白術(shù)共有。

圖3 澤瀉色譜峰歸屬比較圖譜Fig.3 Chromatographic peak attribution comparison of alismatis rhizoma

圖4 白術(shù)色譜峰歸屬比較圖譜Fig.4 Chromatographic peak attribution comparison of atractylodis macrocephalae rhizoma

2.5.3 特征峰指認(rèn)和參照峰選擇 通過(guò)與混合對(duì)照品比較進(jìn)行特征峰指認(rèn)，分別精密吸取配置的混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜方法檢測(cè)，記錄圖譜數(shù)據(jù)。見(jiàn)圖5。

圖5 混合對(duì)照品（A）和基準(zhǔn)樣品（B）對(duì)比圖譜Fig.5 Chromatographic peak comparison of mixed reference substance(A)and substance benchmarks sample(B)

由圖5可見(jiàn)，確定4號(hào)峰為澤瀉醇A，6號(hào)峰為白術(shù)內(nèi)酯I，8號(hào)峰為澤瀉醇B，9號(hào)峰為23-乙酰澤瀉醇B。其中9號(hào)峰的23-乙酰澤瀉醇B是君藥澤瀉的重要活性成分，根據(jù)供試品溶液的特征圖譜可知，23-乙酰澤瀉醇B為已知化學(xué)成分，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，并且其在各色譜峰中，具有較好的分離度且較大的峰面積，因此選取9號(hào)峰（23-乙酰澤瀉醇B）作為基準(zhǔn)樣品特征圖譜的參照峰。

2.5.4 相似度評(píng)價(jià)和共有峰計(jì)算 對(duì)“2.5.1”項(xiàng)下制得的18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品的特征指紋圖譜數(shù)據(jù)，導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012版）進(jìn)行分析，將對(duì)照特征指紋圖譜上標(biāo)示的色譜峰作為匹配點(diǎn)，進(jìn)行校正，并計(jì)算18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜相似度及共有峰的峰面積，選取23-乙酰澤瀉醇B峰（9號(hào)峰）的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算11個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積，結(jié)果如表2、表3、表4所示。

表2 18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜相似度Tab.2 Fingerprint similarity of 18 batches of Zexie Decoction benchmark samples

表3 18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品共有峰的峰面積Tab.3 Peak area of common chromatographic peaks of 18 batches of Zexie Decoction benchmark samples

表4 澤瀉湯基準(zhǔn)樣品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積Tab.4 Relative retention time and relative peak area of common chromatographic peaks of Zexie Decoction benchmark samples

根據(jù)表2相似度結(jié)果可知，18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜相似度在0.912～0.997，選取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)應(yīng)峰（峰9）為S峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，各相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在要求值的±5%。具體要求值為：0.242（峰1）、0.473（峰2）、0.602（峰3）、0.620（峰4）、0.669（峰5）、0.693（峰6）、0.709（峰7）、0.817（峰8）、1.000（峰9）、1.092（峰10）、1.325（峰11）。

3 討論

3.1 劑量考證 澤瀉湯原方記載“澤瀉五兩，白術(shù)二兩。以水二升，煮取一升，分溫再服”。《中國(guó)科學(xué)技術(shù)史·度量衡卷》記載，并通過(guò)實(shí)測(cè)漢代出土器具，得到西漢1斤厘定為250 g，新莽權(quán)1斤厘定為245 g，東漢 1 斤厘定為 222 g，故東漢：1 兩=13.8 g[19]。但明代李時(shí)珍在《本草綱目》中就提出：“今古異制，古之一兩，今用一錢可也。”清代汪昂《湯頭歌訣》也遵李時(shí)珍之說(shuō)，認(rèn)為“大約古用一兩，今用一錢足矣?！庇捎诶顣r(shí)珍在中國(guó)醫(yī)藥界地位崇高，對(duì)古方劑量的主張對(duì)后世影響甚大，“古一兩折今一錢”成了通例，為多數(shù)醫(yī)家所沿用?，F(xiàn)代醫(yī)家李培生編著的《傷寒論講義》，其在書中的古今劑量折算表中也提到東漢時(shí)代的1兩折合為3 g。眾多學(xué)者對(duì)張仲景用藥的古今劑量折算關(guān)系進(jìn)行了大量考證和核實(shí)[20-23]，通過(guò)對(duì)古籍文獻(xiàn)和歷代度量衡演變考證，綜合分析后，本研究按照漢代1兩=3 g對(duì)處方劑量進(jìn)行折算。

3.2 基準(zhǔn)樣品制備工藝

3.2.1 浸泡工藝 古籍中對(duì)是否浸泡及時(shí)間并未明確說(shuō)明，以澤瀉湯出膏率為考察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)浸泡30 min后澤瀉湯樣品出膏率為26.73%，高于未浸泡樣品的出膏率23.96%。此外，浸泡30 min時(shí)藥材飲片吸水達(dá)到飽和，且吸水量與煎煮后的藥渣吸水量接近，所以確定浸泡時(shí)間為30 min。

3.2.2 煎煮工藝 關(guān)于加熱設(shè)備，對(duì)比了全自動(dòng)陶瓷壺加熱盤和可調(diào)功率電陶爐，后者煎煮時(shí)間適中，制備的澤瀉湯的出膏率為18.93%，高于前者16.42%，且電陶爐受熱均勻，控溫準(zhǔn)確，火候易掌控，所以確定可調(diào)功率電陶爐為制備物質(zhì)基準(zhǔn)的加熱設(shè)備。目前市面上的煎煮容器多數(shù)為陶瓷材質(zhì)的煎藥壺，選擇2 L陶瓷壺作為澤瀉湯物質(zhì)基準(zhǔn)的制備容器，壺身壁的平均厚度為5 mm，其加水量為400 mL，液面高度為2.2 cm，符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中規(guī)定的2～5 cm液面高度。

現(xiàn)代由于加熱方式的改變，根據(jù)加水量和煎煮時(shí)間的長(zhǎng)短，通過(guò)調(diào)節(jié)加熱功率以達(dá)到同古代文武火基本一致的煎藥效果。以出膏率為指標(biāo)，對(duì)澤瀉湯進(jìn)行不同功率的煎煮考察發(fā)現(xiàn)，400 W煎煮的出膏率最高為26.21%，且煎煮時(shí)間適中，所以選擇400 W作為澤瀉湯物質(zhì)基準(zhǔn)的制備功率。此外，不加蓋煎煮時(shí)水量蒸發(fā)快，煎煮時(shí)間短，但對(duì)應(yīng)出膏率較低，故確定煎煮時(shí)進(jìn)行加蓋煎煮。

3.2.3 過(guò)濾工藝 通過(guò)對(duì)濾過(guò)方式、濾過(guò)材質(zhì)、濾過(guò)目數(shù)對(duì)澤瀉湯出膏率的影響進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)常壓濾過(guò)出膏率較高，同時(shí)結(jié)合儀器可操作性及設(shè)備利用度，選擇濾網(wǎng)常壓濾過(guò)作為制備澤瀉湯物質(zhì)基準(zhǔn)的濾過(guò)方式。在采用4層紗布、100目濾布和100目濾網(wǎng)濾過(guò)的結(jié)果中，100目濾網(wǎng)出膏率相對(duì)較高，所以選擇濾網(wǎng)作為制備澤瀉湯物質(zhì)基準(zhǔn)濾過(guò)材質(zhì)。同時(shí)考察100、150和200目濾網(wǎng)對(duì)出膏率的影響，150目濾網(wǎng)出膏率相對(duì)較高，所以最終選擇150目作為制備澤瀉湯物質(zhì)基準(zhǔn)的濾過(guò)目數(shù)。

3.2.4 干燥工藝 中藥提取液的成分和性質(zhì)復(fù)雜，常用的干燥方式為減壓濃縮真空干燥和冷凍干燥。傳統(tǒng)的干燥會(huì)引起材料皺縮，破壞細(xì)胞，而冷凍干燥過(guò)程中樣品的結(jié)構(gòu)不會(huì)被破壞，可以保持物料原化學(xué)組成和物理性質(zhì)，除長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定性以外，還保留了其固有的生物活性與結(jié)構(gòu)，故選擇冷凍干燥。

通過(guò)對(duì)澤瀉湯制備過(guò)程中的一系列影響因素進(jìn)行考察篩選，并制備3批澤瀉湯對(duì)該工藝進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法制備的澤瀉湯基準(zhǔn)樣品質(zhì)量穩(wěn)定，因此確定澤瀉湯基準(zhǔn)樣品的制備工藝，通過(guò)對(duì)18批澤瀉和白術(shù)飲片進(jìn)行隨機(jī)組合，制備了18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品凍干粉。

3.3 色譜條件篩選 澤瀉湯中成分主要有君藥澤瀉中的倍半萜類、三萜類，白術(shù)中的揮發(fā)油、內(nèi)酯類成分，本研究采用DAD檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，同時(shí)對(duì)200、208、220 nm波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)波長(zhǎng)在208 nm時(shí)，色譜圖中呈現(xiàn)的色譜峰數(shù)量最多，各指標(biāo)成分色譜峰的吸收強(qiáng)度很平均，且分離度較好，因此，最終選用208 nm波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

分別比較Agilent ZORBAX SB-Aq（250 mm×4.6mm，5μm），ZORBAX Eclipse Plus（250mm×4.6mm，5 μm），COSMOSIL C18-MS-II I（250 mm×4.6 mm，5 μm）3個(gè)型號(hào)的色譜柱，結(jié)果顯示，使用Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱時(shí)，各色譜峰呈現(xiàn)了較好的分離度，且特征峰很明顯，各峰形良好，因此選擇Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱作為HPLC特征指紋圖譜的色譜柱。

選用Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱，對(duì)不同柱溫條件（20、30和40℃）進(jìn)行比較和篩選，結(jié)果顯示，在柱溫30℃條件下，各色譜峰具有較好的分離度，不易受干擾因素影響。所以，最終選擇柱溫30℃作為HPLC特征指紋圖譜的最佳柱溫條件。

以乙腈-水為流動(dòng)相，考察了4個(gè)不同梯度洗脫條件下的色譜峰數(shù)目和各色譜峰分離情況，選出最佳梯度洗脫條件?？疾炝瞬煌崛∪軇?duì)澤瀉湯樣品的影響，篩選了純化水溶解、乙腈提取和50%乙腈提取法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50%乙腈提取法樣品在色譜條件下色譜峰數(shù)目較多，且各色譜峰紫外吸收和分離度良好，因此最終選擇50%乙腈提取法為最佳前處理法。

3.4 測(cè)定結(jié)果分析 本研究采用HPLC法建立了18批澤瀉湯基準(zhǔn)樣品的特征指紋圖譜，相似度在0.912～0.997，共標(biāo)定11個(gè)共有色譜峰，確定了峰1、峰4、峰7、峰8、峰9、峰10和峰11來(lái)自君藥澤瀉，峰5和峰6來(lái)自臣藥白術(shù)，峰2和峰3為澤瀉和白術(shù)共有。指認(rèn)了4個(gè)特征峰，其中4號(hào)峰為澤瀉醇A，6號(hào)峰為白術(shù)內(nèi)酯I，8號(hào)峰為澤瀉醇B，9號(hào)峰為23-乙酰澤瀉醇B。選取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)應(yīng)峰（峰9）為S峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，各相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在要求值的±5%。具體要求值為：0.242（峰 1）、0.473（峰 2）、0.602（峰 3）、0.620（峰 4）、0.669（峰 5）、0.693（峰 6）、0.709（峰 7）、0.817（峰 8）、1.000（峰 9）、1.092（峰 10）、1.325（峰 11）。

本研究通過(guò)建立澤瀉湯基準(zhǔn)樣品的HPLC特征指紋圖譜，為澤瀉湯基準(zhǔn)樣品關(guān)鍵化學(xué)屬性的質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)澤瀉湯復(fù)方制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)建立提供基準(zhǔn)參照和控制依據(jù)。