越橘EST-SSR分子標(biāo)記的開發(fā)及其遺傳多樣性分析

孫海悅，郭瑞雪，王佳卉，蓋鈺卓，劉禹姍，董 梅，李亞東

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118； 2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

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越橘EST-SSR分子標(biāo)記的開發(fā)及其遺傳多樣性分析

孫海悅1，郭瑞雪2，王佳卉2，蓋鈺卓1，劉禹姍1，董 梅1，李亞東1

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118； 2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

【目的】 探討越橘EST序列中SSR位點(diǎn)的分布規(guī)律，開發(fā)越橘EST-SSR引物，并分析其在越橘品種遺傳多樣性研究中的作用?！痉椒ā?以91份越橘種質(zhì)為材料，利用越橘果實(shí)轉(zhuǎn)錄組(RNA-Seq)的測(cè)序結(jié)果，通過SSRIT在線搜索，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)30對(duì)引物，并篩選擴(kuò)增效果理想的引物，用篩選出的引物分析91份種質(zhì)的多態(tài)性，構(gòu)建91份種質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹。【結(jié)果】 34 464條越橘unigene序列中含有SSR位點(diǎn)的序列有829條，SSR位點(diǎn)有913個(gè)，其中二核苷酸、三核苷酸重復(fù)是主要的SSR類型，分別占全部SSR位點(diǎn)的13.69%和81.27%。不同核苷酸數(shù)目重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)差異很大；越橘EST-SSR位點(diǎn)集中在11～15 bp；三核苷酸和六核苷酸重基元復(fù)種類最多，在所有重復(fù)基元中GAA/TTC發(fā)生頻率最高。設(shè)計(jì)的30對(duì)引物中有17對(duì)引物在供試越橘種質(zhì)中擴(kuò)增出理想的PCR產(chǎn)物，17對(duì)引物均有多態(tài)性。聚類分析結(jié)果顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.69時(shí)，可以將供試越橘種質(zhì)分成4組?！窘Y(jié)論】 EST-SSR標(biāo)記可以用于越橘品種的鑒定與遺傳多樣性分析。

越橘；EST；SSR；遺傳多樣性

越橘(俗稱藍(lán)莓)、蔓越橘和紅豆越橘是經(jīng)人類馴化的杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)植物，栽培最為廣泛的越橘主要分為矮叢越橘(Lowbush blueberries)、北高叢越橘(Northern highbush blueberries)、半高叢越橘(Half-highbush blueberries)、南高叢越橘(Southern highbush blueberries)和兔眼藍(lán)莓(Rabbiteye blueberries)品種群。全世界越橘屬植物有400多個(gè)種，廣泛分布于北半球冷涼地區(qū)和南美高山地區(qū)[1]，我國(guó)共有約91個(gè)種、28個(gè)變種，主要分布于東北和西南地區(qū)[2]，特別是在我國(guó)長(zhǎng)白山等地區(qū)蘊(yùn)含著豐富的野生越橘屬植物資源，這些野生資源是越橘抗性育種的必要基礎(chǔ)和重要材料。我國(guó)現(xiàn)有的越橘屬栽培品種主要引自美國(guó)、加拿大、波蘭等國(guó)，而根據(jù)我國(guó)的氣候特點(diǎn)和本土植物資源優(yōu)勢(shì)，積極培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的越橘優(yōu)良品種是今后我國(guó)越橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

近年來，分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于果樹遺傳連鎖圖構(gòu)建、種質(zhì)資源遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、純度鑒定和分類及分子標(biāo)記輔助選擇育種等研究領(lǐng)域。在眾多的分子標(biāo)記技術(shù)中，簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)標(biāo)記以其高度的多態(tài)性和可重復(fù)性，得到了廣泛應(yīng)用[3]。根據(jù)SSR來源不同，可分為基因組SSR(Genomic-SSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(EST-SSR)?；蚪MSSR標(biāo)記開發(fā)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且成本較高，需要投入大量的人力物力[4]；而EST-SSR標(biāo)記是從隨機(jī)選擇的cDNA克隆中獲得的cDNA序列片段，代表完整基因的一部分，通過搜索SSR開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記具有穩(wěn)定性高、通用性好、成本低、開發(fā)簡(jiǎn)單快捷等特點(diǎn)[5]。目前，EST-SSR在梨[6]、砂梨[7]、刺梨[8-9]、梅[10]、荔枝[11-12]、草莓[13]、桃[14]、獼猴桃[15]、柑橘[16]、核桃[17]、香蕉[18]等果樹上已有相關(guān)報(bào)道。隨著二代測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，越來越多的EST序列被大量而快速地獲取，為開發(fā)SSR標(biāo)記提供了大量可利用的數(shù)據(jù)資源，EST-SSR標(biāo)記目前已成為一種有效的技術(shù)被廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系、遺傳多樣性分析等研究中[19-20]。

分子標(biāo)記技術(shù)在越橘研究上也有一定的應(yīng)用，Aruna等[21]利用RAPD標(biāo)記對(duì)19個(gè)兔眼越橘品種的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析；Levi等[22]對(duì)高叢越橘品種、兔眼越橘、南方野生越橘種間的親緣關(guān)系進(jìn)行了RAPD和SSR分析；Dhanaraj等[23]篩選了26個(gè)野生矮叢越橘品種(V.angustifolium)，包括栽培品種和野生品種，結(jié)果表明，基因型的聚類分析與地理起源相關(guān)性較好。但關(guān)于越橘EST-SSR標(biāo)記的研究不多， Boches等[24]使用20個(gè)EST-SSR和8個(gè)基因組SSR引物，成功區(qū)分了60多個(gè)越橘品系的遺傳多態(tài)性，其中包括半高叢品種群、南高叢品種群、北高叢品種群和野生品系。本課題組在前期工作中，采用Illumina高效測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了越橘果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)[25]，本研究擬對(duì)這些序列中的SSR信息進(jìn)行分析，以了解越橘EST-SSR的發(fā)生頻率和特點(diǎn)，開發(fā)新的EST-SSR引物，并對(duì)越橘種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，根據(jù)越橘種質(zhì)資源的利用現(xiàn)狀和我國(guó)越橘育種的實(shí)際需要，開發(fā)建立基于EST的越橘分子標(biāo)記體系，對(duì)育種材料進(jìn)行早期鑒定，加快育種進(jìn)程，以期提高我國(guó)在越橘品種方面的自主創(chuàng)新能力。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)所用的91份越橘品種種質(zhì)資源取自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小漿果資源圃，供試品種包括矮叢越橘、北高叢越橘及其雜種后代、半高叢越橘、南高叢越橘和紅豆越橘，試材具體情況見表1。2012年5月采集新鮮幼嫩葉片，經(jīng)液氮處理后置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用改良的CTAB法[26]提取基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，用德國(guó)Implen NanoPhotometer?P-Class超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度。

表 1 供試越橘種質(zhì)資源的基本情況

注：①代表北高叢越橘，②代表南高叢越橘，③代表半高叢越橘，④代表北高叢越橘雜種后代，⑤代表矮叢越橘，⑥代表紅豆越橘。

Note：①.Northern highbush blueberries,②.Southern highbush blueberries,③.Half-highbush blueberries,④.Northern highbush blueberry hybrids,⑤.Lowbush blueberries,⑥.V.vitis-idaea,Lingonberries.

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源 越橘果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于本課題組有關(guān)半高叢越橘品種“北陸”的Illumina高通量深度測(cè)序結(jié)果[25]，分別以越橘成熟果實(shí)的果皮和果肉為樣品構(gòu)建測(cè)序cDNA文庫(kù)，共獲得34 464條unigene序列(SRA046311)。

1.2.3 SSR位點(diǎn)的鑒定 使用簡(jiǎn)單序列重復(fù)識(shí)別工具SSRIT(Simple Sequence Repeat Identification Tool，http://gramene.org/db/markers/ssrtool)篩選SSR；搜索SSR位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)是二核苷酸(Di-nucleotide,Di-)重復(fù)6次，三核苷酸(Tri-nucleotide,Tri-)重復(fù)5次，四核苷酸(Tetra-nucleotide,Tetra-)及以上重復(fù)4次。

1.2.4 EST-SSR 引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)主要參考Thiel等[27]的方法，并將篩選條件適當(dāng)改進(jìn)為：SSR位點(diǎn)距序列兩端大于50 bp，引物(G+C)含量為40%～60%，引物長(zhǎng)度為18～24 bp，復(fù)性溫度為50～60 ℃，上下游引物復(fù)性溫度相差小于5 ℃，產(chǎn)物片段大小為150～350 bp。用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。引物命名規(guī)則為RX-序號(hào)，如RX-1。

1.2.5 EST-SSR引物篩選 將設(shè)計(jì)的30對(duì)ESR-SSR 引物交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。選擇“藍(lán)豐”(北高叢越橘)、“美登”(矮叢越橘)、“北陸”(半高叢越橘)進(jìn)行引物篩選。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括：10×PCR buffer (Mg2+Plus) 2 μL,dNTPs (2.5 mmol/μL) 1.6 μL，TaKaRaTaq(5 U/μL) 0.1 μL，DNA模板(10 ng/μL) 0.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 14.3 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min；然后進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃延伸5 min。

PCR 反應(yīng)產(chǎn)物利用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(DYY-П型垂直板電泳儀和DYC-30 型電泳槽均為北京六一儀器廠生產(chǎn))，上樣完畢后在300 V電壓下電泳1 h, 電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染顯色，Alpha Imager HP 凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.2.6 多態(tài)性檢測(cè)及聚類分析 對(duì)PCR擴(kuò)增效果較好的EST-SSR引物進(jìn)行越橘種質(zhì)資源多態(tài)性分析，反應(yīng)條件及反應(yīng)程序同1.2.5節(jié)，不同引物組合的最適退火溫度有別。根據(jù)電泳結(jié)果，在相同遷移位置有擴(kuò)增條帶的記作1，無擴(kuò)增條帶的記作0，建立0，1矩陣。根據(jù)SSR位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)信息，利用NTSYSpc 2.10 e 軟件獲得樣品間的遺傳相似度，并以此進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 越橘EST中SSR的總體特點(diǎn)及出現(xiàn)頻率

對(duì)來自越橘果實(shí)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的34 464條unigene序列進(jìn)行SSR搜索，結(jié)果顯示，共檢索到913個(gè)SSR位點(diǎn)，占全部unigene序列總數(shù)的2.65%；含SSR位點(diǎn)的unigene序列共計(jì)829條，占總序列數(shù)的2.41%。在這829條序列中，發(fā)現(xiàn)包含1個(gè)SSR位點(diǎn)的unigen序列762條，包含2個(gè)SSR位點(diǎn)的有54條，包含3個(gè)SSR位點(diǎn)的有10條，包含4個(gè)SSR位點(diǎn)的序列有2條，包含5個(gè)SSR位點(diǎn)的序列有1條。

檢測(cè)出的913個(gè)SSR位點(diǎn)中，2～6核苷酸重復(fù)都有出現(xiàn)，但各核苷酸出現(xiàn)的頻率不同。三核苷酸和二核苷酸重復(fù)類型占主導(dǎo)地位，共占SSR總位點(diǎn)數(shù)的94.96%；其次是六核苷酸重復(fù)，占SSR總位點(diǎn)數(shù)的4.60%；而四核苷酸和五核苷酸重復(fù)較少，僅占0.33%和0.11%(表2)。

表 2 越橘EST中SSR的出現(xiàn)頻率

2.2 越橘的EST-SSR特性

搜索的越橘EST-SSR中，共觀察到101種重復(fù)基元，其中三核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元種類最多，分別為51和38種；其次為二、四、五核苷酸重復(fù)，分別為8，3，1種(表2)。而在5種重復(fù)類型中，雖然六核苷酸的重復(fù)基元種類多，占總重復(fù)基元類型總數(shù)的37.62%，但是出現(xiàn)頻率較低，僅占總SSR位點(diǎn)的4.60%(表2)。在二核苷酸重復(fù)基元中，以AG/CT重復(fù)基元最多，其次是GA/TC。三核苷酸重復(fù)基元類型中，以GAA/TTC、CAG/CTG、AAG/CTT所占比例較高，為三核苷酸的主要重復(fù)基元。在所有重復(fù)基元中，GAA/TTC的發(fā)生頻率最高，其次為CAG/CTG、AAG/CTT、GA/TC(表3)。

表 3 越橘EST中SSR重復(fù)基元的特點(diǎn)

表 3(續(xù)) Continued table 3

從表4可知，不同核苷酸數(shù)目重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)差異很大，二核苷酸重復(fù)基元組成的SSR共有16種重復(fù)次數(shù)類型，主要為6次重復(fù)；三核苷酸重復(fù)基元組成的SSR有7種重復(fù)次數(shù)類型，主要為5次重復(fù)；四、五核苷酸重復(fù)基元組成的SSR只有1種重復(fù)次數(shù)類型，均為4次重復(fù)；六核苷酸重復(fù)基元組成的SSR有4種重復(fù)次數(shù)類型，為4～7次重復(fù)?？梢婋S著組成SSR重復(fù)基元核苷酸數(shù)目的不斷增多，重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)減少。

從圖1可以看出，越橘EST-SSR位點(diǎn)集中在11～15 bp，其次是16～20 bp。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，越橘長(zhǎng)度分布在11～15 bp的EST-SSR位點(diǎn)約有512個(gè)，占總數(shù)的56.08%；16～20 bp的EST-SSR位點(diǎn)約有264個(gè)，占總數(shù)的28.92%； 21～25 bp的EST-SSR位點(diǎn)有78個(gè)，占總數(shù)的8.54%；26～30 bp的EST-SSR位點(diǎn)有29個(gè)，約占總數(shù)的3.18%；而長(zhǎng)度大于31 bp的EST-SSR位點(diǎn)約有30個(gè)，占總數(shù)的 3.28%。

表 4 越橘EST中不同SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)

圖 1 越橘EST序列中SSR位點(diǎn)長(zhǎng)度的分布

2.3 越橘EST-SSR引物的有效性檢測(cè)及多態(tài)性

在隨機(jī)挑選的30對(duì)符合篩選條件的EST-SSR引物中，有17對(duì)引物均擴(kuò)增出理想的PCR產(chǎn)物，有效擴(kuò)增率為56.67%，說明利用越橘EST序列開發(fā)EST-SSR標(biāo)記是可行的。選用91份越橘種質(zhì)資源對(duì)17對(duì)有效EST-SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增及多態(tài)性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，17對(duì)引物均呈現(xiàn)多態(tài)性，共得到92條條帶，其中多態(tài)性片段85個(gè)。圖2為引物RX-17的擴(kuò)增情況，不同引物的擴(kuò)增及其顯示的多態(tài)性情況見表5。

1～48.代表越橘種質(zhì)與表1相同；M.DL2000 Marker 1-48.Germplasms are same with Table 1;M is DL2000 Marker

圖 2 引物RX-17在越橘不同種質(zhì)資源間的多態(tài)性圖譜

Fig.2 Polymorphic bands in different Vaccinium accessions revealed by primer RX-17

表 5(續(xù)) Continued table 5

2.4 越橘種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

為了評(píng)價(jià)所開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記的可利用性，用具有SSR位點(diǎn)的17對(duì)引物對(duì)越橘品種進(jìn)行聚類分析。遺傳關(guān)系分析結(jié)果(圖3)表明，這些引物可以將91個(gè)越橘品種區(qū)分開來，遺傳相似系數(shù)在0.59～1.00?？傮w而言，91個(gè)越橘種質(zhì)主要被分為兩大類。在遺傳相似系數(shù)為0.69時(shí)，可以將91個(gè)越橘品種分為4組：第4組為9號(hào)“斯巴坦”；第3組為89號(hào)紅豆越橘“姍娜”；第2組為5號(hào)“艾朗”和3號(hào)“藍(lán)樂BE”；其余所有品種為第1組，這一組包含了矮叢越橘、半高叢越橘、北高叢越橘和南高叢越橘的大部分品種，表明在現(xiàn)有越橘品種培育過程中，各品種親緣關(guān)系較近，遺傳背景較狹窄。

3 討 論

本研究對(duì)來自越橘果實(shí)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中的34 464條unigene序列進(jìn)行了SSR搜索，得到了913個(gè)SSR位點(diǎn)，占全部unigene序列總數(shù)的2.65%，低于荔枝(16.53%)[12]、草莓(2.67%)[13]、梅(9.24%)[10]。這種差異的存在可能是由于物種間SSR位點(diǎn)的真實(shí)差異，也可能是由于構(gòu)建的cDNA文庫(kù)容量與得到的EST數(shù)量不同，或用來分析的EST數(shù)量和質(zhì)量不同，或是由于搜尋SSR的所用軟件標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)設(shè)置不同造成的。相信隨著EST數(shù)據(jù)庫(kù)容量的不斷增加，各個(gè)物種間SSR位點(diǎn)的比較將會(huì)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。前人研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)植物以二核苷酸和三核苷酸為主要重復(fù)類型，多數(shù)雙子葉植物和單子葉植物以三核苷酸重復(fù)基元為主[20]，如香蕉[18]、甘蔗[28]等。本研究發(fā)現(xiàn)，越橘中以三核苷酸重復(fù)基元最為常見，發(fā)生頻率平均為2.135%，這與鄢秀芹等[9]、孫清明等[12]、Kota等[29]的研究結(jié)果相一致。

利用SSRIT軟件，本研究從越橘果實(shí)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中共搜索到913個(gè)SSR位點(diǎn)，通過PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的30對(duì)引物中僅17對(duì)具有擴(kuò)增產(chǎn)物，引物有效擴(kuò)增率為56.67%；17對(duì)引物均有多態(tài)性，占可擴(kuò)增引物的100%。董清華等[13]根據(jù)草莓EST-SSR設(shè)計(jì)60對(duì)引物，其中42對(duì)引物具有擴(kuò)增產(chǎn)物，引物有效擴(kuò)增率為70%；42對(duì)引物中有36對(duì)引物具多態(tài)性，占可擴(kuò)增引物的85.7%。可見與草莓相比，越橘EST-SSR引物有效擴(kuò)增率稍低，但是引物多態(tài)性所占比例高。這可能是由于部分引物設(shè)計(jì)的EST序列對(duì)應(yīng)的基因組序列上含有內(nèi)含子，從而引起引物間序列過長(zhǎng)或引物無法與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致PCR無法正常擴(kuò)增所致，引物的設(shè)計(jì)質(zhì)量也可能是影響因素之一。供試種質(zhì)中的3、7、8號(hào)均標(biāo)記為越橘品種“藍(lán)樂”，這是由于引種批次和來源不同造成的。鑒于越橘品種“藍(lán)樂”的母本是“伯克利”[30]，根據(jù)本研究的聚類分析結(jié)果，“藍(lán)樂”應(yīng)與17號(hào)“伯克利”親緣關(guān)系最近，因此判斷7號(hào)“藍(lán)樂BY”為準(zhǔn)確品種。此外，9、10號(hào)均標(biāo)記為越橘品種“斯巴坦”，“斯巴坦”的母本是28號(hào)“早藍(lán)”[30]，而根據(jù)聚類分析結(jié)果，10號(hào)“斯巴坦-1”為準(zhǔn)確品種。這一結(jié)果說明，本研究開發(fā)的EST-SSR引物可以用于越橘品種的區(qū)分鑒別。

1～91代表種質(zhì)與表1同 1-91 are same with Table 1

圖 3 91個(gè)越橘種質(zhì)的聚類分析樹狀圖

Fig.3 Dendrogram of 91Vacciniumgermplasms based on Dice’s similarity coefficient

Boches等[24]使用北高叢越橘的EST數(shù)據(jù)作為SSR引物設(shè)計(jì)來源，而本研究以兼具高叢越橘和矮叢越橘的中間類型——半高叢越橘為EST-SSR引物設(shè)計(jì)來源，這類新開發(fā)的EST-SSR引物對(duì)越橘屬植物的遺傳分析研究具有更高的引物通用性。本研究結(jié)果也證明，新開發(fā)的EST-SSR引物不僅可以用于越橘的4大品種群，也可以用于紅豆越橘。將本研究新開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記用于91份越橘品種間遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，EST-SSR分子標(biāo)記體系的聚類結(jié)果與越橘品種的實(shí)際情況基本相符，可用于越橘屬植物品種遺傳多樣性分析。特別值得注意的是，本研究結(jié)果顯示，95.6%的越橘供試品種聚類在第1組，這與Boches等[24]的研究結(jié)論相似，證實(shí)在人類馴化過程中藍(lán)果類型的越橘屬植物，栽培品種遺傳背景過于集中，僅僅集中在狹葉越橘、絨葉越橘等8個(gè)屬，因此在今后的育種研究中，有必要引入更多的野生種質(zhì)資源，重視種、屬、組之間的雜交。

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Development of expressed sequence tag-derived simple sequence and genetic diversity analysis of blueberry

SUN Haiyue1,GUO Ruixue2,WANG Jiahui2,GAI Yuzhuo1,LIU Yushan1,DONG Mei1,LI Yadong1

(1 College of Horticulture,Jilin Agricultural University,Changchun,Jilin 130118, China;2CollegeofHorticulture,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang,Liaoning110161,China)

【Objective】 The objective of this study was to analyze the SSR distribution in blueberry transcriptome, and develop new EST-SSR markers for studying the genetic diversity ofVacciniumgermplasms. 【Method】 Using 91Vacciniumgermplasms for materials,SSR motifs were selected by SSRIT online software based on RNA-Seq results of blueberry fruits.A total of 30 primer pairs were designed by the software Primer Primer 5.0 and phylogenetic tree was constructed by optimal primers to analyze the polymorphism of 91 germplasm resources.【Result】 A total of 913 SSRs were identified from 34 464Vacciniumunigenes.The dinucleotide and trinucleotide repeats were the dominant types with the frequency of 13.69% and 81.27%,respectively.The difference among different number of repeats of different SSR types was large.The most abundant repeat length of EST-SSR motif was 11-15 bp.Tri-nucleotide and hexa-nucleotide repeats had the most abundant repeat types and GAA/TTC was the most common motif.Among the 30 EST-SSR primers,amplified distinct bands and expected products were obtained by 17 pairs primers.The 17 polymorphic EST-SSR amplicons were validated by resequencing PCR products.Cluster analysis showed that 91Vacciniumgermplasms can be distinguished into 4 groups with the genetic similarity coefficient of 0.69.【Conclusion】 The EST-SSR markers can be used in germplasm identification and genetic analysis inVaccinium.

Vaccinium;EST;SSR;genetic diversity

時(shí)間:2016-10-20 16:36

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.12.024

2015-06-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301755)；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20132223120004)；人事部留學(xué)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目； 吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150414047GH)

孫海悅(1981-)，女，遼寧沈陽人，博士，主要從事果樹遺傳育種與生物技術(shù)研究。

李亞東(1964-)，男，河北昌黎人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事果樹種質(zhì)資源與栽培生理研究。 E-mail:blueberryli@163.com

S663.9

A

1671-9387(2016)12-0172-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161020.1636.048.html