樹蘭莖段叢生芽快繁體系的建立

易雙雙，陸順教，冷青云，王 存，楊光穗

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部 華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶觀賞植物種質(zhì)創(chuàng)新利用工程技術(shù)研究中心，海南 儋州 571737)

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樹蘭莖段叢生芽快繁體系的建立

易雙雙，陸順教，冷青云，王 存，楊光穗

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部 華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶觀賞植物種質(zhì)創(chuàng)新利用工程技術(shù)研究中心，海南 儋州 571737)

【目的】 建立莖段誘導(dǎo)叢生芽途徑的樹蘭快速繁殖技術(shù)體系，為樹蘭種苗生產(chǎn)及工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。【方法】 以樹蘭當(dāng)年生分蘗苗的帶芽莖段為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，研究不同質(zhì)量濃度6-BA、NAA和IBA組合對樹蘭莖段叢生芽誘導(dǎo)、增殖及生根的影響?！窘Y(jié)果】 不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA組合對樹蘭莖段叢生芽的誘導(dǎo)與增殖均有顯著影響，樹蘭莖段叢生芽誘導(dǎo)最適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，誘導(dǎo)率最高達(dá)到73.13%；增殖最適宜培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，增殖系數(shù)最高達(dá)到5.2。不同質(zhì)量濃度NAA和IBA組合對樹蘭組培苗生根有顯著影響，生根最適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA ，生根率可達(dá)100%，平均根數(shù)7.78條/株，株高7.44 cm，莖粗2.82 mm?！窘Y(jié)論】 建立了樹蘭莖段誘導(dǎo)叢生芽的組織培養(yǎng)快繁體系，在該體系下叢生芽的誘導(dǎo)率和增殖率均較高，生根狀況良好。

樹蘭；莖段；叢生芽；誘導(dǎo)與增殖；組織培養(yǎng)

樹蘭(Epidendrum)為蘭科(Orchidaceae)樹蘭屬熱帶氣生蘭，易生長，可周年開花，花期長，花色豐富艷麗，具有很高的觀賞價(jià)值，可作為盆花、切花觀賞，也可露地種植，應(yīng)用于花壇、花鏡等園林景觀[1]。樹蘭屬因其物種豐富且具有與生態(tài)群和地理分布顯著相關(guān)的形態(tài)多樣性，目前已作為一種重要的模式植物被用來研究生境選擇、生殖生物學(xué)、授粉機(jī)制、物種形成和生殖隔離等生物進(jìn)化相關(guān)問題[2]?，F(xiàn)在我國部分地區(qū)已引進(jìn)樹蘭并進(jìn)行了初步的商業(yè)開發(fā)，但規(guī)模卻一直無法進(jìn)一步擴(kuò)大，主要源于其傳統(tǒng)的分株繁殖效率低，盡管也可通過無菌播種獲得大量種苗，但在自然條件下，蘭科植物因其花朵有效傳粉率低，導(dǎo)致自然授粉結(jié)實(shí)率低[3-5]，且種子繁育的后代會(huì)產(chǎn)生大量雜合體，無法保持親本的優(yōu)良性狀以及種苗的整齊度。而利用外植體途徑的組培快繁技術(shù)是種苗大量生產(chǎn)且保持親本優(yōu)良性狀的有效方法。目前關(guān)于樹蘭利用根、葉、花梗等為外植體分別誘導(dǎo)原球莖的組織快繁已見相關(guān)報(bào)道，但其誘導(dǎo)率較低，得到的再生植株也較少[6-10]。而以莖段直接誘導(dǎo)叢生芽的途徑不僅可以縮短繁育周期，且在一定程度上可降低種苗的變異率，但該方式在樹蘭組培快繁中目前尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以樹蘭當(dāng)年生分蘗苗的帶芽莖段為外植體，建立了樹蘭莖段誘導(dǎo)叢生芽的組織快繁技術(shù)體系，以期為樹蘭快速繁殖及工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試樹蘭采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶花卉種質(zhì)資源圃。晴天上午，選取生長健壯、無病蟲害的當(dāng)年生樹蘭分蘗苗莖段，自頂端第4 片葉往下7～9 片葉處取材。

1.2 方 法

1.2.1 外植體消毒 將莖段的外包葉輕輕剝?nèi)?，保留?jié)上的芽點(diǎn)，剪成約3 cm 左右小段，先用流水沖洗30 min，然后用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗1 次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的HgCl2浸泡10 min[11]，最后用無菌水沖洗5～6 次。

1.2.2 6-BA和NAA對叢生芽誘導(dǎo)的影響 將消毒的莖段外植體切成1 cm 左右的帶芽小段，分別接種于不同培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基分別添加不同質(zhì)量濃度的6-BA(1.0，2.0，3.0 mg/L)和NAA(0.1，0.5，1.0 mg/L)，共9個(gè)處理組合。30 d天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，研究不同激素組合對叢生芽誘導(dǎo)的影響。叢生芽誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)的叢生芽植株數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%。

1.2.3 6-BA和NAA對叢生芽增殖的影響 將分化的叢生芽切成單株，分別接種到不同培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基添加不同質(zhì)量濃度的6-BA(1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/L)和NAA(0.1，0.5，1.0 mg/L)，共15個(gè)處理組合。40 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的增殖情況，研究不同激素組合對叢生芽增殖的影響。增殖系數(shù)=誘導(dǎo)的芽數(shù)/接種芽數(shù)。

1.2.4 NAA和IBA對生根的影響 當(dāng)增殖的叢生芽有3～4片葉，且高度達(dá)到2 cm左右時(shí)，從基部切下，將生長較好、長勢一致的單株分別接種到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基添加不同質(zhì)量濃度的NAA(0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L)和IBA(0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L)，共16個(gè)處理組合。40 d后統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)、根長、根粗、株高、葉片數(shù)、莖粗。

以上培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，其中添加了30 g/L蔗糖，6.5 g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8～6.0，以上試驗(yàn)均采用雙因素完全隨機(jī)組合，每種組合接種20個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

對所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0 進(jìn)行方差分析和多重比較(Duncan’s法)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA與NAA組合對樹蘭叢生芽誘導(dǎo)的影響

將消毒好的莖段接種于不同培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 d左右，發(fā)現(xiàn)樹蘭莖段的芽點(diǎn)開始萌動(dòng)，隨后形成小突起，并不斷膨大，同時(shí)莖段逐漸枯黃萎縮，在培養(yǎng)30 d后，對叢生芽誘導(dǎo)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果(表1)表明，不同激素組合處理對樹蘭叢生芽誘導(dǎo)差異較大，其中6-BA具有極顯著影響，NAA具有顯著影響，6-BA與NAA具有極顯著交互作用。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.0和3.0 mg/L時(shí)，叢生芽的誘導(dǎo)率隨NAA質(zhì)量濃度的增加先上升后下降；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.0 mg/L時(shí)，隨著NAA質(zhì)量濃度增加，誘導(dǎo)率呈降低趨勢。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，叢生芽的誘導(dǎo)率隨6-BA質(zhì)量濃度的增加逐漸下降；當(dāng)NAA質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0 mg/L時(shí)，叢生芽的誘導(dǎo)率隨6-BA質(zhì)量濃度的增加則先下降后上升。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L、NAA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)，叢生芽的誘導(dǎo)率達(dá)到73.13%，顯著高于其他處理組合。因此，叢生芽誘導(dǎo)的最適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。

在培養(yǎng)30 d后，將膨大的帶芽部位切下，接種于MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，45 d左右分化產(chǎn)生了叢生芽(圖1-A)。

表 1 不同質(zhì)量濃度6-BA 與NAA配比對樹蘭叢生芽誘導(dǎo)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”；同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；*表示F值檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)，**表示F值檢驗(yàn)差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note:Values represent the means±SE.Means followed by different lowercase letters are significantly different atP=0.05;* indicates significant difference between 6-BA and NAA atP=0.05；** indicates significant difference between 6-BA and NAA atP=0.01.The same below.

2.2 6-BA與NAA組合對樹蘭叢生芽增殖的影響

表2顯示，分別添加6-BA、NAA對樹蘭的叢生芽增殖均有顯著和極顯著影響，且6-BA與NAA之間存在極顯著交互作用。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度分別為1.0，5.0 mg/L時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)隨著NAA質(zhì)量濃度的增加而逐漸上升；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為4.0 mg/L時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)隨著NAA質(zhì)量濃度的增加而逐漸減少；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.0，3.0 mg/L時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)隨著NAA質(zhì)量濃度的增加先下降后上升。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為3.0 mg/L、NAA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，叢生芽的平均增殖系數(shù)為5.2，顯著高于其他處理，在所有處理中效果最佳(圖1-B)。因此，樹蘭叢生芽增殖最佳培養(yǎng)基為 MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。

表 2 不同質(zhì)量濃度6-BA 與NAA配比對樹蘭叢生芽增殖的影響

2.3 NAA與IBA組合對樹蘭生根的影響

40 d后統(tǒng)計(jì)生根情況，發(fā)現(xiàn)幼芽在16個(gè)不同處理的培養(yǎng)基上均能生根(圖1-C)，且生根率能達(dá)100% ，但不同生根培養(yǎng)基中，根的數(shù)量、長度、粗細(xì)及株高、葉片數(shù)、莖粗均有較大差異(表3、圖1-D)。表3顯示，在處理8中，平均生根數(shù)達(dá)到9.33條/株，顯著高于其他處理，在處理3、4、7、11、13中，平均生根數(shù)也較高，均能達(dá)到7條/株以上。在處理1、4、9、10中，平均根長均能達(dá)到3 cm以上。在處理6、7中，平均根粗均高于1.7 mm，顯著高于其他處理。

表 3 不同質(zhì)量濃度NAA 與IBA配比對樹蘭生根的影響

A.叢生芽的誘導(dǎo)；B.叢生芽的增殖；C.生根誘導(dǎo)情況；D.植株的生長狀況

圖 1 樹蘭莖段直接誘導(dǎo)叢生芽與植株再生

Fig.1 Direct induction of clustered buds from stem and shoot regeneration ofEpidendrum

表3顯示，在處理4中，平均株高能達(dá)到8.98 cm ，顯著高于其他處理組合，而在處理1、3、6、7中，平均株高也能達(dá)到7 cm以上，且在處理1、7中，平均生長的葉片數(shù)也較高，能達(dá)到5.89片/株以上。在處理6、7、8中，平均莖粗均能達(dá)到2.5 mm以上。因此，綜合根的數(shù)量、長度、粗細(xì)及株高、葉片數(shù)、莖粗，在所有組合中，處理4和處理7的效果均較好，其根數(shù)能達(dá)到7條/株以上，株高能達(dá)到7 cm以上，莖粗能夠達(dá)到2 mm以上。但在處理7中，小苗12 d開始產(chǎn)生白色根尖，根粗壯，帶有白色根毛；而在處理4中，小苗15 d才開始產(chǎn)生白色根尖，雖然根也較粗壯，但與處理7比較，其植株生長要相對細(xì)、長、瘦。因此，樹蘭生根的最適宜培養(yǎng)基為處理7，即MS+1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA。

3 討 論

樹蘭常規(guī)的繁殖方式為分株繁殖，但繁殖效率不高，不利于種苗的規(guī)?；a(chǎn)，組培快繁是迅速獲得大量種苗的有效途徑。目前關(guān)于樹蘭組培快繁技術(shù)的報(bào)道主要是通過誘導(dǎo)原球莖途徑獲得。如魏翠華[12]以樹蘭莖尖、側(cè)芽為外植體，張建霞等[13]以樹蘭的幼芽為外植體，潘學(xué)峰等[14]以樹蘭未成熟種子為外植體，分別誘導(dǎo)了樹蘭的原球莖。但一般通過原球莖誘導(dǎo)分化形成的幼芽和根需要時(shí)間較長，其成苗速度慢，周期長，且在長時(shí)間的培養(yǎng)過程中，幼芽分化具有遺傳變異性，導(dǎo)致隨后的生長和形態(tài)發(fā)生變異[15]。種子間基因型也有差異，因此無菌播種萌發(fā)產(chǎn)生的幼苗個(gè)體也存在一定差異，不能很好地保持親本的品種特性。相關(guān)研究表明，目前能保持親本優(yōu)良性狀且較穩(wěn)定的離體培養(yǎng)方式主要是通過對頂芽或腋芽的誘導(dǎo)，其體細(xì)胞的變異率低[16-18]。叢生芽生命力較強(qiáng)，增殖效率高，速度快，避免了原球莖途徑中的分化成苗階段，縮短了組培快繁的周期，且變異率相對較低，因此直接誘導(dǎo)叢生芽途徑對樹蘭的快速繁殖具有重要的意義。

大量研究表明，外源植物生長調(diào)節(jié)劑對植物的組培快繁具有重要作用，不同階段的培養(yǎng)效率與激素種類和濃度均具有較大關(guān)系。本研究結(jié)果表明，在用樹蘭莖段誘導(dǎo)叢生芽階段，6-BA對叢生芽的誘導(dǎo)具有極顯著作用，而NAA則具有顯著作用，這與李媛等[19]在腫節(jié)石斛(Dendrobiumpendulum)、尖刀唇石斛(D.heterocarpum)和報(bào)春石斛(D.primulinum)3種石斛莖段誘導(dǎo)芽的研究結(jié)果一致。陸順教等[20]研究表明，6-BA對秋石斛莖段芽誘導(dǎo)具有主導(dǎo)作用，也與本研究結(jié)果一致。但由于蘭花種類間的差異，激素最佳誘導(dǎo)濃度存在一定差異。在芽增殖上，李媛等[19]研究表明，NAA對腫節(jié)石斛、尖刀唇石斛和報(bào)春石斛芽增殖起主要作用，王澤祺等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與IBA和6-BA相比，NAA對樹蘭莖段芽增殖倍率的影響最大。本研究結(jié)果表明，NAA對樹蘭芽增殖具有極顯著影響，與以上研究結(jié)果相似。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，6-BA與NAA對樹蘭莖段誘導(dǎo)及芽的增殖效果具有極顯著交互作用。魏翠華[12]研究發(fā)現(xiàn)，在樹蘭組培苗生根過程中，添加了0.5 mg/L NAA的1/2 MS培養(yǎng)基比未添加激素的1/2 MS培養(yǎng)基效果明顯。王澤祺等[21]研究發(fā)現(xiàn)，樹蘭在添加1.0 mg/L NAA的1/2 MS培養(yǎng)基上生根較好。但以上研究均只單獨(dú)添加NAA，本研究探討了NAA和IBA組合對樹蘭生根的影響，結(jié)果表明MS+1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA對樹蘭生根效果顯著，生根率能達(dá)到100%，其根數(shù)、根粗、株高以及莖粗等指標(biāo)均較優(yōu)。

本研究探討了不同培養(yǎng)基對樹蘭叢生芽誘導(dǎo)、增殖和生根的影響，篩選出了最適宜的組織培養(yǎng)條件，為樹蘭種苗規(guī)?；a(chǎn)和工廠化育苗提供了必要的技術(shù)支持，為樹蘭種質(zhì)資源的保存及進(jìn)一步的基因工程研究奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment of rapid propagation system for clustered buds ofEpidendrumstem

YI Shuangshuang,LU Shunjiao,LENG Qingyun,WANG cun,YANG Guangsui

(Tropical Crops Genetic Resources Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina,MinistryofAgriculture/HainanEngineeringTechnologyResearchCenterofTropicalOrnamentalPlantGermplasmInnovationandUtilization,Danzhou,Hainan571737,China)

【Objective】 A simple and efficient micro-propagation system was established for direct clustered buds induction fromEpidendrumstems to improve seedling production and industrialization.【Method】 The stem section with axillary bud of current-year tilleringEpidendrumwas used as explant and MS medium was used as basal culture medium to investigate the effects of 6-BA,NAA and IBA at different concentrations on induction,multiplication,and rooting of clustered buds.【Result】 Combinations of 6-BA and NAA at different concentrations had significantly influence on induction and proliferation of clustered buds ofEpidendrumstems.The optimal medium for clustered buds induction was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA with the highest induction rate of 73.13%.The optimal medium for proliferation was MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA with the highest proliferation coefficient of 5.2.NAA and IBA combinations also had significantly influence on rooting ofEpidendrum.The optimal medium for shoot rooting was MS+1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA with the rooting rate of 100%,the average rooting number of 7.78,the shoot height of 7.44 cm,and the stem diameter of 2.82 mm.【Conclusion】 A rapid propagation system for clustered buds ofEpidendrumstem was established,which provided high induction rate and proliferation coefficient of clustered buds and good shoot rooting.

Epidendrum;stem;clustered buds;induction and proliferation;tissue culture

時(shí)間:2016-10-20 16:36

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.12.022

2015-12-09

農(nóng)業(yè)部“引進(jìn)國際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)計(jì)劃(948計(jì)劃)”項(xiàng)目(2011-G13)

易雙雙(1984-)，女，湖北松滋人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事熱帶花卉遺傳育種研究。 E-mail:yishuang8410@163.com

楊光穗(1972-) ，女(苗族)，貴州凱里人，碩士，副研究員，主要從事熱帶花卉營養(yǎng)生理研究。 E-mail:13976572870@163.com

S682.31

A

1671-9387(2016)12-0157-06

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