血鸚鵡遺傳多樣性及經(jīng)濟性狀的關聯(lián)分析

劉肖蓮，姜巨峰，吳會民，李春艷，李文雯，付志茹，宋立民

(1 天津市水產(chǎn)研究所 天津市觀賞魚技術工程中心，天津300221；2 中國水產(chǎn)科學研究院 北戴河中心實驗站，河北 秦皇島 066100)

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血鸚鵡遺傳多樣性及經(jīng)濟性狀的關聯(lián)分析

劉肖蓮1，姜巨峰1，吳會民1，李春艷1，李文雯1，付志茹1，宋立民2

(1 天津市水產(chǎn)研究所 天津市觀賞魚技術工程中心，天津300221；2 中國水產(chǎn)科學研究院 北戴河中心實驗站，河北 秦皇島 066100)

【目的】 研究血鸚鵡家系的遺傳多樣性以及經(jīng)濟性狀與微衛(wèi)星分子標記的連鎖關系，為血鸚鵡分子育種提供理論支持。【方法】 利用自行開發(fā)的6對微衛(wèi)星標記(Vsac01、Vsac02、Vsac03、Vsac04、Vsac05、Vsac06)對3個血鸚鵡家系進行了遺傳多樣性研究，并利用SPSS軟件對這些位點與經(jīng)濟性狀的相關性進行了分析?！窘Y(jié)果】 6對標記在3個家系中共檢測出26個等位基因，每個位點的等位基因數(shù)為2～4；有效等位基因數(shù)為1.87～3.83；期望雜合度為0.464 4～0.738 9；觀察雜合度為0.666 7～1.000 0；多態(tài)信息含量(PIC)為0.356 6～0.690 5，平均值為 0.457 0，總體表現(xiàn)為中等多態(tài)(0.25≤PIC≤0.50)，3個家系的遺傳多樣性處于較高水平。相關性分析結(jié)果表明，Vsac02與體質(zhì)量、褪色率顯著相關(P<0.05)，與體高/體長極顯著相關(P<0.01)；Vsac05、Vsac06與體質(zhì)量顯著相關(P<0.05)，與體長極顯著相關(P<0.01)，Vsac06還與褪色率顯著相關(P<0.05)；Vsac01、Vsac04與肥滿度極顯著相關(P<0.01)，Vsac03與所測指標之間均無相關性?！窘Y(jié)論】 試驗所選的3個血鸚鵡家系遺傳多樣性較高，獲得了5個與經(jīng)濟性狀相關的微衛(wèi)星標記。

血鸚鵡；微衛(wèi)星；遺傳多樣性；經(jīng)濟性狀；連鎖分析

血鸚鵡屬鱸形目慈鯛科，原產(chǎn)于我國臺灣，是由母本紅頭麗體魚(Viejasynspila)與父本橘色雙冠麗魚(Amphilophuscitrinellus)繁殖所得的屬間雜交種，別稱紅財神、財神魚。優(yōu)質(zhì)血鸚鵡生長迅速、抗病力強，具有國人喜愛的火紅色外表、胖嘟嘟的身軀、柔軟的鰭條以及一副“笑口常開的鸚鵡臉龐”，群聚在一起既亮麗又喜氣，在觀賞魚市場銷量很大。但隨著血鸚鵡養(yǎng)殖規(guī)模的盲目擴大，其品質(zhì)降低，嚴重影響經(jīng)濟效益的提高。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖過程中不科學的繁育現(xiàn)象嚴重，致使優(yōu)良性狀基因丟失或被干擾，品種退化，表現(xiàn)為尖頭率與黑頭率高、褪色率低，或者由于優(yōu)良性狀不能穩(wěn)定遺傳，無法繼續(xù)培育出同樣美觀的魚[1]，給養(yǎng)殖戶造成了較大的經(jīng)濟損失，因此亟需對血鸚鵡及其親本種質(zhì)資源、遺傳結(jié)構以及決定重要經(jīng)濟性狀的分子機制進行研究。

微衛(wèi)星分子標記(Microsatellite)，又稱簡單重復序列(Simple sequence repeat)，由于其具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、含量豐富、可重復性好等優(yōu)點，目前已被廣泛應用于水生動物的群體遺傳結(jié)構分析、親緣關系鑒定、遺傳圖譜構建、性狀關聯(lián)分析等領域[2-5]。本試驗利用6對微衛(wèi)星標記對3個血鸚鵡家系進行了遺傳多樣性研究，并對標記與經(jīng)濟性狀的相關性進行了分析，旨在為血鸚鵡種質(zhì)資源調(diào)查、目的基因定位與分子標記輔助育種提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗魚取自天津嘉禾田源觀賞魚養(yǎng)殖有限公司，挑選體色鮮艷、健康無損傷的親本，構建3個血鸚鵡家系，飼養(yǎng)于玻璃缸中，隨機選取88個個體于6月齡時測量體長、體高、體質(zhì)量等參數(shù)，統(tǒng)計褪色率，根據(jù)體質(zhì)量與體長計算肥滿度，剪取尾鰭于無水乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

肥滿度(CF)=W/L3×100%。

(1)

式中：W為體質(zhì)量(g)，L為體長(cm)。

1.2 基因型分析

采用醋酸銨法提取尾鰭基因組DNA，用核酸蛋白儀測量DNA濃度和OD260/OD280值，并根據(jù)濃度將DNA稀釋為100 ng/μL作為工作液。試驗所用引物為天津市水產(chǎn)研究所實驗室自行開發(fā)的6對血鸚鵡微衛(wèi)星引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，其具體信息見表1。PCR反應總體積為10 μL，其中包括10×buffer 1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.8 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，5 U/μLTaq酶0.1 μL，10 ng/μL基因組DNA 1.0 μL，用無菌水補足體積。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s(每個循環(huán)降低0.2 ℃)，72 ℃ 30 s，15個循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s(每個循環(huán)降低0.1 ℃)，72 ℃ 30 s，20個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物利用ABI3730基因分析儀(Applied Biosystems)的片段分析功能進行毛細管電泳，以GS500LIZ為片段長度內(nèi)參，使用3730 Data collection和GeneMapper v4.0軟件讀取微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物的片段長度數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)確定個體在各位點的基因型。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)每個個體基因型，利用軟件PopGene1.32計算不同家系在各個位點的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合度(Ho)與期望雜合度(He)。根據(jù)Botstein等[6]的公式計算多態(tài)信息含量(PIC)：

(2)

式中：Pi、Pj分別為群體中第i和第j個等位基因的頻率，n為某一基因座上的等位基因數(shù)。

表 1 血鸚鵡微衛(wèi)星序列及特征

利用SPSS軟件對血鸚鵡經(jīng)濟性狀與微衛(wèi)星位點的關聯(lián)性進行最小二乘分析，確定與經(jīng)濟性狀顯著相關的標記，對顯著相關標記不同基因型間的性狀進行多重比較(Duncan’s法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 血鸚鵡微衛(wèi)星位點多態(tài)性分析

3個血鸚鵡家系在6個微衛(wèi)星位點共擴增出26個等位基因，各位點的遺傳參數(shù)見表2。由表2可知，各個位點的等位基因數(shù)(Na)為2～4；有效等位基因數(shù)(Ne)為1.87～3.83；期望雜合度(He)為0.464 4～0.738 9；觀察雜合度(Ho)為0.666 7～1.000 0；多態(tài)信息含量(PIC)為0.356 6～0.690 5，平均值為0.457 0，總體表現(xiàn)為中等多態(tài)(0.25≤PIC≤0.50)，3個家系的遺傳多樣性處于較高水平。

表 2 血鸚鵡家系在6個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性參數(shù)

2.2 血鸚鵡性狀與位點的關聯(lián)分析

利用SPSS軟件對標記位點與血鸚鵡體質(zhì)量、體長、體高、體高/體長、肥滿度、褪色率6個性狀進行顯著性檢驗，結(jié)果顯示，6個位點中，Vsac02、Vsac05、Vsac06與體質(zhì)量顯著相關(P<0.05)， Vsac05、Vsac06與體長極顯著相關(P<0.01)，Vsac02與體高/體長極顯著相關，Vsac01、Vsac04與肥滿度極顯著相關，Vsac02、Vsac06與褪色率顯著相關，Vsac03與所測指標之間均無相關性。試驗未發(fā)現(xiàn)與體高相關聯(lián)的位點。對性狀顯著相關的標記進行了基因型間均值的Duncan’s多重比較，結(jié)果見表3。由表3可知，位點Vsac01與Vsac04只有2種基因型，不能進行多重比較。在位點Vsac02中，AC基因型個體體質(zhì)量顯著高于BB基因型個體(P<0.05)，但兩者與BD、BE、BF基因型個體差異不顯著；AC基因型個體體高/體長值極顯著小于其他個體(P<0.01)；BE、BF基因型個體的褪色率顯著或極顯著高于BB、 BD基因型個體，四者與AC基因型個體均無顯著差異，其中BE基因型個體與BB、BD基因型個體的差異達到極顯著水平(P<0.01)，說明基因型AC對體質(zhì)量起正面效應，基因型BE、BF與褪色率呈正相關。位點Vsac05中，AF基因型個體體質(zhì)量顯著或極顯著高于BE、CE基因型個體，與BD、CF基因型個體無顯著差異；AF、CF基因型個體體長極顯著高于BE、CE、BD基因型個體(P<0.01)。位點Vsac06中，AF基因型個體體質(zhì)量顯著大于AD基因型個體(P<0.05)、極顯著大于AE基因型個體(P<0.01)，但與AB基因型個體差異不顯著；AF基因型個體體長極顯著大于AE、AD基因型個體(P<0.01)，顯著大于AB基因型個體(P<0.05)；AB基因型個體褪色率顯著高于AD基因型個體(P<0.05)，二者與AE、AF基因型個體均無顯著差異。因此推測，基因型AF對體質(zhì)量、體長具有正效應，基因型AB對褪色率具有正效應。

表 3 血鸚鵡家系5個位點不同基因型個體表型的多重比較

注：同一位點同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different lowercases in the same column for each locus indicate significant difference (P<0.05),and different capital letters in the same column for each locus indicate extremely significant difference (P<0.01).

3 討 論

血鸚鵡是觀賞魚界十分成功的屬間雜交種之一，由于其體色紅艷，體型圓潤，食性雜，易飼養(yǎng)，已經(jīng)成為一種重要的淡水經(jīng)濟觀賞魚類。目前有關血鸚鵡的研究主要集中在飼料添加劑對其體型、體色、生長及抗病力的影響和胚胎發(fā)育等方面[7-10]。何麗等[11]通過對血鸚鵡及親本體型各個參數(shù)間比例關系的測定發(fā)現(xiàn)，子代在體型和體色方面具備優(yōu)于雙親的表觀性狀;另外，其體高與體長非常接近黃金比例，更具觀賞價值。有關血鸚鵡遺傳結(jié)構分析以及性狀相關分子標記的研究迄今尚未見報道。

本研究利用6對微衛(wèi)星引物對血鸚鵡家系的遺傳多樣性進行了分析，結(jié)果顯示，供試引物在3個家系中均能擴增出穩(wěn)定清晰的條帶，說明這6對引物在血鸚鵡中的適用性較好，可用于下一步分析。6個位點在3個家系中共檢測到26個等位基因，各個位點的等位基因數(shù)為2～4。按照孟德爾遺傳定律，同一家系的等位基因數(shù)不超過4個，說明這些位點的多態(tài)性較高，能夠用于血鸚鵡的遺傳多樣性分析及種質(zhì)資源評估。3個血鸚鵡家系的期望雜合度為0.464 4～0.738 9；觀察雜合度為0.666 7～1.000 0；多態(tài)信息含量為0.356 6～0.690 5，平均值為0.457 0，總體表現(xiàn)為中等多態(tài)，3個家系的遺傳多樣性處于較高水平。

分子標記與性狀的連鎖分析是對位點基因型與性狀表型進行顯著性檢驗，差異顯著則說明標記與控制性狀的主效基因連鎖遺傳，在育種過程中可通過分子標記來追蹤該性狀的主效基因。本試驗用3個血鸚鵡全同胞家系作為材料，分析了位點與性狀的連鎖關系，試驗中同一家系的個體具有相同的遺傳背景與養(yǎng)殖環(huán)境，避免了由于某一位點上等位基因過多，某一基因型個體數(shù)偏少而使經(jīng)濟性狀連鎖分析出現(xiàn)誤差[12]，并且能夠使遺傳標記與數(shù)量性狀基因位點之間達到充分的連鎖不平衡[13]。本試驗在6個位點中發(fā)現(xiàn)，Vsac02、Vsac05、Vsac06與體質(zhì)量顯著相關(P<0.05)， Vsac05、Vsac06與體長極顯著相關(P<0.01)，Vsac02與體高/體長極顯著相關，Vsac01、Vsac04與肥滿度極顯著相關，Vsac02、Vsac06與褪色率顯著相關，Vsac03與所測指標之間均無相關性，未發(fā)現(xiàn)與體高相關聯(lián)的位點。多個位點與同一性狀相關，說明該性狀可能是由1個以上的QTL所控制，即由不同的生理生化過程所調(diào)控[14]。

目前水產(chǎn)動物經(jīng)濟性狀與微衛(wèi)星標記的關聯(lián)研究主要集中在形態(tài)性狀、抗病性狀、溫度耐受性狀等方面[15]，金舒博等[16]利用15個微衛(wèi)星分子標記對一個鏡鯉家系進行基因型與形態(tài)性狀的關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)3個位點(HLJ021、HLJ354、HLJ551)與體質(zhì)量顯著相關，4個位點(HLJ021、HLJ044、HLJ551、HLJ330)與體高顯著相關，HLJ354與體質(zhì)量、體高、體長均顯著相關。王惠儒等[17]選取13個多態(tài)微衛(wèi)星位點，以岱衢洋大黃魚低溫耐受組和正常對照組2個F2代群體為材料，檢測到標記LYC0015的112 bp等位基因在低溫耐受組的出現(xiàn)頻率達48%，而在正常對照組中的出現(xiàn)頻率為0，表明該等位基因?qū)︶丰檠蟠簏S魚溫度特性較為敏感，可能與某種耐低溫基因存在一定的連鎖關系。本試驗對性狀顯著相關的標記進行了基因型間均值的Duncan’s多重比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位點Vsac02中AC基因型個體在體質(zhì)量與體高/體長上優(yōu)于其他基因型，基因型BE、BF在褪色率上均優(yōu)于其他基因型；位點Vsac05中基因型AF在體質(zhì)量與體長上優(yōu)于其他基因型；位點Vsac06中AF基因型個體在體質(zhì)量與體長上、AB基因型個體在褪色率上具有明顯優(yōu)勢。這些標記有望成為相應性狀的輔助育種標記，在育種過程中可選取含有以上基因型的親本進行雜交，使優(yōu)勢基因型逐漸得到富集和保存，進而提高子代中性狀優(yōu)良個體的比例。

本研究初步篩選出與血鸚鵡經(jīng)濟性狀相關的分子標記，今后仍需進一步在其他群體中對這些標記與性狀的相關性進行驗證，夯實血鸚鵡新品種培育的理論基礎。

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LIU Xiaolian1，JIANG Jufeng1，WU Huimin1，LI Chunyan1，LI Wenwen1，F(xiàn)U Zhiru1，SONG Limin2

(1 Tianjin Fisheries Research Institute,Tianjin Ornamental Fish Technology and Engineering Center,Tianjin 300221，China;2BeidaiheCentralExperimentStation,ChineseAcademyofFisherySciences，Qinhuangdao，Hebei066100，China)

blood parrot fish;microsatellite;genetic diversity;economic trait;correlation analysis

時間:2016-10-20 16:36

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.12.008

2016-01-07

天津市科技計劃項目(12ZCDZNC06000，15ZXBFNC00190)

劉肖蓮(1985-)，女，湖北宜城人，工程師，主要從事魚類分子育種研究。E-mail：xiaolianiss@foxmail.com

付志茹(1965-)，女，天津?qū)幒尤耍呒壒こ處?，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖與生物多樣性研究。E-mail：zhfu117@163.com

S965.8

A

1671-9387(2016)12-0051-05

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