陜西及周邊地區(qū)PRRSV Nsp2與GP5基因變異分析

吳旭錦，朱小甫

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 動物疫病分子生物學(xué)診斷實驗室，陜西 咸陽 712000)

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陜西及周邊地區(qū)PRRSVNsp2與GP5基因變異分析

吳旭錦，朱小甫

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 動物疫病分子生物學(xué)診斷實驗室，陜西 咸陽 712000)

【目的】 了解陜西及周邊省份部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)Nsp2和GP5的變異情況?！痉椒ā?采用套式RT-PCR方法，從肝、脾、肺和血清中直接擴增Nsp2、GP5基因并克隆測序，將獲得的PRRSV流行毒株序列與GenBank中30個PRRSV參考毒株進行比對分析，構(gòu)建進化樹?！窘Y(jié)果】 獲得了13株P(guān)RRSV的Nsp2基因序列(GenBank登錄號 KM233849～KM233861)和12株GP5基因序列(GenBank登錄號 KM233862～KM233873)?；蜻M化樹分析顯示所有測定PRRSV流行毒株均屬北美洲型。對Nsp2基因序列分析發(fā)現(xiàn)，12株P(guān)RRSV為氨基酸缺失毒株，1株P(guān)RRSV為經(jīng)典毒株。發(fā)現(xiàn)GSXF毒株有可能是一株重組毒株。PRRSV變異株與經(jīng)典株相比，GP5蛋白中存在多處氨基酸點突變?！窘Y(jié)論】 陜西豬場PRRSV流行毒株以變異株為主，同時存在經(jīng)典毒株和重組毒株。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；Nsp2基因；GP5基因；陜西及周邊省份

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)最早發(fā)生在20世紀80年代的美國[1]，隨后歐洲也爆發(fā)了該病。直到1991年，荷蘭中央獸醫(yī)局分離到了新病毒[2]，隨后美國和加拿大也分離到該病毒，至此確定了病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)。本病傳播迅速，很快蔓延到全世界。我國于1996年首次在北京地區(qū)豬群中分離到了PRRSV[3]。2006年，我國南方爆發(fā)的豬無名高熱引起了巨大損失，最終農(nóng)業(yè)部確定病原為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Highly-pathogentic PRRSV，HP-PRRSV)，PRRSV的變異株引起學(xué)者們的高度關(guān)注[4-6]。

PRRSV分為2個基因型，即北美洲型(以VR-2332為代表株)和歐洲型(以LV為代表株)，兩個類型毒株之間核苷酸同源性差異較大。PRRSV基因組全長約15 kb，含8個開放閱讀框(ORF)，編碼2個非結(jié)構(gòu)蛋白和6個結(jié)構(gòu)蛋白[7]，其中Nsp2屬非結(jié)構(gòu)蛋白，由ORF1a編碼，與PRRSV對細胞或組織的嗜性有關(guān)。美洲型PRRSVGP5基因長度為603 bp，其編碼200個氨基酸，而歐洲型PRRSVGP5基因長度為606 bp，編碼201個氨基酸。GP5蛋白是PRRSV的主要中和抗原蛋白，免疫保護作用突出。國內(nèi)外研究表明，Nsp2和GP5的變異程度較大，且其變異會導(dǎo)致病毒致病力的改變，因而是研究PRRSV遺傳變異的熱點區(qū)域[8-9]。本課題組對陜西省部分地區(qū)2013-2014年P(guān)RRSVNsp2和GP5基因變異情況進行了調(diào)查，以期了解陜西省PRRSV的變異特點，為PRRS防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料與血清 所有組織病料由本課題組采集或由豬場送檢，主要包括病死豬肺臟、脾臟、肝臟和淋巴結(jié)，將各組織研磨處理，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，共計65份。另采集病豬血清42份，將組織病料上清液和血清置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試 劑 TRIzol Reagent、pGEM-T Easy載體購自Invitrogen公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/μL)、RNA酶抑制劑(40 U/μL)、DEPC處理水、rTaqDNA酶(5 U/μL)、dNTP(各成分均為10 mmol/L)、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒等均購自生工生物工程(上海)有限公司。DL2000 DNA分子質(zhì)量標準為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。DH5α感受態(tài)細胞為動物疫病分子生物學(xué)診斷實驗室保存。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上公布的PRRSV CH-1a(GenBank登錄號：AY032626)、HUN4(GenBank登錄號：EF635006)以及JXA1(GenBank登錄號：EF112445)全基因組序列，利用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計了4對引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成，用DEPC處理水稀釋到20 μmol/L備用。引物序列與預(yù)期擴增片段長度見表1。

表 1 供試引物的相關(guān)信息

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取 取病料上清液或血清250 μL，放入1.5 mL無菌無RNA酶EP管中，加入750 μL TRIzol Reagent裂解10 min，加入200 μL預(yù)冷的氯仿，劇烈振搖，充分乳化，靜置10 min后于4 ℃、12 000 r/min離心10 min；吸取上清液600 μL轉(zhuǎn)移至另一EP管中，加入750 μL冰冷的異丙醇顛倒混勻，置-20 ℃沉淀30 min；4 ℃、12 000 r/min再次離心10 min，棄去上清液，加入1 mL冰冷的體積分數(shù)75%酒精洗滌1次，棄去酒精，倒置離心管自然干燥即得總RNA。

1.2.2 第一鏈cDNA的合成 在核酸干燥過程中，按照以下體系配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液： DEPC處理水12.5 μL，5×AMV Buffer 4.0 μL， dNTP 2.0 μL，下游引物Nsp2-1R或GP5-1R 1.0 μL，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL，RNA酶抑制劑反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL，總體積20.0 μL。核酸干燥后用配制好的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液充分溶解核酸，置42 ℃水浴反轉(zhuǎn)錄90 min，取出即可作為模板用于PCR擴增。

1.2.3Nsp2、GP5基因的套式RT-PCR擴增Nsp2、GP5基因擴增體系和條件一致，第1次擴增反應(yīng)體系為：cDNA 2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+2.0 μL，dNTP 1.0 μL，上、下游引物Nsp2-1F/Nsp2-1R或GP5-1F/GP5-1R各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.5 μL，用超純水補足總體積25.0 μL。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性50 s， 55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取2.0 μL第1次擴增產(chǎn)物作為模板進行第2次擴增，體系同上，引物選用第2次擴增引物Nsp2-2F/Nsp2-2R或GP5-2F/GP5-2R。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性5 min；進入循環(huán)后94 ℃變性 40 s， 58 ℃退火50 s，72 ℃ 延伸50 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5.0 μL第2次擴增產(chǎn)物，進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)中照相觀察。

1.2.4Nsp2、GP5基因序列測定與分析 將擴增得到的Nsp2、GP5基因PCR產(chǎn)物用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收，連接pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，菌液PCR鑒定為陽性后，取樣送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。選取GenBank中登錄的參考序列(表2)，利用DNAStar軟件進行序列比對分析，繪制系統(tǒng)發(fā)生樹，并選取部分代表毒株比較相應(yīng)的氨基酸序列。

表 2 用于序列比較的PRRSV參考毒株基本信息

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSVNsp2、GP5基因的套式RT-PCR擴增結(jié)果

從部分送檢病料和血清中成功擴增出了Nsp2、GP5基因片段，擴增的PRRSV變異株Nsp2基因長約562 bp，經(jīng)典株約為649 bp(圖1)；擴增的GP5基因長約927 bp(圖2)，包含了完整的GP5基因603 bp，片段長度與預(yù)期大小相符。

將不同地域來源的毒株陽性樣品測序后共獲得了13株P(guān)RRSV的Nsp2基因和12株P(guān)RRSV的GP5基因序列，將序列上傳GenBank獲得了相應(yīng)的登錄號，序列基本信息見表3。

2.2 PRRSVNsp2基因序列比對

將30個PRRSV參考毒株全基因序列截短至與本研究測定的Nsp2長度一致后，將其與本試驗測定的13株P(guān)RRSVNsp2基因片段進行比對分析，應(yīng)用DNAStar軟件繪制進化樹。從進化樹(圖3)可見，參比Nsp2基因序列分為2大群，即歐洲型和北美洲型。其中需要注意的是，我國參考毒株NVDC-NM1-2011為歐洲型毒株，提示我國存在歐洲型PRRSV。本研究測定的13株病毒均屬于北美洲型，而北美洲型又可細分為5個亞群，其中僅有SXLC01-Nsp2株屬于第2亞群，其余12株均屬于第1亞群。

M.DL2000 DNA分子質(zhì)量標準;1～6.部分PRRSV Nsp2基因擴增產(chǎn)物(1～5為部分Nsp2基因變異株，6為Nsp2基因經(jīng)典株)

圖 1 部分PRRSVNsp2基因擴增結(jié)果

Fig.1 Amplification of partial PRRSVNsp2 gene

M.DL2000 DNA分子質(zhì)量標準;1～8.GP5基因擴增產(chǎn)物

圖 2 部分PRRSVGP5基因擴增結(jié)果

Fig.2 Amplification of partial PRRSVGP5 gene

為便于分析，選取參考毒株CH-1a、HUN4、JXA1、VR-2332、TJ與本研究測定毒株進行核苷酸序列同源性比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所測定的13個毒株間Nsp2基因同源性在74.7%～99.8%，其與JXA1強毒株同源性在66.4%～98.7%，與2001年的CH-1a相比，同源性為78.4%～90.0%，與經(jīng)典北美洲型VR-2332毒株同源性為75.1%～94.3%，與HUN4強毒株同源性在66.0%～98.6%，與TJ株同源性在66.0%～98.0%。

表 3 基于Nsp2和GP5基因序列的陜西及周邊省份PRRSV毒株基本信息

☆.本研究測定毒株 Isolates used in the research

圖 3 陜西及周邊省份PRRSVNsp2基因進化樹

Fig.3 Phylogenetic tree of PRRSV based onNsp2 sequence in Shaanxi and neighboring provinces

推導(dǎo)氨基酸序列比較表明，本研究測定的13個PRRSV毒株間同源性為56.5%～97.3%，其與JXA1強毒株同源性為56.0%～97.8%，與CH-1a同源性為69.4%～86.0%，與VR-2332毒株同源性為62.9%～90.7%。從圖4可見，本研究測定的13個毒株中，僅SXLC01-Nsp2未發(fā)生氨基酸缺失現(xiàn)象，其他毒株均存在30個氨基酸的不連續(xù)缺失現(xiàn)象。

2.3 PRRSVGP5基因序列比對

將PRRSV參考毒株全基因序列截短至與本研究測定的PRRSVGP5長度一致，將其與獲得的12株P(guān)RRSV流行毒株GP5基因比對，繪制進化樹。結(jié)果(圖5)顯示，PRRSV可分為北美洲型和歐洲型兩大群，其中歐洲型的6個毒株分群上沒有變化；北美洲型毒株亞群分布上有一定變化，用GP5基因比對可將其分為4個亞群，其中GSXF-ORF5屬于第3亞群，而GSXF-Nsp2則屬于第1亞群；其余11個毒株仍屬于第1亞群。

與參考毒株CH-1a、HUN4、JXA1、VR-2332、TJ進行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測定的12個PRRSV毒株間GP5基因同源性為89.6%～99.5%；其與經(jīng)典PRRSV毒株VR-2332同源性在89.0%～97.2%，其中GSXF-ORF5與VR-2332同源性高達97.2%；與經(jīng)典疫苗株CH-1a同源性為92.1%～95.6%；與高致病性豬藍耳病滅活苗JXA1株同源性為90.2%～99.0%；與HUN4株同源性為90.7%～99.5%；與TJ株同源性為90.5%～99.1%。

本研究測定的12株P(guān)RRSV GP5蛋白比較重要的位點有R13、R151、S137，這些位點變化與PRRSV毒力有關(guān)。此外，變異株和經(jīng)典株GP5相比存在多處點突變，如E3→G3，G9→C9，S16→F16，C24→Y24，F(xiàn)25→L25，N58→Q58，S66→T/I66，A92→(G/S)92，V94→A94，F(xiàn)101→Y101，T121→I121，F(xiàn)127→L127，R164→G164，V185→A185，I189→L189，Q196→(L/R)196。

圖中方框表示與經(jīng)典株相比，變異株Nsp2缺失30個不連續(xù)氨基酸

圖 4 陜西及周邊省份Nsp2推導(dǎo)氨基酸序列缺失現(xiàn)象

Fig.4 Absence of Nsp2 deduced amino acid sequence in Shaanxi and neighboring provinces

3 討 論

自從20世紀80年代美國報道發(fā)生PRRS以來，該病迅速蔓延至世界各地。2006年我國爆發(fā)高致病性PRRS，造成了巨大的經(jīng)濟損失，隨后國內(nèi)許多研究都證實PRRSV變異株普遍存在于我國豬場，成為嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一[4,10]。

Nsp2基因編碼PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白，易發(fā)生變異。研究認為，PRRSV變異株與經(jīng)典毒株相比，Nsp2推導(dǎo)氨基酸序列存在不連續(xù)的30個氨基酸的缺失[11-12]。以前認為，氨基酸缺失的特征是高致病性PRRSV的重要標志，但后來有學(xué)者研究證明該缺失與毒力無直接聯(lián)系[9]。張民澤等[13]研究認為，不同毒株間Nsp2編碼區(qū)存在較大差異，可能與病毒對細胞或組織的嗜性有關(guān)。本研究設(shè)計了套式RT-PCR方法，為分析2013-2014年陜西省豬場PRRSV流行特點，成功擴增出了涵蓋變異株缺失區(qū)域的Nsp2基因片段，獲得了13株P(guān)RRSV流行毒株序列。本研究PRRSVNsp2基因進化樹分析表明，13株P(guān)RRSV均屬于北美洲型，未發(fā)現(xiàn)歐洲型毒株。24個PRRSV參考毒株和13個測定PRRSV流行毒株中的北美洲型可細分為5個亞群，其中僅有1株本研究測定的流行毒株屬于第2亞群，其余12株均屬于第1亞群，表明第1亞群為優(yōu)勢亞群。分析顯示，獲得的13株P(guān)RRSV Nsp2氨基酸序列中，12株存在不連續(xù)的30個氨基酸缺失，為PRRSV變異株；陜西洛川毒株SXLC01-Nsp2不存在氨基酸缺失現(xiàn)象，為PRRSV經(jīng)典毒株，與VR-2332核苷酸序列同源性高達94.3%，氨基酸序列同源性為90.7%。結(jié)果證實陜西豬場PRRSV以變異株為主，同時存在經(jīng)典毒株。

GP5蛋白是PRRSV主要的保護性抗原，且GP5蛋白在不同的PRRSV中變異較大，這種多變性會直接影響疫苗的交叉保護率[14]。本研究中PRRSVGP5基因進化樹分析表明，用GP5基因分群和用Nsp2基因分群結(jié)果在大群上一致，個別毒株在亞群分布上有一定差異。獲得的12個PRRSVGP5基因毒株中，其與經(jīng)典株VR-2332基因同源性達89.0%～97.2%，其中GSXF-ORF5株與經(jīng)典株VR-2332同源性高達97.2%，遺傳上和經(jīng)典VR-2332株更為相似。但從Nsp2基因?qū)Ρ确治隹?，GSXF株與VR-2332同源性僅為77.6%，而與國內(nèi)變異株HUN4、JXA1、TJ株的同源性高達98.0%以上，提示GSXF毒株有可能是一株重組毒株。目前已有研究認為，PRRSV不同毒株之間會發(fā)生重組[15]，Liu等[16]通過動物試驗證實早在感染后1周即可發(fā)現(xiàn)PRRSVGP5和Nsp2基因重組現(xiàn)象。本研究進一步印證了在豬場的流行毒株中存在重組毒株，表明豬群中的PRRSV流行毒株存在多樣性和復(fù)雜性。

☆為本研究測定毒株 Isolates used in the research

圖 5 陜西及周邊省份PRRSVGP5基因進化樹

Fig.5 Phylogenetic tree of PRRSV based onGP5 sequence in Shaanxi and neighboring provinces

Allende等[17]研究認為，GP5蛋白中13和151位氨基酸與毒力相關(guān)，本研究測定的12株均為R13、R151，符合強毒株的特征。流行毒株與經(jīng)典疫苗株的137位氨基酸上均為S137，提示獲得的流行毒株均是野毒。Ostrowski等[18]采用噬菌體表面展示確定了PRRSV ORF5的2個最主要的抗原表位，分別為位于第27-30位氨基酸 (A/L)27L28V29N30和37-39位氨基酸S37H38(L/I)39。比較發(fā)現(xiàn)，在這2個抗原表位中，測定毒株和參考毒株CH-1a、HUN4、JXA1、VR-2332、TJ的27位均為V，29位差異較大，測定毒株有6株為V29，6株為A29，這一差異對抗原性有無影響，有待于進一步研究。測定毒株和參考株S37H38無變化，39位上2個測定毒株為L，10株為I，提示第37-39位氨基酸抗原表位遺傳穩(wěn)定。此外，PRRSV變異株和經(jīng)典株GP5相比存在多處點突變，這些突變對PRRSV的致病性、抗原性有無影響，需要深入研究。

近些年來，由于面臨PRRS的巨大壓力，豬場越來越傾向于使用弱毒疫苗控制PRRS，市場上經(jīng)典弱毒株和變異株致弱毒株共存，豬場頻繁使用疫苗和一個豬場使用多個疫苗毒株加劇了PRRSV的變異和重組，為PRRS的防控帶來了更大的困難，繼續(xù)研究PRRSV流行毒株關(guān)鍵基因的遺傳變異特點，把握PRRSV的變異規(guī)律，有助于人們進一步了解PRRS的流行規(guī)律，為防控PRRS提供參考。

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Variation of Nsp2 and GP5 genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Shaanxi and neighboring provinces

WU Xujin,ZHU Xiaofu

(Animal Epidemic Disease Diagnostic Laboratory of Molecular Biology,Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,XianyangVocationalTechnicalCollege,Xianyang,Shaanxi712000,China)

【Objective】 This study aimed to understand the variation of reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)Nsp2 andGP5 genes in Shaanxi and neighboring provinces. 【Method】Nsp2 andGP5 genes were cloned and sequenced from liver,spleen,lung,and serum by RT-PCR method.Sequences of 30 PRRSV

trains were obtained in GenBank and compared with prevalent strains,and phylogenetic trees were constructed.【Result】 A total of 13 PRRSVNsp2 gene sequences (GenBank Accession No.KM233849-KM233861) and 12GP5 gene sequences (GenBank Accession No.KM233862-KM233873) were obtained.Phylogenetic trees showed that all prevalent PRRSV strains belonged to North American-type.Nsp2 gene sequence analysis revealed that 12 prevalent PRRSV strains were gene deletion strain and 1 was classical strain.GSXF may be a recombinant strain.Compared with classical strains,GP5 protein variants existed more mutations at amino acid points.【Conclusion】 Mutant PRRSV strains were dominant in Shaanxi farms,and the existence of classical strains and recombinant strains was confirmed.GP5 protein amino acid point mutations occurred with high frequency.

porcine reproductive and respiratory syndrome virus;Nsp2 gene;GP5 gene;Shaanxi and neighboring provinces

時間:2016-10-20 16:36

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.12.001

2015-06-15

咸陽市科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2014K02-21)；咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院重點科研項目(2013KYA01)

吳旭錦(1979-)，女，陜西西安人，副教授，博士，主要從事動物疫病分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。 E-mail：yaoyuanwxj@163.com

S852.65+1

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1671-9387(2016)12-0001-08

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