肥胖癥患者脂肪組織中的SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平及臨床意義

李莉，趙艷麗，劉傳亮，于汪營(yíng)

肥胖癥患者脂肪組織中的SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平及臨床意義

李莉1，趙艷麗2，劉傳亮3，于汪營(yíng)4

目的探討肥胖癥患者脂肪組織中的沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）mRNA和蛋白表達(dá)水平及其在肥胖癥治療中的臨床意義。方法選取接受肥胖治療的患者105例，以體質(zhì)量指數(shù)（BMI）分為肥胖癥組（BMI≥23 kg/m2）和對(duì)照組（18.5 kg/m2≤BMI＜23 kg/m2）；取2組患者腹膜脂肪組織。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)2組患者脂肪組織SIRT1 mRNA表達(dá)水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)脂肪組織SIRT1的蛋白表達(dá)水平。并分析2組SIRT1蛋白表達(dá)水平與BMI、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）以及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的相關(guān)性。結(jié)果肥胖癥組SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P＜0.05）。肥胖癥組脂肪組織中TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR均高于對(duì)照組（P＜0.05）。SIRT1的蛋白表達(dá)水平與總TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.391、-0.941、-0.184、-0.215及-0.990，均P＜0.05）。結(jié)論肥胖癥患者腹膜脂肪組織中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較非肥胖患者均明顯下降，且SIRT1蛋白表達(dá)水平與肥胖相關(guān)指標(biāo)呈相關(guān)性，對(duì)臨床治療肥胖癥具有一定的指導(dǎo)作用。

肥胖癥；皮下脂肪，腹部；人體質(zhì)量指數(shù)；RNA,信使；血脂異常；血糖；沉默信息調(diào)節(jié)因子1

肥胖是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病等疾病的重要發(fā)病基礎(chǔ)，肥胖癥及其相關(guān)疾病嚴(yán)重?fù)p害了患者的身體和心理健康，使患者生活質(zhì)量明顯下降，已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1-2］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肥胖癥的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的慢性過(guò)程，通常是攝入熱量過(guò)多而消耗太少，低能量代謝導(dǎo)致脂肪在體內(nèi)堆積所致。目前，針對(duì)肥胖的分子水平研究主要集中在葡萄糖利用、脂肪儲(chǔ)存和代謝、胰島素信號(hào)通路等環(huán)節(jié)［3-4］。其中，沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）在肥胖、胰島素抵抗中的作用日益受到關(guān)注［5-6］。哺乳動(dòng)物脂肪細(xì)胞中，SIRT1可能是通過(guò)胰島素（INS）/胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）-1通路發(fā)揮作用，SIRT1影響INS/IGF-1信號(hào)通路下游的FOXO1（Forkhead box O1），通過(guò)調(diào)節(jié)FOXO1或FOXO1的靶基因來(lái)調(diào)控脂肪細(xì)胞分化［7］。目前，有關(guān)SIRT1在肥胖者脂肪組織中的表達(dá)情況尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在分析肥胖癥患者脂肪組織中的SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，探討其在肥胖癥治療中的指導(dǎo)意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2012年4月—2014年4月來(lái)我院接受肥胖治療的患者105例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞18歲，沒(méi)有遺傳性疾病家族史。（2）無(wú)惡性腫瘤。（3）無(wú)糖尿病［根據(jù)病史及空腹血糖（FPG）］及甲狀腺功能異常。（4）無(wú)肝腎功能不全。（5）無(wú)嚴(yán)重消化系統(tǒng)疾病影響進(jìn)食或慢性腹瀉。（6）無(wú)厭食癥或近期未進(jìn)行節(jié)食減肥。參照文獻(xiàn)［8］，以體質(zhì)量指數(shù)（BMI）作為分組的標(biāo)準(zhǔn)：BMI≥23 kg/m2者48例為肥胖癥組，男19例，女29例，年齡36～69歲，平均（47.25±5.36）歲；18.5 kg/m2≤BMI＜23 kg/m2者57例為對(duì)照組，男23例，女34例，年齡35～69歲，平均（48.65±5.71）歲。2組性別（χ2=0.014）、年齡（t=0.198）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要材料與試劑逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量2× SYBR Green Mix購(gòu)自南京唯贊生物有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成；SIRT1試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司；SIRT1小鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；DAB顯色劑購(gòu)自上海生工生物有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；酶標(biāo)儀MK3購(gòu)自上海賽默飛世爾公司。

1.3 標(biāo)本采集肥胖癥組通過(guò)抽吸方法獲取腹部皮下脂肪組織標(biāo)本。對(duì)照組在腹部手術(shù)時(shí)，摘取切除組織的脂肪組織作為研究標(biāo)本。所有試驗(yàn)者標(biāo)本的收集均通過(guò)本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)及患者的知情同意。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)脂肪組織SIRT1 mRNA表達(dá)水平取2組患者脂肪組織0.1 g，根據(jù)RNA提取液試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank提供的SIRT1的序列，設(shè)計(jì)引物如下：上游5′-GGGGTTTCTGTCTCCTGT-3′，下游5′-GAATGGTCTTGGGTCTTT-3′；GAPDH：上游5′-CCTTCCGTGTTCCTACCC-3′，下游5′-CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3′。引物稀釋為10 μmol/L。對(duì)引物特異性和退火溫度進(jìn)行條件優(yōu)化后制備PCR反應(yīng)體系，總反應(yīng)體積20 μL。1 500 r/min離心1 min后將反應(yīng)混合物離心至管底，反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃2 min；變性94℃30 s；退火60℃30 s；72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。為確定產(chǎn)物的特異性，構(gòu)建熔解曲線，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上直接讀取數(shù)據(jù)。

1.4.2ELISA檢測(cè)脂肪組織SIRT1的蛋白表達(dá)水平取2組患者脂肪組織0.5 g，置于小燒杯中，用眼科剪盡快剪碎組織塊，加入200 μL組織裂解液，組織勻漿儀勻漿5 min，冰上放置20 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SIRT1的蛋白表達(dá)水平，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)光密度（OD）值。

1.4.3 血清血脂、FPG以及空腹INS（FINS）水平檢測(cè)分別抽取2組患者清晨空腹靜脈血，4 000 r/min離心10 min后取上清，根據(jù)相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)于Roche Modular PPI全自動(dòng)生化分析儀上，CHOD-PAP法檢測(cè)總膽固醇（TC）、GPO-PAP法檢測(cè)三酰甘油（TG）、葡萄糖氧化酶法測(cè)定FPG、放射免疫法測(cè)定FINS。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=（FPG× FINS）/22.5。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，2組間比較用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較用卡方檢驗(yàn)。對(duì)照組和肥胖癥組患者SIRT1蛋白表達(dá)水平與TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組脂肪組織中SIRT1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線良好，重復(fù)性高。引物特異性好，擴(kuò)增時(shí)未見(jiàn)雜峰出現(xiàn)，見(jiàn)圖1。肥胖癥組脂肪組織中SIRT1 mRNA表達(dá)水平（0.87±0.25）低于對(duì)照組（2.91±0.47），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.196，P＜0.05）。

2.2 2組脂肪組織SIRT1的蛋白表達(dá)水平比較建立的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線具有很好的線性，R2=0.992。肥胖癥組脂肪組織中SIRT1蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組［（875.78±128.70）μg/L vs.（5 179.46±465.14）μg/L，t=4.505，P＜0.05］。

2.3 2組血清TC、TG及FPG等比較肥胖癥組血清中TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR均高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.4 對(duì)照組和肥胖癥組患者SIRT1的蛋白表達(dá)水平與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)分析結(jié)果SIRT1的蛋白表達(dá)水平與TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.391、-0.941、-0.184、-0.215及-0.990，均P＜0.05）。

Fig.1Comparison of SIRT1 mRNA levels in adipose tissue between two groups圖1 2組脂肪組織中SIRT1 mRNA表達(dá)水平比較

Tab.1Comparison of serum levels of lipids,fasting glucose and FINS between two groups表1 2組血清血脂、血糖以及FINS水平比較

Tab.1Comparison of serum levels of lipids,fasting glucose and FINS between two groups表1 2組血清血脂、血糖以及FINS水平比較

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別肥胖癥組對(duì)照組t n 48 57 TC（mmol/L）5.26±0.97 4.37±0.81 2.219＊TG（mmol/L）2.11±0.53 1.45±0.35 2.671＊FPG（mmol/L）10.83±2.81 5.13±1.47 3.058＊＊組別肥胖癥組對(duì)照組t n 48 57 FINS（mU/L）16.37±3.37 9.61±2.85 2.971＊＊HOMA-IR 6.42±1.67 2.19±0.52 2.189＊

3 討論

肥胖是一種與遺傳、代謝密切相關(guān)的多因素疾病。目前，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肥胖患者存在不同程度的胰島素抵抗［8-9］。胰島素抵抗可促使正常人群糖耐受惡化，是導(dǎo)致2型糖尿病的主要原因［10］。

目前，有關(guān)SIRT1蛋白在肥胖患者脂肪組織中表達(dá)水平的研究較少。SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性Sirtuin去乙?；易逯械囊粏T，SIRT1在動(dòng)物脂肪細(xì)胞分化與脂肪代謝過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。SIRT1的脫乙酰酶活性影響細(xì)胞的存活、分化、衰老和凋亡［11-12］。研究顯示，在INS/IGF-1通路中，SIRT1可以作用于其上游胰島素受體底物（IRS）-1，導(dǎo)致IRS-1磷酸化水平升高，此外，SIRT1還能夠作用于通路下游FOXO1，上調(diào)FOXO1活性，增強(qiáng)其與CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α的相互作用，增加脂聯(lián)素基因的轉(zhuǎn)錄水平，減輕胰島素抵抗［13-15］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，肥胖癥組脂肪組織SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降，提示SIRT1的下調(diào)可能導(dǎo)致胰島素依賴的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，同時(shí)可能下調(diào)FOXO1活性，增加了胰島素抵抗，這一表型與肥胖患者的臨床表型是一致的。

肥胖患者多數(shù)伴有糖尿病、高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。本研究結(jié)果顯示，肥胖癥組脂肪組織中TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR均高于對(duì)照組，證實(shí)了肥胖患者的確存在血脂和血糖顯著增高的情況。另外，SIRT1的蛋白表達(dá)水平與TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)，提示SIRT1蛋白表達(dá)水平降低時(shí)，可能導(dǎo)致了患者糖代謝、脂代謝通路受阻，引起血糖、血脂以及HOMA-IR升高，導(dǎo)致病情加劇。這一結(jié)果在部分其他研究中也得到了初步證實(shí)［16］。

綜上所述，SIRT1蛋白表達(dá)水平在肥胖患者中明顯下調(diào)，其與肥胖患者血糖、血脂以及HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)，可通過(guò)改善SIRT1蛋白表達(dá)水平達(dá)到調(diào)節(jié)代謝平衡、治療肥胖的目的。

［1］Reilly JJ.Assessment of obesity in children and adolescents: synthesis of recent systematic reviews and clinical guidelines［J］.J Hum Nutr Diet，2010，23（3）：205-211.doi:10.1111/j.1365-277X.2010.01054.x.

［2］Yin XY，Zheng FP，Zhou JQ，et al.Central obesity and metabolic risk factors in middle-aged Chinese［J］.Biomed Environ Sci，2014，27（5）：343-352.doi:10.3967/bes2014.059.

［3］Santander AM，Lopez-Ocejo O，Casas O，et al.Paracrine interactions between adipocytes and tumor cells recruit and modify macrophages to the mammary tumor microenvironment:the role of obesity and inflammation in breast adipose tissue［J］.Cancers（Basel），2015，7（1）：143-178.doi:10.3390/cancers7010143.

［4］Xie CC，F(xiàn)u WB，Sun J，et al.The regularization scheme of acupuncture fortreatmentofsimpleobesity［J］.Journalof Chinese medicine，2011，12（31）：4751-4753.

［5］Becatti M，Taddei N，Cecchi C，et al.SIRT1 modulates MAPK pathways in ischemic-reperfused cardiomyocytes［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69（13）：2245-2260.doi:10.1007/s00018-012-0925-5.

［6］Toorie AM，Nillni EA.Minireview:Central Sirt1 regulates energy balance via the melanocortin system and alternate pathways［J］.Mol Endocrinol，2014，28（9）：1423-1434.doi:10.1210/me.2014-1115.

［7］He M，Gao SJ.A novel role of SIRT1 in gammaherpesvirus latency and replication［J］.Cell Cycle，2014，13（21）：3328-3330.doi: 10.4161/15384101.2014.968431.

［8］Apovian CM.Obesity:definition，comorbidities，causes，and burden［J］.Am J Manag Care，2016，22（7 Suppl）：s176-185.

［9］Kume S，Kitada M，Kanasaki K，et al.Anti-aging molecule，Sirt1:a novel therapeutic target for diabetic nephropathy［J］.Arch PharmRes，2013，36（2）：230-236.doi:10.1007/s12272-013-0019-4.

［10］Geliebter A，Ochner CN，Dambkowski CL，et al.Obesity-related hormones and metabolic risk factors:a randomized trial of diet plus either strength or aerobic training versus diet alone in overweight participants［J］.J Diabetes Obes，2014，1（1）：1-7.

［11］Mariani S，F(xiàn)iore D，Basciani S，et al.Plasma levels of SIRT1 associate with non-alcoholic fatty liver disease in obese patients［J］.Endocrine，2015，49（3）：711-716.doi:10.1007/s12020-014-0465-x.

［12］Frederic P，Martin K，Namjin C，et al.Sirt1 promotes fat mobilization in white adipocytes by repressing PPAR-γ［J］.Nature，2004，429（6993）：771-776.

［13］Costa Cdos S，Hammes TO，Rohden F，et al.SIRT1 transcription is decreased in visceral adipose tissue of morbidly obese patients with severe hepatic steatosis［J］.Obes Surg，2010，20（5）：633-639. doi:10.1007/s11695-009-0052-z.

［14］Zhao JM，Wang R.Research progress on the function of SIRT1［J］. Int J Endocrinol，2011，31（2）：110-112.

［15］Maria EG，Linda P.The interaction between FOXO and SIRT1: tipping the balance towards survival［J］.Trends Cell Biol，2004，14（8）：408-412.

［16］Moschen AR，Wieser V，Gerner RR，et al.Adipose tissue and liver expression of SIRT1，3，and 6 increase after extensive weight loss in morbid obesity［J］.J Hepatol，2013，59（6）：1315-1322.doi: 10.1016/j.jhep.2013.07.027.

（2016-05-24收稿2016-06-21修回）

（本文編輯陸榮展）

The expression levels and clinical significance of SIRT1 mRNA and protein in adipose tissue of obese patients

LI Li1,ZHAO Yanli2,LIU Chuanliang3,YU Wangying4
1 Department of Endocrinology,the Second People’s Hospital of Pingdingshan City,Pingdingshan 467000,China; 2 Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou Universiti,Henan;3 General Surgery, 4 Department of Pathology,the Second People’s Hospital of Pingdingshan City

ObjectiveTo explore expression levels of SIRT1 mRNA and protein in adipose tissue of obese patients, and its clinical significance in the treatment of obesity.MethodsA total of 105 patients in our hospital were selected and divided into obesity group(BMI≥23 kg/m2)and control group(18.5 kg/m2≤BMI＜23 kg/m2)according to body mass index (BMI).SIRT1 mRNA expression levels in adipose tissue(collected from peritoneum)were detected by quantitative PCR method in two group.SIRT1 protein expression levels of adipose tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent (ELISA)in two groups.The relationships of SIRT1 expression,BMI,total cholesterol(TC),triglyceride(TG),fasting plasma glucose(FPG)and insulin resistance(HOMA-IR)were analyzed between two group.ResultsSIRT1 mRNA and protein levels were significantly lower in obesity group than those of normal group(P＜0.05).The values of TC,TG,FPG,FINS and HOMA-IRinadiposetissueweresignificantlyhigherinobesitygroupthanthoseofnormalgroup(P＜0.05).Theproteinexpression level of SIRT1 was positively correlated with values of TC,TG,FPG,FINS and HOMA-IR(r=-0.391,-0.941,-0.184,0.215 and-0.990,P＜0.05).ConclusionSIRT1 mRNA and protein expression levels in adipose tissue are significantly reduced in obesity patients than those of control group.There is a close relationship between SIRT1 protein level and obesity index, which has certain guidance for clinical treatment of obesity.

obesity;subcutaneous fat,abdominal；body mass index；RNA,messenger；dyslipidemias；blood glucose；silent information regulator 1

R589.2

A

10.11958/20160404

1河南省平頂山市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（郵編467000）；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科；3河南省平頂山市第二人民醫(yī)院普外科，4病理科

李莉（1978），女，本科，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌科臨床研究