大高良姜不同部位總黃酮的提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究Δ

劉 源，唐 斌，張孝琴，楊 剛（西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，四川瀘州 646000）

大高良姜不同部位總黃酮的提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究Δ

劉 源＊，唐 斌，張孝琴，楊 剛（西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，四川瀘州 646000）

目的：優(yōu)化大高良姜根、莖、葉不同部位總黃酮提取工藝并比較其體外抗氧化活性。方法：采用超聲輔助提取的方法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、水浴溫度、超聲時間為因素，以總黃酮提取率為指標(biāo)，優(yōu)化大高良姜總黃酮提取工藝，并對各部位總黃酮在不同質(zhì)量濃度下（0.1～1.0 mg/ml）進(jìn)行DPPH自由基清除、O2－自由基清除、植物和動物油脂保護(hù)作用的體外抗氧化活性試驗(yàn)[均以維生素C（VC）為對照]。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為料液比1∶23.8、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、水浴溫度80℃、超聲時間33.5 min；此條件下大高良姜根、莖、葉中總黃酮提取率分別為53.5、52.7、52.5 mg/g，與預(yù)測值相對誤差均不高于2.48%。各部位總黃酮在0.5 mg/ml時對DPPH自由基清除率為葉（94.3%）＞根（93.6%）＞莖（90.8%），VC為96.4%；在1.0 mg/ml時對O2－自由基清除率為根（63.7%）＞莖（60.2%）＞葉（42.9%），VC為94.7%；在0.4 mg/ml時對植物油脂的保護(hù)率為葉（39.7%）＞莖（30.6%）＞根（28.3%），對動物油脂的保護(hù)率為葉（40.6%）＞莖（30.2%）＞根（29.3%），VC均約為60%。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝可行，可用于大高良姜不同部位總黃酮的提取；各部位總黃酮均具有一定的抗氧化活性，并以葉中總黃酮的抗氧化活性相對較強(qiáng)。

大高良姜；根；莖；葉；總黃酮；提取工藝；Box-Behnken響應(yīng)面法；抗氧化活性

瀘州當(dāng)?shù)氐奶厣〕渣S粑具有健脾暖胃、久置不腐的特點(diǎn)[1]，這與其包裹食物所用的大高良姜葉有關(guān)。四川境內(nèi)的大高良姜葉的種類很多，但僅在川南瀘州獨(dú)特的地理和氣候下生長的大高良姜葉才不長蟲、不“生病”、種植時也無需農(nóng)藥[2]，故其藥用價值值得探究。

大高良姜（Alpinia galangal Willd）為姜科山姜屬植物，是《中國藥典》收錄的藥用植物[3]，果實(shí)入藥稱為紅豆蔻。其味辛，性熱，有溫胃、散寒、行氣止痛之功效[4-5]，通常用作調(diào)經(jīng)劑、驅(qū)風(fēng)劑、退熱劑和抗炎藥等，尤其對支氣管炎、心臟疾病、慢性腸炎、腎結(jié)石、糖尿病、風(fēng)濕病及腎臟等多種中老年疾病有很好的防治效果[6]。黃酮類成分是大高良姜的藥效基礎(chǔ)。近年來對大高良姜的研究主要集中在根、莖部位[7]，但對其根、莖、葉等不同部位黃酮類含量及活性的比較研究鮮有報(bào)道。超聲提取技術(shù)是一種可加速植物細(xì)胞內(nèi)有效成分溶出而強(qiáng)化提取過程的技術(shù)，目前已越來越廣泛地應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取工藝中[8]。筆者以瀘州當(dāng)?shù)卮蟾吡冀母?、莖、葉為研究對象，采用超聲技術(shù)有效提取其中的總黃酮，并對各部位總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為大高良姜的有效利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ5200型超聲波處理機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；SP-1901型紫外-可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

大高良姜（2014年3月采挖于四川省瀘州市龍馬潭區(qū)特興鎮(zhèn)魏園村黃金山生態(tài)園，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院唐斌教授鑒定為正品）；蘆丁對照品（上海阿拉丁化學(xué)試劑公司，批號：A2010Q37，純度：≥98%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma公司，批號：BC515795，純度：99%）；維生素C（VC，東北制藥集團(tuán)有限公司，批號：20130412，純度：＞99.7%）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、鹽酸、乙醚等均為分析純；動物油為市購豬板油熬制而成；植物油為魯花菜籽油。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材的處理

將大高良姜整株洗凈后將其分成整株、根、莖、葉4個部分，置于40℃烘箱中烘干，粉碎，乙醚脫脂3次，過60目篩備用。

2.2 蘆丁的含量測定[9]

2.2.1 線性關(guān)系考察 精確稱取蘆丁對照品適量，溶于60%乙醇溶液并制備成0.20 mg/ml的對照品溶液。分別吸取上述溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，置于6個50 ml的量瓶中，加60%乙醇補(bǔ)至10.0 ml，再加5%NaNO2溶液0.80 ml，搖勻，靜置6 min；加10%Al（NO3）3溶液0.80 ml，搖勻，靜置6 min；加4% NaOH溶液5.00 ml，再用60%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min。取不同質(zhì)量濃度（c）溶液于510 nm波長處測吸光度（A），繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A＝8.398c+0.003（R2＝0.998 2），得蘆丁檢測質(zhì)量濃度線性范圍為10～200 μg/ ml。

2.2.2 方法學(xué)考察 根據(jù)相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果，精密度試驗(yàn)中吸光度的RSD＝1.03%（n＝6），表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)中含量的RSD＝0.98%（n＝6），樣品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中平均方法回收率為99.05%（RSD＝1.26%，n＝6），表明該方法的準(zhǔn)確度較好。

2.3 大高良姜中總黃酮的提取工藝及提取率測定[10]

準(zhǔn)確稱取大高良姜粉2.00 g，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇水浴加熱，超聲輔助提?。üβ?00 W），抽濾，石油醚萃?。壢ナ兔褜樱?，重復(fù)萃取2次。將2次濾液合并，加入乙醇定容至25 ml，搖勻，放置過夜。取1 ml置于50 ml量瓶中，按“2.2.1”項(xiàng)下方法于510 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出質(zhì)量濃度，并計(jì)算大高良姜總黃酮的提取率（提取液中總黃酮量/大高良姜粉量，mg/g）。

2.4 單因素試驗(yàn)篩選各因素水平

以大高良姜整株粉為原料，設(shè)定超聲功率為200 W，乙醇

體積分?jǐn)?shù)為80%，料液比為1∶25，水浴溫度為80℃，超聲時間為30 min。固定其他條件，依次改變料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、水浴溫度（40、50、60、70、80℃）、超聲時間（20、30、40、50、60 min），以總黃酮的提取率為評價指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)篩選各因素水平。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。結(jié)果如下：（1）隨著料液比的增加，總黃酮提取率增大；當(dāng)料液比大于1∶30時，總黃酮提取率增加緩慢，至1∶35后逐漸趨于穩(wěn)定，這可能是由于黃酮溶出量已達(dá)到平衡所致。故以料液比為1∶30時較優(yōu)。（2）在乙醇低于70%時，隨著體積分?jǐn)?shù)的升高，總黃酮提取率增加較為明顯；但高于70%后，總黃酮提取率隨之降低，原因可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，黃酮類化合物擴(kuò)散速度加快，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，脂溶性的雜質(zhì)溶出增加并消耗溶劑所致。故以乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時較優(yōu)。（3）總黃酮提取率隨著水浴溫度升高而增加，在60～70℃范圍內(nèi)提取率增幅變緩，而后明顯下降，原因可能是溫度升高導(dǎo)致脂溶性雜質(zhì)的溶出增加、消耗溶劑所致。故以水浴溫度為70℃時較優(yōu)。（4）隨著超聲時間的延長，總黃酮提取率增加明顯，但50 min后提取率逐漸下降，可能是黃酮的溶出率達(dá)到了動態(tài)平衡且黃酮氧化分解速度逐漸增加所致。考慮到時間延長耗能增加，故以超聲時間為40 min時較優(yōu)。

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化各因素水平

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方案 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)的自變量。以總黃酮的提取率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)4因素3水平中心組合試驗(yàn)方案，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素水平編碼設(shè)計(jì)見表1；響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

2.5.2 回歸分析與方差分析 根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到模型的擬 合曲線方程為：Y＝49.62+1.71X1－0.31X2+1.93X3+1.86X4+0.30X1X2+ 0.050X1X3－0.13X1X4+2.73X2X3+1.60X2X4+2.00X3X4－3.27X12－1.10X22－3.25X32－1.52X42（R2＝0.992 6）。同時對模型進(jìn)行了回歸系數(shù)和方差分析的顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由方差分析可知，該模型的P＝0.002 8＜0.01，表明該模型的回歸方程極為顯著。X3、X4因素對總黃酮提取率有顯著影響，各因素對總黃酮提取率影響大小順序?yàn)閄3＞X4＞X1＞X2。其中，作用顯著的是X1、X2X3，極顯著的是X3、X4、X12、X32。

2.5.3 響應(yīng)面分析各因素之間的交互作用 根據(jù)擬合回歸方程，固定4個因素中的任意2個因素為零水平，繪制另外2個交互項(xiàng)的響應(yīng)面圖，以考察其對總黃酮提取率的影響，見圖1。

由圖1可見，X1與X3兩因素影響最大，而X2與X4影響不顯著。這與方差分析結(jié)果相一致。

2.5.4 最優(yōu)提取工藝的確定 利用Design-Expert 8.0.6軟件，得到最優(yōu)化的提取工藝為料液比1∶23.81、乙醇體積分?jǐn)?shù)60.07%、水浴溫度79.63℃、超聲時間33.65 min。在此條件下總黃酮提取率的預(yù)測值為53.838 mg/g。綜合考慮總黃酮提取率和試驗(yàn)可操作性等因素，調(diào)整最優(yōu)工藝條件為料液比1∶23.8、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、水浴溫度80℃、超聲時間33.5 min。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Tab 2 Design proposal and results of experiment

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

2.6 大高良姜根、莖、葉不同部位總黃酮提取驗(yàn)證試驗(yàn)

在上述最優(yōu)提取工藝條件下，分別對大高良姜不同部位（根、莖、葉）進(jìn)行總黃酮的提取、測定，各試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見表4。

圖1 兩因素交互作用對總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig 1 Response surface of the extraction rate of total flavonoids effected by two factors interaction

表4 大高良姜不同部位的總黃酮提取率Tab 4 The extraction rate of total flavonoids from different parts ofA.galangal

由表4可見，實(shí)測值與預(yù)測值間的相對誤差極小，說明建立的模型可信度較高、預(yù)測性良好，提取工藝可行，可用于大高良姜中總黃酮的提取。

2.7 大高良姜各部位總黃酮的體外抗氧化活性考察[11-12]

2.7.1 DPPH自由基清除率測定 將不同部位的總黃酮提取物用95%乙醇制備成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的總黃酮乙醇溶液，另同法制備VC溶液（作為陽性對照），分別取2.0 ml，各分別加入2.0 ml DPPH（1 mmol/L）溶液，混合均勻后于25℃避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測定吸光度A1；另取2.0 ml各不同質(zhì)量濃度總黃酮乙醇溶液（VC溶液），加入2.0 ml 95%乙醇混合均勻后測定吸光度A2；測定2.0 ml水加入2.0 ml DPPH（1 mmol/L）溶液后的吸光度A0。計(jì)算DPPH自由基清除率：[1－（A1－A2）/A0×100%]。大高良姜不同部位總黃酮對DPPH自由基的清除率測定結(jié)果見圖2A。

由圖2A可見，大高良姜不同部位總黃酮對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增大，在0.1～0.5 mg/ml范圍內(nèi)，從葉中提取的總黃酮在各質(zhì)量濃度下對DPPH自由基的清除率均高于根和莖；在質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml時，根、莖、葉提取的總黃酮及VC對DPPH自由基清除率分別為93.6%、90.8%、94.3%、96.4%，排序?yàn)閂C＞葉＞根＞莖，但差別不大。

圖2 大高良姜不同部位總黃酮的體外抗氧化活性注：與VC比較，＊P＞0.05Fig 2 Antioxidant activity of total flavonoids from different parts ofA.galangal in vitroNote：vs.VC，＊P＞0.05

2.7.2 O2－自由基清除率測定 取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）4.0 ml，置于25℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入1 ml不同部位的0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml總黃酮乙醇溶液和VC溶液（作為陽性對照），再加入1 ml 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5 min，加入1 ml 8%HCl終止反應(yīng)，于320 nm波長處測定吸光度A；空白對照組以相同體積蒸餾水取代總黃酮乙醇溶液，測定吸光度A0。計(jì)算O2－自由基清除率：（A0－A）/A0×100%。大高良姜不同部位總黃酮對O2－自由基的清除率測定結(jié)果見圖2B。

由圖2B可見，在0.1～1.0 mg/ml范圍內(nèi)，隨總黃酮質(zhì)量濃度增大清除率增大，但各部位總黃酮對O2－自由基的清除率明顯低于VC，根與莖的清除率非常接近，略高于葉；當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml時，根、莖、葉、VC對O2－自由基的清除率分別為63.7%、60.2%、42.9%、94.7%，排序?yàn)閂C＞根＞莖＞葉。

2.7.3 油脂保護(hù)率測定 取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/ml的各部位總黃酮乙醇溶液及VC溶液，加至溫?zé)嵊椭?，攪勻；在一定溫度的烘箱中?qiáng)化保存，并以未加抗氧化劑者為對照組，于不同時間取樣，按GB/T5009.37-1996[12]測定油脂過氧化值（POV），再計(jì)算保護(hù)率。結(jié)果，大高良姜不同部位總黃酮對植物和動物油脂的保護(hù)率分別見圖2C、D。

由圖2C可見，在0.1～0.6 mg/ml范圍內(nèi)，隨總黃酮質(zhì)量濃度增大其對植物油脂的保護(hù)率增大。當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度小于0.2 mg/ml時，各部位總黃酮對植物油脂的保護(hù)率與VC相似；在0.4 mg/ml時，對植物油脂的保護(hù)率大小為葉（39.7%）＞莖（30.6%）＞根（28.3%），VC約為60%；當(dāng)質(zhì)量濃度在0.3～0.5 mg/ml范圍內(nèi)，對植物油脂的保護(hù)率大小順序?yàn)槿~＞莖＞根；質(zhì)量濃度高于0.5 mg/ml時，則葉＞根＞莖。但總體來說，大高良姜根、莖、葉部位提取的總黃酮對植物油脂的保護(hù)率均低于VC。

由圖2D可見，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度小于0.3 mg/ml時，對動物油脂的保護(hù)率大小順序?yàn)楦厩o＞葉；質(zhì)量濃度高于0.4 mg/ml時，則葉＞莖＞根。在0.4 mg/ml時，對動物油脂的保護(hù)率大小為葉（40.6%）＞莖（30.2%）＞根（29.3%），VC約為60%?？傮w來說，當(dāng)質(zhì)量濃度在0.1 mg/ml時，不同部位對動物油脂的保護(hù)率與VC相當(dāng)；當(dāng)質(zhì)量濃度在0.5 mg/ml時，葉提取物對動物油脂的保護(hù)率最大，且與VC相當(dāng)。

3 討論

通過比較大高良姜不同部位總黃酮的提取率及體外抗氧化作用，結(jié)果表明，雖然葉中總黃酮的提取率與其他部位比較不是最高，但綜合來看，葉中的總黃酮在各不同的抗氧化性試驗(yàn)中其抗氧化活性是相對較強(qiáng)的。比如當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/ml時，對動物油脂的抗氧化活性與VC相當(dāng)。故此結(jié)論為瀘州黃粑用其葉包裹能久置不腐提供了科學(xué)依據(jù)，此結(jié)論也對綜合開發(fā)利用川南瀘州獨(dú)特的大高良姜及大高良姜葉提供了一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

為更全面地分析大高良姜及大高良姜葉活性成分，筆者在此試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，下一步還將對提取工藝中的其他可能有影響的相關(guān)因素如超聲功率和提取次數(shù)等進(jìn)行研究，并將針對大高良姜葉采用其他提取方法如酶解法、微波法來進(jìn)行總黃酮的提取研究，將多種方法進(jìn)行比較以選擇最優(yōu)方案，從而更好地開發(fā)利用大高良姜葉。

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Optimization of the Extraction Technology and Antioxidant Activity Study in vitro of Total Flavones from Different Parts of Alpinia galangal

LIU Yuan，TANG Bin，ZHANG Xiaoqin，YANG Gang（Dept.of Chemistry，College of Basic Medicine，Southwest Medical University，Sichuan Luzhou 646000，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of total flavonoids from the root，stem and leaves of Alpinia galangal and compare the antioxidant activities of the flavonoids in vitro.METHODS：Taking into account the four factors，such as the ratio of solid to liquid，the volume fraction of ethanol，the temperature of enzymatic hydrolysis and the time of ultrasonic，using the extraction rate of total flavonoids as index，with the method of ultrasonic assisted，the extraction technology of total flavonoids from A.galangal was optimized by Box-Behnken response surface test on the basis of single factor experiment.The antioxidant activity tests in vitro of different concentrations of total flavonoids（0.1-1.0 mg/ml）from different parts of A.galangal were conducted，including DPPH free radical clearance test，O2－free radical clearance test，protective test of vegetable and animal fat [using vitamin C（VC）as control].RESULTS：The optimal extraction technology as follows as the ratio of solid to liquid was 1∶23.8；the volume fraction of ethanol was 60%；water bath temperature was 80℃；ultrasonic time was 33.5 min.Under this condition，the extraction rates of total flavonoids from the root，stem and leaves of A.galangal were 53.5，52.7，52.5 mg/g.The rates of their relative error from predicted value were all no more than 2.48%.When the mass concentration was 0.5 mg/ml，the antioxidant capacity of total flavonoids from different parts of A.galangal to DPPH free radicals was as follows as leaves（94.3%）＞root（93.6%）＞stem（90.8%）；the antioxidant capacity of VC was 96.4%.When the mass concentration was 1.0 mg/ml，the antioxidant capacity to O2－free radicals was as follows as root（63.7%）＞stem（60.2%）＞leaves（42.9%）；the antioxidant capacity of VC was 94.7%.When the mass concentration was 0.4 mg/ml，the protective rate to vegetable fat was as follows as leaves（39.7%）＞stem（30.6%）＞root（28.3%）；the protective rate to animal fat was as follows as leaves（40.6%）＞stem（30.2%）＞root（29.3%）；the protective rate of VC was about 60%.CONCLUSIONS：Optimized extraction technology is feasible，and can be used for the extraction of total flavones from different parts of A.galangal.Total flavones from different parts have certain antioxidant activity，specially the total flavones from leaves of A.galangal is stronger than other.

Alpinia galangal；Root；Stem；Leaves；Total flavones；Extraction technology；Box-Behnken response surface methodology；Antioxidant activity

R284.1；R285.5

A

1001-0408（2016）31-4429-04

2016-01-05

2016-03-21）

（編輯：劉 萍）

2014年瀘州市科技局項(xiàng)目[No.2014（56）]；2015年西南醫(yī)科大學(xué)科研基金（No.LZ20150026）

＊講師，碩士。研究方向：化學(xué)教學(xué)與科研。電話：0830-2525695。E-mail：190670328@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.32