補(bǔ)骨脂提取物的體外抑菌活性研究

王秀云，徐 麗，陸 贏，曾建國(guó)[.深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院藥劑科，廣東深圳 58067；.深圳市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 58035；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家中藥材（湖南）技術(shù)中心，長(zhǎng)沙 408；4.湖南省中藥提取工程研究中心，長(zhǎng)沙 4030]

補(bǔ)骨脂提取物的體外抑菌活性研究

王秀云1＊，徐 麗1，陸 贏2，曾建國(guó)3，4#[1.深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院藥劑科，廣東深圳 518067；2.深圳市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518035；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家中藥材（湖南）技術(shù)中心，長(zhǎng)沙 410128；4.湖南省中藥提取工程研究中心，長(zhǎng)沙 410301]

目的：研究補(bǔ)骨脂提取物對(duì)9種可能引起細(xì)菌性腹瀉的病原菌的體外抑菌活性。方法：采用藥敏濾紙片法、試管稀釋法測(cè)定補(bǔ)骨脂提取物（含60%補(bǔ)骨脂酚）對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、單增李斯特菌、副傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌等病原菌的敏感度、最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。結(jié)果：體外抑菌試驗(yàn)中補(bǔ)骨脂提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有較強(qiáng)的抑菌作用，均為中度敏感，其MIC分別為3.9、25、50、125、250 μg/ml，MBC分別為7.8、50、100、125、500 μg/ml；對(duì)副傷寒沙門氏菌無(wú)任何抑制作用；對(duì)其他菌株的MIC、MBC均大于1 000 μg/ml。結(jié)論：含60%補(bǔ)骨脂酚的補(bǔ)骨脂提取物對(duì)多種細(xì)菌性腹瀉病原菌具有體外抑菌活性，補(bǔ)骨脂酚在其中可能發(fā)揮了主要作用。

補(bǔ)骨脂提取物；細(xì)菌性腹瀉；補(bǔ)骨脂酚；體外抑菌；最低抑菌濃度；最低殺菌濃度

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實(shí)，具有溫腎壯陽(yáng)，溫補(bǔ)脾腎之功效，內(nèi)用于陽(yáng)痿遺精、遺尿尿頻、腰膝冷痛、腎虛作喘、五更泄瀉的治療；外用于白癜風(fēng)和斑禿的治療[1]。補(bǔ)骨脂含有呋哺香豆素、黃酮類成分、單萜酚類成分等。對(duì)補(bǔ)骨脂及其復(fù)方制劑的質(zhì)量控制常以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為指標(biāo)成分[2]，目前，對(duì)屬單萜酚結(jié)構(gòu)的另一主要成分補(bǔ)骨脂酚（Bakuchiol）的研究引起了業(yè)界關(guān)注。補(bǔ)骨脂酚常溫下為淺黃色油狀液體，脂溶性較強(qiáng)，據(jù)報(bào)道，其在補(bǔ)骨脂中的含量可達(dá)1%～7%[3]。現(xiàn)代藥理研究表明補(bǔ)骨脂酚在體外有很強(qiáng)的抑菌[4]、抗炎、退熱[5]等作用。有專利將其制成藥物，用于治療乳腺癌和骨質(zhì)疏松[6]。

鑒于中藥補(bǔ)骨脂的廣泛應(yīng)用，其主要成分之一的補(bǔ)骨脂酚的含量遠(yuǎn)高于補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量的總和。研究顯示，補(bǔ)骨脂酚對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌的生長(zhǎng)均有明顯抑制作用[7-8]。在本研究中，筆者采用含60%補(bǔ)骨脂酚的補(bǔ)骨脂提取物對(duì)可引起細(xì)菌性腹瀉的病原菌的體外抑菌活性進(jìn)行研究，旨在為補(bǔ)骨脂酚的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與試劑

補(bǔ)骨脂提取物（湖南美可達(dá)生物資源有限公司，批號(hào)：BGZF11-3，純度：含60%補(bǔ)骨酯酚）。二甲基亞砜、氫氧化鈉和乙酸乙酯等均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司）。

1.2 指示菌種

大腸桿菌（菌株編號(hào)：CMCC44717）、金黃色葡萄球菌（菌株編號(hào)：CMCC56002）、雞白痢沙門氏菌（菌株編號(hào)：CVCC-518）、豬霍亂沙門氏菌（菌株編號(hào)：CVCC504）、多殺性巴氏桿菌（菌株編號(hào)：CVCC2117）、豬鏈球菌（菌株編號(hào)：CVCC 3307）、單增李斯特菌（菌株編號(hào)：CVCC53004）均由中國(guó)獸醫(yī)菌種保藏中心提供；副傷寒沙門氏菌（中國(guó)藥品生物制品檢定所菌種中心，菌株編號(hào)：CMCC50094）；蠟樣芽孢桿菌（華南微生物資源中心，菌株編號(hào)：ACCC11109）。

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌、芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌用水解酪蛋白（MH）肉湯培養(yǎng)基（上海順勃生物工程技術(shù)有限公司），其余菌株用添加5%胎牛血清的MH肉湯培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 補(bǔ)骨脂提取物抑菌藥液的制備

按抑菌藥物貯存液質(zhì)量濃度不低于1 000 μg/ml或10倍于最高測(cè)定濃度的要求[9]，在補(bǔ)骨脂提取物中加入適量20%二甲亞砜溶液，使其質(zhì)量濃度達(dá)到2 000 μg/ml。同時(shí)，單獨(dú)取20%二甲亞砜溶液進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，判斷其是否有抑菌效果，以排除溶劑的影響。

2.2 抑菌圈測(cè)定

取定性濾紙，用打孔機(jī)打成直徑為7 mm的圓紙片，取50片圓紙片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎，121℃高壓滅菌20～30 min后，置于37℃恒溫干燥箱中至完全干燥。在該青霉素空瓶?jī)?nèi)加入“2.1.1”項(xiàng)下制備的補(bǔ)骨脂提取物抑菌藥液適量，并翻動(dòng)紙片，使各紙片充分浸透（翻動(dòng)紙片時(shí)注意勿將紙片搗爛）。同時(shí)，在瓶口上記錄藥物名稱，置于37℃溫箱內(nèi)過(guò)夜，干燥后立即密封，切勿受潮，置陰暗干燥處存放，備用。在無(wú)菌條件下，傾倒相應(yīng)的菌種對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基平板，表面涂布相應(yīng)的菌種接種物，待平板凝固后，貼加浸藥濾紙片，用無(wú)菌鑷子使紙片和平板結(jié)合緊密，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈大小，并判斷敏感度。抑菌圈直徑≥20 mm為高度敏感；抑菌圈直徑15～＜20 mm為中度敏感；抑菌圈直徑10～＜15 mm為中介敏感；抑菌圈直徑＜10 mm為耐藥；抑菌圈直徑為0 mm表示該濃度的藥物對(duì)這種細(xì)菌無(wú)任何抑制作用，為完全長(zhǎng)菌[10]。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

采用常量肉湯稀釋法測(cè)定抑菌藥物MIC和MBC[11]。用接種環(huán)在待測(cè)菌平板上挑取4～5個(gè)直徑1 mm左右的單菌落，接種于4～5 ml相應(yīng)MH肉湯中，37℃培養(yǎng)6 h。增菌后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含1×108～2×108個(gè)菌集落形成單位（CFU）/ml。取無(wú)菌試管11支排成一排，每管先加入1 ml用MH肉湯稀釋1 000倍的菌液，之后向第1管中加入1 ml藥液，然后吸取1 ml至第2管，混勻后再吸取1 ml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第10管，并從第10管中吸取1 ml棄去，第11管為不含藥物的菌液作為生長(zhǎng)對(duì)照。于37℃培養(yǎng)24 h，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC；將高于且包含MIC濃度的試管繼續(xù)于37℃培養(yǎng)24 h，以不長(zhǎng)菌的試管濃度作為MBC濃度。

3 結(jié)果

補(bǔ)骨脂提取物對(duì)9種指示菌的抑菌圈直徑及MIC、MBC測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表1。

由表1可知，補(bǔ)骨脂提取物對(duì)除副傷寒沙門氏菌外的8種細(xì)菌有不同程度的抑菌作用，其中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑在15～20 mm之間，為中度敏感；以上菌種中，除雞白痢沙門氏菌外，補(bǔ)骨脂提取物對(duì)其余的菌種均有很好的抑菌效果，MIC在3～250 μg/ml之間、MBC在7.8～500 μg/ml之間，尤其是對(duì)蠟樣芽孢桿菌（MIC、MBC為3.9、

7.8 μg/ml）、單增李斯特菌（MIC、MBC為25、50 μg/ml）的抑菌效果極強(qiáng)。在MIC、MBC試驗(yàn)時(shí)，同時(shí)使用20%二甲亞砜不加藥液作為空白溶液對(duì)各個(gè)菌株進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌株在空白溶液中生長(zhǎng)良好，證明20%二甲亞砜對(duì)各菌株無(wú)抑菌作用。

表1 補(bǔ)骨脂提取物對(duì)9種指示菌的抑菌圈直徑及MIC、MBCTab 1 Diameter of inhibition zone，MIC and MBC of P.corylifolia extract to 9 pathogens

4 討論

補(bǔ)骨脂酚來(lái)源豐富，具有降糖、降血脂、抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗癌等多種藥理活性。從補(bǔ)骨脂屬植物Psoralea glandulosa葉中提取分離的補(bǔ)骨脂酚具有抗炎活性[12]。目前，對(duì)于補(bǔ)骨脂酚的來(lái)源、理化性質(zhì)、藥理作用等方面的研究雖已取得一些成果[13-14]，但補(bǔ)骨脂酚抑菌、抗氧化、抗癌等的作用機(jī)制尚不明確，有關(guān)補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂酚活性研究及作用機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

本研究為初步了解補(bǔ)骨脂提取物的抑菌活性，采用體外抑菌試驗(yàn)方法，對(duì)能引起腹瀉的菌種進(jìn)行研究。根據(jù)《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》附件中人畜共患傳染病中相關(guān)規(guī)定，選擇了本研究中的9種細(xì)菌性腹瀉病原菌為試驗(yàn)對(duì)象。通過(guò)試驗(yàn)可知補(bǔ)骨脂提取物對(duì)多種指示菌有不同程度的抑菌作用。除副傷寒沙門氏菌外，含量為60%的補(bǔ)骨脂酚對(duì)其余的菌種都有很好的抑菌效果（MIC≥3.9 μg/ml、MBC≥7.8 μg/ml），尤其對(duì)蠟樣芽孢桿菌的MIC為3.9 μg/ml，抑菌效果最強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂提取物對(duì)菌性腹瀉病原菌有一定的抑制作用，是一種天然的抑菌劑?？紤]補(bǔ)骨脂提取物中補(bǔ)骨脂酚含量為60%，結(jié)合已有補(bǔ)骨脂酚的抑菌活性研究推斷，本試驗(yàn)中可能是補(bǔ)骨脂提取物中的補(bǔ)骨脂酚發(fā)揮了主要抑菌作用[12-14]，這對(duì)于補(bǔ)骨脂酚的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

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（編輯：劉明偉）

Study on in vitro Bacteriostatic Activity of Psoralea corylifolia Extract

WANG Xiuyun1，XU Li1，LU Ying2，ZENG Jianguo3，4[1.Dept.of Pharmacy，Shenzhen Nanshan District Shekou People’s Hospital，Guangdong Shenzhen 518067，China；2.Center Laboratory，Shenzhen Second People’s Hospital，Guangdong Shenzhen 518035，China；3.National Chinese Medicinal Herbs（Hunan）Technology Center，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；4.Hunan Research Center for Traditional Chinese Medicine Extraction Technology，Changsha 410301，China]

OBJECTIVE：To study in vitro bacteriostatic activity of Psoralea corylifolia extract（containing 60%bakuchiol）to 9 pathogens which may induce bacillary diarrhea.METHODS：Drug sensitivity filter disk method and tube dilution method were used to determine sensitivity，MIC and MBC of P.corylifolia extract to Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Salmonella pullorum，Bacillus expneumoenteritidis suis，Pasteurella multocida，Streptococcus suis，Listeria monocytogenes，Bacillus paratyphosus and Bacillus cereus.RESULTS：In the in vitro bacteriostatic tests，P.corylifolia extract strongly inhibited B.cereus，L.monocytogenes，P.multocida，S.aureus and E.coli，belonging to medium sensitive；MICs were 3.9，25，50，125，250 μg/ml and MBCs were 7.8，50，100，125，500 μg/ml，respectively.B.paratyphosus didn’t influenced by P.corylifolia extract；MICs and MBCs were more than 1 000 μg/ml in other becterial species.CONCLUSIONS：P.corylifolia extract containing 60%bakuchiol shows in vitro bacteriostatic activity to various pathogens，in which the bakuchiol may play a major role.

Psoralea corylifolia extract；Bacillary diarrhea；Bakuchiol；in vitro bacteriostatic；MIC；MBC

R282.6

A

1001-0408（2016）31-4382-03

2016-05-10

2016-09-12）

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0755-21606999。E-mail：wangxiu.yun@163.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：天然藥物開(kāi)發(fā)。電話：0731-84686560。E-mail：ginkgo@world-way.net

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.19