六味地黃丸對(duì)糖尿病模型大鼠血管組織中HO-1的影響Δ

呂小輝，王 喆，孫佳瑜，蔡智剛，張瑞鵬，單愛(ài)云#（.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東深圳 580；.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 400；.深圳清華大學(xué)研究院，廣東深圳 58067）

六味地黃丸對(duì)糖尿病模型大鼠血管組織中HO-1的影響Δ

呂小輝1＊，王 喆2，孫佳瑜1，蔡智剛1，張瑞鵬3，單愛(ài)云1#（1.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東深圳 518033；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；3.深圳清華大學(xué)研究院，廣東深圳 518067）

目的：探討六味地黃丸對(duì)糖尿病模型大鼠血管中血紅素加氧酶1（HO-1）的影響。方法：將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、六味地黃丸組（14 g/kg，每天ig給藥）和HO-1抑制劑鋅原卟啉（10 μmol/kg，隔日ip給藥）+六味地黃丸組（14 g/kg，每天ig給藥），每組12只。除正常組外，其余各組大鼠均ip鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型。成模后，各給藥組大鼠給予相應(yīng)藥物，正常組和模型組大鼠隔日ip生理鹽水，連續(xù)4周。檢測(cè)大鼠尾動(dòng)脈收縮壓（SBP）和心率；觀察六味地黃丸對(duì)苯腎上腺素（PE）刺激的胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮反應(yīng)的影響和乙酰膽堿（Ach）、硝普鈉（SNP）刺激的胸主動(dòng)脈血管環(huán)舒張反應(yīng)的影響；并檢測(cè)血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠SBP升高，主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)Ach刺激的舒張反應(yīng)減弱、對(duì)PE刺激的收縮反應(yīng)增強(qiáng)（P＜0.05）；血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，六味地黃丸組大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)Ach刺激的舒張反應(yīng)增強(qiáng)，對(duì)PE刺激的收縮反應(yīng)減弱，且血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。與六味地黃丸組比較，聯(lián)用藥組大鼠SBP持續(xù)升高、對(duì)Ach刺激的舒張反應(yīng)持續(xù)減弱（P＜0.05），血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠間比較，心率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：六味地黃丸可改善糖尿病模型大鼠血管反應(yīng)性失調(diào)，這可能與其高表達(dá)血管組織中HO-1有關(guān)。

六味地黃丸；糖尿?。谎t素加氧酶1；血管功能；大鼠

糖尿病是危害人類健康的重大疾病之一，由糖尿病繼發(fā)的脂肪代謝紊亂而引起的血管病變是其造成死亡的主要原因，早期對(duì)血管進(jìn)行保護(hù)是降低心腦血管疾病發(fā)生率的主要手段[1]。我國(guó)傳統(tǒng)中藥六味地黃丸由熟地黃、山茱萸（制）、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉等藥材組成，主要用于腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟等癥的治療。研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸不僅對(duì)泌尿生殖系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)有一定調(diào)節(jié)作用，對(duì)血管損傷也有一定的保護(hù)作用[1]，但其作用的機(jī)制不甚明確。血紅素加氧酶1（HO-1）是體內(nèi)血紅素代謝的限速酶，其代謝產(chǎn)物是重要的生理性氧自由基清除劑。HO-1是機(jī)體保護(hù)性酶，正常情況下維持一定的表達(dá)量，同時(shí)也是可誘導(dǎo)酶，在一定的誘導(dǎo)因素（如藥物、環(huán)境改變等）下可誘導(dǎo)其表達(dá)量的增加[2]。本實(shí)驗(yàn)主要觀察六味地黃丸對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈功能和血管組織中HO-1表達(dá)的影響，同時(shí)給予HO-1蛋白功能特異性拮抗劑鋅原卟啉（ZnPP），探討六味地黃丸對(duì)糖尿病大鼠血管調(diào)節(jié)功能與HO-1蛋白的相關(guān)性。

1 材料

1.1 儀器

ACCU-CHEK血糖儀（美國(guó)Roche公司）；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、BioradGel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；CODA無(wú)創(chuàng)血壓儀（美國(guó)Kent公司）。

1.2 藥品與試劑

六味地黃丸（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司，批號(hào)：20150415，規(guī)格：20 g/100粒）；吲哚美辛（湖北健源化工有限公司，批號(hào)：53-86-1）；苯腎上腺素（PE，湖北巨勝科技有限公司，批號(hào)：59-42-7）；乙酰膽堿（Ach，上海滬鼎科技有限公司，批號(hào)：9000-81-1）；硝普鈉（SNP，湖北帝鑫化工有限公司，批號(hào)：13755-38-9）；鏈脲佐菌素（STZ，批號(hào)：S0130）、ZnPP（批號(hào)：282820）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為化學(xué)純。

1.3 動(dòng)物

Wistar大鼠，48只，SPF級(jí)，♀♂各半，體質(zhì)量220～260 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、六味地黃丸組和ZnPP+六味地黃丸組，每組12只。除正常組外，其余各組大鼠均ip STZ（50 mg/kg）誘導(dǎo)糖尿病模型，4 d后剪尾取血，以血糖＞16 mmol/L確定為造模成功。成模后，六味地黃丸組大鼠每天ig六味地黃丸（14 g/kg）1次，連續(xù)4周；ZnPP+六味地黃丸組大鼠每天ig六味地黃丸（14 g/kg）1次，并隔日ip ZnPP（10 μmol/kg）1次，連續(xù)4周；正常組和模型組大鼠隔日ip生理鹽水，連續(xù)4周。

2.2 血壓與心率的檢測(cè)

用大鼠無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)監(jiān)測(cè)尾動(dòng)脈收縮壓（SBP），同時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠心率以排除心率對(duì)血壓的影響。

2.3 血管環(huán)的制備

大鼠麻醉后放血處死，開(kāi)胸，取出心肺組織放入KRB緩沖液中，往液體中灌注混合氣體（95%O2+5%CO2）。仔細(xì)分離胸主動(dòng)脈，剪取胸主動(dòng)脈血管環(huán)，其中一段血管放入Trizol溶液中，另一段血管放入－80℃冰箱中用于檢測(cè)HO-1的表達(dá)，剩下的一段放入KRB緩沖液中用于血管張力的檢測(cè)[3]。

2.4 胸主動(dòng)脈血管張力的檢測(cè)

將制備好的血管環(huán)經(jīng)KRB緩沖液平衡后，加入1×10－5mol/L吲哚美辛清除環(huán)氧酶產(chǎn)物。將血管一端固定，另一端連接換能器，當(dāng)血管環(huán)在15 min內(nèi)將張力升到2 g時(shí)，每15 min換一次液，待基礎(chǔ)張力穩(wěn)定后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將血管環(huán)置于恒溫干燥箱中烘烤至質(zhì)量不再變化，記錄干質(zhì)量，用以標(biāo)化張力。各組大鼠血管環(huán)分別給予10－6mol/L PE、Ach、SNP刺激，觀察血管環(huán)對(duì)PE的收縮反應(yīng)和對(duì)Ach、SNP的舒張反應(yīng)。收縮反應(yīng)用每毫克血管環(huán)干質(zhì)量的克張力（g/mg）表示，舒張反應(yīng)結(jié)果用給血管舒張劑前、后對(duì)PE刺激后血管收縮反應(yīng)的百分比表示。

供試的馬尾松毛蟲(chóng)4～5齡幼蟲(chóng)于2015年4月上旬采集于福建省泉州臺(tái)商投資區(qū)張坂鎮(zhèn)，試蟲(chóng)采回后放入養(yǎng)蟲(chóng)籠中以新鮮馬尾松針葉飼養(yǎng)1 d后，選取健康的幼蟲(chóng)用于生物測(cè)定。

2.5 胸主動(dòng)脈血管HO-1 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法。將血管冷凍研磨后，Trizol裂解胸主動(dòng)脈，提取胸主動(dòng)脈總mRNA，在梯度PCR儀上反轉(zhuǎn)錄成cDNA，鑒定其完整性后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：HO-1上游引物序列為5′-CACTCTGGAG-ATGACACCTGAG-3′，下游引物序列為5′-GTGTTCCTCTGTCAGCATCACC-3′，250 bp；β-actin上游引物序列為5′-TCTGTGTGGATTGTGGCTCTA-3′，下游引物序列為5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′，250 bp。反應(yīng)體系：PCR Master Mix（2×）5 μl，上、下游引物各0.2 μl，cDNA 0.6 μl，DEPC水4 μl。兩步法反應(yīng)條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，39個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 胸主動(dòng)脈血管HO-1蛋白表達(dá)的檢測(cè)[2]

采用Western blot法。取胸主動(dòng)脈，將胸主動(dòng)脈液氮冷凍后在蛋白提取液中進(jìn)行研磨，低溫離心（16 873×g）15 min，取上清，制備成蛋白樣品，用二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各樣本蛋白濃度。調(diào)整各組的蛋白質(zhì)上樣量（40 μg），行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（1∶1000），4℃過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記的IgG二抗（1∶5000）孵育1 h后洗膜，加入發(fā)光液后凝膠成像。通過(guò)Image J2x軟件進(jìn)行灰度值分析，以HO-1與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示HO-1的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 六味地黃丸對(duì)大鼠尾動(dòng)脈SBP與心率的影響

表1 各組大鼠尾動(dòng)脈SBP和心率測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 1 SBP of caudal artery and heart rate of rats in each group（±s，n＝12）

表1 各組大鼠尾動(dòng)脈SBP和心率測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 1 SBP of caudal artery and heart rate of rats in each group（±s，n＝12）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與六味地黃丸組比較，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.Liuwei dihuang pills group，#P＜0.05

心率，次/min 150.24±15.32 155.65±13.56 151.21±15.68 148.16±17.91組別正常組模型組六味地黃丸組ZnPP+六味地黃丸組SBP，mm Hg 114.45±15.21 138.57±13.45＊125.42±16.72 140.27±19.32＊#

3.2 六味地黃丸對(duì)大鼠血管張力的影響

與正常組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)Ach刺激內(nèi)皮依賴性的舒張反應(yīng)減弱，而對(duì)PE刺激收縮反應(yīng)增強(qiáng)（P＜0.05）。與模型組比較，六味地黃丸組大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)PE刺激收縮反應(yīng)減弱，對(duì)Ach刺激內(nèi)皮依賴性的舒張反應(yīng)增強(qiáng)（P＜0.05）。當(dāng)給予HO-1蛋白特異拮抗劑ZnPP后，ZnPP+六味地黃丸組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)Ach刺激的舒張反應(yīng)減弱，且弱于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果提示，六味地黃丸能夠降低PE對(duì)血管的收縮反應(yīng)和增強(qiáng)Ach刺激內(nèi)皮依賴性的血管舒張反應(yīng)；使用ZnPP抑制劑后了反轉(zhuǎn)了六味地黃丸的作用。各組大鼠間比較，主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)SNP內(nèi)皮依賴性的舒張反應(yīng)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠血管張力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血管張力測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 2 The vascular tone of rats in each group（±s，n＝12）

表2 各組大鼠血管張力測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 2 The vascular tone of rats in each group（±s，n＝12）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

SNP，% 63±10 58±13 62±11 59±12組別正常組模型組六味地黃丸組ZnPP+六味地黃丸組PE，g/mg 0.81±0.12 0.92±0.13＊0.82±0.17#0.90±0.16＊Ach，% 67±11 44±9＊58±6#32±8＊#

3.3 六味地黃丸對(duì)血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達(dá)有所增強(qiáng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，六味地黃丸組和ZnPP+六味地黃丸組大鼠血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01），并顯著高于正常組（P＜0.01）。結(jié)果提示，六味地黃丸可以使大鼠血管中HO-1基因高表達(dá)。各組大鼠血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，蛋白表達(dá)電泳圖見(jiàn)圖1。

表3 各組大鼠血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 3 mRNA and protein expression of HO-1 in vascular tissue of rats in each group（±s，n＝12）

表3 各組大鼠血管組織中HO-1 mRNA及其蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 3 mRNA and protein expression of HO-1 in vascular tissue of rats in each group（±s，n＝12）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別正常組模型組六味地黃丸組ZnPP+六味地黃丸組HO-1蛋白1.25±0.24 1.32±0.27 3.82±0.62＊＊##4.01±0.71＊＊HO-1 mRNA 52.34±13.46 60.18±12.34 110.14±13.46＊＊##110.14±13.46＊＊

圖1 各組大鼠血管組織中HO-1蛋白表達(dá)電泳圖Fig 1 The protein expression electrophoregrums of HO-1 in vascular tissue of rats in each group

4 討論

高血糖可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮損傷和血管壁彈性等功能的改變，因此早期對(duì)血管內(nèi)皮進(jìn)行保護(hù)，是預(yù)防高糖引起血管功能改變繼而引起繼發(fā)性疾病的有效措施[4]。近幾年來(lái)關(guān)于HO-1與糖尿病及其并發(fā)癥的關(guān)系的研究備受關(guān)注，HO-1是細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)蛋白，是血紅素代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，其代謝產(chǎn)物有一氧化碳（CO）、膽綠素以及游離的2價(jià)鐵離子[5]，這些代謝產(chǎn)物都是重要的生物效應(yīng)分子，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[6]。HO-1/CO信號(hào)通路與血管內(nèi)皮保護(hù)功能有著密切的關(guān)系，研究表明，HO-1能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[7]，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[8]、修復(fù)內(nèi)皮損傷[9]。用維生素E或丙丁酚進(jìn)行治療的STZ大鼠腎小球上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和毛血管內(nèi)腔活性氧的含量變化與HO-1的變化相一致[10]，這提示HO-1能夠影響糖尿病引起的腎臟氧化損傷，因此促進(jìn)體內(nèi)HO-1的表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

六味地黃丸組方來(lái)至東漢張仲景所著的《金匱要略》，具有滋陰益腎的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸具有降低血糖、血脂和抗氧化等作用[11]。在本實(shí)驗(yàn)中筆者通過(guò)給予HO-1蛋白特異性抑制劑ZnPP（與HO-1蛋白特異性結(jié)合，只影響蛋白功能的發(fā)揮，不影響蛋白基因的表達(dá)）來(lái)考察六味地黃丸對(duì)血管調(diào)節(jié)作用與HO-1蛋白的關(guān)系：若給予ZnPP后能夠反轉(zhuǎn)六味地黃丸對(duì)糖尿病大鼠血管功能的作用，則說(shuō)明六味地黃丸對(duì)糖尿病大鼠血管的調(diào)節(jié)作用與HO-1蛋白有關(guān)，反之則無(wú)關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血管功能紊亂，血管張力減弱；六味地黃丸組大鼠血管功能有所改善，并同時(shí)檢測(cè)到大鼠胸主動(dòng)脈組織中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)量均升高；當(dāng)給予HO-1蛋白抑制劑ZnPP后，雖反轉(zhuǎn)了六味地黃丸對(duì)糖尿病大鼠血管功能的改善作用，但胸主動(dòng)脈組織中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)量同樣升高。以上結(jié)果提示，六味地黃丸對(duì)對(duì)糖尿病大鼠血管功能的改善作用與高表達(dá)血管組織中HO-1有一定相關(guān)性。

綜上，六味地黃丸對(duì)糖尿病大鼠血管損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與高表達(dá)血管組織中HO-1有關(guān)。雖然單純提高血管組織中HO-1的表達(dá)還達(dá)不到對(duì)高糖致血管損傷的治療作用，但是在糖尿病早期和發(fā)展過(guò)程中給予六味地黃丸能夠起到延緩血管并發(fā)癥和輔助治療糖尿病的作用。

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Effects of Liuwei Dihuang Pills on HO-1 in Vascular Tissue of Diabetic Model Rats

LYU Xiaohui1，WANG Zhe2，SUN Jiayu1，CAI Zhigang1，ZHANG Ruipeng3，SHAN Aiyun1（1.Shenzhen Futian District TCM Hospital，Guangdong Shenzhen 518033，China；2.Xiangya School of Medicine，Central South University，Changsha 410013，China；3.Shenzhen Research Institute of Tsinghua University，Guangdong Shenzhen 518067，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of Liuwei dihuang pills on heme oxygenase 1（HO-1）in vascular tissue of diabetic model rats.METHODS：Rats were randomly divided into normal group，model group，Liuwei dihuang pills group（14 g/kg，ig，s.i.d）and HO-1 inhibitor zinc protoporphyrin（ZPP，10 μmol/kg，ip，q.o.d）+Liuwei dihuang pills（14 g/kg，ig，s.i.d）group，with 12 rats in each group.Except for normal group，those groups were given streptozotocin intraperitoneally to induce diabetic model.After modeling，treatment groups were given relevant medicines，and normal group and model group were given normal saline intraperitoneally every 2 days for consecutive 4 weeks.The systolic blood pressure（SBP）of caudal artery and heart rate in rats were detected；the effects of Liuwei dihuang pills on the contraction response of thoracic aortic rings（TARs）irratated by phenylephrine（PE）were observed as well as the effects on the relaxation response of TARs irratated by acetylcholine（Ach）and sodium nitroprussiate（SNP）；mRNA and protein expression of HO-1 in vascular tissue were examined.RESULTS：Compared with normal group，SBP of model group increased，and the relaxation response of TARs to Ach irritation decreased while the contraction response of TARs to PE irritation increased（P＜0.05）.There was no statistical significance in mRNA and protein expression of HO-1 in vascular tissue（P＞0.05）.Compared with model group，the relaxation response of TARs to Ach irritation increased in Liuwei dihuang pills group，while the contruction response of TARs to PE irritation decreased；mRNA and protein expression of HO-1 increased in vascular tissue（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with Liuwei dihuang pills group，SBP of drug combination group increased continuously，while the relaxation response of TARs to Ach irritation decreased continously（P＜0.05）.There was no statistical significance in mRNA and protein expression of HO-1 in vascular tissue（P＞0.05）.There was no statistical significance in heart rate among those groups（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Liuwei dihuang pills can improve vascular reactivity disorder of diabetic model rats，which is likely related to the expression up-regulation of HO-1 in vascular tissue.

Liuwei dihuang pills；Diabetes；Heme oxygenase 1；Vascular function；Rats

R966

A

1001-0408（2016）31-4379-03

2016-02-24

2016-05-05）

（編輯：林 靜）

深圳市科技研發(fā)基金（No.JCYJ2014041414500-7216）

＊主管藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：22181265@qq.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：藥事管理。E-mail：253010652 @qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.18