曾繁強,徐永莉,江思華,張月云,趙成堅,李 力1,#(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,南寧 53001;.廣西藥用植物園,南寧 53003)
紅毛雞干燥體醇提物對血虛模型小鼠的補血作用研究Δ
曾繁強1,2*,徐永莉2,江思華2,張月云2,趙成堅2,李 力1,2#(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,南寧 530021;2.廣西藥用植物園,南寧 530023)
目的:研究紅毛雞干燥體醇提物對血虛模型小鼠的補血作用。方法:60只小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性對照組(復(fù)方阿膠漿,0.1 ml/10 g)和紅毛雞干燥體醇提物低、中、高劑量組(2.5、5.0、10.0 g/kg),每組10只。除正常組外,其余各組小鼠于實驗第2、5天sc乙酰苯肼溶液,第6~9天ip環(huán)磷酰胺溶液以復(fù)制血虛小鼠模型。從實驗第1天起,正常組、模型組小鼠ig等體積蒸餾水,各給藥組小鼠ig相應(yīng)藥物,每天1次,連續(xù)9 d。給藥結(jié)束后,采用全自動血細(xì)胞分析儀測定各組小鼠外周血中白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)含量、血細(xì)胞比容(HCT),計算小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù),采用相應(yīng)試劑盒測定小鼠紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力以及肝臟總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活力。結(jié)果:與正常組比較,模型組小鼠WBC、RBC、HGB、HCT、胸腺指數(shù),Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力,T-AOC和SOD活力均顯著降低,脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,紅毛雞干燥體醇提物各劑量組和陽性對照組小鼠WBC、RBC、HGB、HCT、胸腺指數(shù),Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力,T-AOC和SOD活力均顯著升高;紅毛雞干燥體醇提物中、高劑量組及陽性對照組小鼠脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論:紅毛雞干燥體醇提物能改善血虛模型小鼠外周血象和臟器功能,具有一定的補血作用。
紅毛雞;干燥體;醇提物;血虛模型;補血;小鼠
紅毛雞又名褐翅鴉鵑、大毛雞、毛雞等,為鵑形目杜鵑科鴉鵑屬Centropus sinensis,在我國浙江、福建、廣西、廣東、貴州南部、云南西部至南部西雙版納、海南和四川均有分布[1-2]。據(jù)《廣西中藥志》記載,紅毛雞除去內(nèi)臟的干燥體或鮮體在婦科用于調(diào)經(jīng)、補血,外用治跌打、風(fēng)濕[3]。毛雞酒以紅毛雞去除內(nèi)臟的干燥體或鮮體為主藥,配入黨參、川芎、龍骨、白芷等多味藥材浸泡而成,具有活血化瘀、調(diào)經(jīng)通乳、舒經(jīng)活絡(luò)之功效。清末民初,兩廣地區(qū)興起用紅毛雞泡制毛雞酒,用以調(diào)經(jīng)補血等。目前,有關(guān)紅毛雞的研究較少,僅在數(shù)量調(diào)查、種間關(guān)系等方面有少量研究,近年來對紅毛雞的氨基酸成分分析及指紋圖譜研究也有報道[4-5],但是有關(guān)紅毛雞補血作用方面的作用尚未見報道。在本研究中筆者探索紅毛雞干燥體醇提物對血虛模型小鼠的補血作用,以為其進一步應(yīng)用提供參考。
1.1 儀器
Sysmex-2000全自動血細(xì)胞分析儀(日本Sysmex公司);Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀(芬蘭賽默飛世爾公司);721分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);EL204電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);TGL-16B臺式高速冷凍離心機(上海安亭科技儀器廠);DW-86L628超低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)。
1.2 藥材與試劑
紅毛雞購自廣西蒙山,經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園李力研究員鑒定為鵑形目杜鵑科鴉鵑屬褐翅鴉鵑。乙酰苯肼(APH,上海紫一試劑廠,批號:ZY150623,純度:98%);注射用環(huán)磷酰胺(CTX,山西普德藥業(yè)股份有限公司,批號:04131209,規(guī)格:0.2 g);復(fù)方阿膠漿(山東東阿阿膠股份有限公司,批號:1404021,規(guī)格:20 ml);0.9%生理鹽水注射液(廣東利泰制藥股份有限公司,批號:15051434);三磷酸腺苷(ATP)酶活力測定試劑盒(批號:20151010)、考馬斯亮藍試劑盒(批號:20160126)、總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(批號:20160305)、超氧化物歧化酶(SOD)活力測定試劑盒(批號:20160217),均購自南京建成生物工程研究所。
1.3 動物
SPF級KM小鼠60只,♀,體質(zhì)量18~22 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(桂)2014-0002。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后進行實驗。
2.1 紅毛雞干燥體醇提物藥液的制備
紅毛雞宰殺后除去毛和內(nèi)臟,烘干,粉碎為粗粉。稱取紅毛雞粗粉適量,加入8倍量75%乙醇溶液,超聲(功率:100 W)2 h,每天1次,連續(xù)超聲5 d,再加入6倍量75%乙醇溶液,同上法超聲提取5 d。將提取液減壓濃縮制備成每1 ml含生藥0.25、0.50、1.00 g的低、中、高質(zhì)量濃度的紅毛雞干燥體醇提物溶液(劑量依據(jù)根據(jù)預(yù)實驗得出),置于4℃冰箱保存。
2.2 分組、造模與給藥
60只小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性對照組(復(fù)方阿膠漿,10 ml/kg)和紅毛雞干燥體醇提物低、中、高劑量組(2.5、5.0、10.0 g/kg),每組10只。除正常組外,其余各組小鼠復(fù)制血虛模型,即于實驗第2天sc APH 20 mg/kg,第5天sc APH 40 mg/kg,第6~9天ip CTX 40 mg/kg[6-8]。從實驗第1天起,正常組、模型組小鼠ig蒸餾水10 ml/kg,其他各給藥組小鼠ig相應(yīng)藥物,每天1次,連續(xù)9 d。
2.3 各組小鼠一般行為、體征與解剖觀察
實驗過程過中每天稱定小鼠體質(zhì)量以調(diào)整用藥劑量,并詳細(xì)觀察小鼠被毛、眼、耳、尾,精神狀態(tài)和活動等情況,實驗結(jié)束后解剖小鼠觀察其臟器變化。
2.4 各組小鼠外周血常規(guī)的測定
末次給藥后1.5 h,各組小鼠均于眼底靜脈叢采血,置于1.5 ml EP管(含肝素)中,采用全自動血細(xì)胞分析儀檢測外周血中白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)含量與血細(xì)胞比容(HCT)。
2.5 各組小鼠臟器指數(shù)的測定
解剖取出各組小鼠的胸腺、脾臟和肝臟,稱定質(zhì)量并計算各臟器指數(shù)。臟器(胸腺、脾臟、肝臟)指數(shù)=臟器(胸腺、脾臟、肝臟)質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。稱取結(jié)束后,將肝臟置于-80℃冰箱中冰凍保存,待用。
2.6 各組小鼠紅細(xì)胞膜ATP酶活力的測定
取“2.4”項下EP管中全血20 μl,加24倍量雙蒸水,混勻,渦旋振蕩1 min,靜置15 min,重復(fù)上述操作直至充分溶血、溶液透亮。按照ATP酶試劑盒說明書操作測定紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力。
2.7 各組小鼠肝臟T-AOC和SOD活力測定
將“2.5”項下肝臟取出、解凍,用剪刀取下肝臟相同部位肝組織約0.2 g,用0.9%生理鹽水制備成10%肝勻漿。分別按照考馬斯亮藍試劑盒、T-AOC試劑盒、SOD試劑盒說明書測定肝勻漿中的T-AOC和SOD活力。
2.8 統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示,采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
3.1 各組小鼠一般行為、體征與解剖觀察結(jié)果
實驗期間,正常組小鼠精神飽滿,行動敏捷,眼睛明亮,耳、尾呈粉紅色,被毛密而有光澤;解剖后觀察,脾臟呈暗紅色,肝臟呈鮮紅色。模型組小鼠在實驗第6天表現(xiàn)出被毛蓬松凌亂、無光澤且易脫落,耳、尾顏色蒼白,精神萎靡,嗜睡,肢體乏力,活動減少且行動緩慢;解剖后觀察,脾臟呈暗黑色,肝臟呈暗紅色。與正常組比較,模型組小鼠的胸腺明顯萎縮。其他各組小鼠的一般行為、體征與解剖觀察結(jié)果介于正常組與模型組之間,且紅毛雞干燥體醇提物中劑量組小鼠最接近正常組。
3.2 各組小鼠外周血常規(guī)測定結(jié)果
與正常組比較,模型組小鼠WBC、RBC、HGB、HCT水平均顯著降低(P<0.01);與模型組比較,紅毛雞干燥體醇提物低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠WBC、RBC、HGB、HCT均顯著升高(P<0.05或P<0.01),詳見表1。
表1 各組小鼠外周血常規(guī)測定結(jié)果(±s,n=10)Tab 1 Peripheral blood routine of mice in each group(±s,n=10)
表1 各組小鼠外周血常規(guī)測定結(jié)果(±s,n=10)Tab 1 Peripheral blood routine of mice in each group(±s,n=10)
注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01Note:vs.normal group,*P<0.01;vs.model group,#P<0.05,##P<0.01
HCT,% 49.92±3.51 36.98±1.52*39.14±2.72#42.18±2.42##40.38±2.66##41.26±2.79##組別正常組模型組紅毛雞干燥體醇提物低劑量組紅毛雞干燥體醇提物中劑量組紅毛雞干燥體醇提物高劑量組陽性對照組劑量2.5 g/kg 5.0 g/kg 10.0 g/kg 10.0 ml/kg WBC,×109L-15.70±0.74 1.72±0.19*1.97±0.31#2.51±0.35##2.32±0.41##2.41±0.47##RBC,×1012L-18.65±0.65 6.68±0.42*7.14±0.54#7.59±0.48##7.24±0.54#7.36±0.88#HGB,g/L 136.0±9.57 105.1±5.97*111.9±6.90#121.2±7.32##116.7±5.89##117.4±8.75##
3.3 各組小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果
與正常組比較,模型組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.01),脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.01);與模型組比較,紅毛雞干燥體醇提物低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05或P<0.01),紅毛雞干燥體醇提物中、高劑量組和陽性對照組脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均顯著降低(P<0.05或P<0.01),詳見表2。
3.4 各組小鼠紅細(xì)胞膜ATP酶活力測定結(jié)果
與正常組比較,模型組小鼠紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均顯著降低(P<0.01);與模型組比較,紅毛雞干燥體醇提物低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力顯著升高(P<0.05或P<0.01),詳見表3。
表2 各組小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果(±s,n=10,mg/g)Tab 2 Visceral indexes of mice in each group(±s,n=10,mg/g)
表2 各組小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果(±s,n=10,mg/g)Tab 2 Visceral indexes of mice in each group(±s,n=10,mg/g)
注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01Note:vs.normal group,*P<0.01;vs.model group,#P<0.05,##P<0.01
肝臟指數(shù)45.2±3.3 52.5±3.6*50.0±4.5 48.4±3.9#49.0±3.3#47.9±3.7#組別正常組模型組紅毛雞干燥體醇提物低劑量組紅毛雞干燥體醇提物中劑量組紅毛雞干燥體醇提物高劑量組陽性對照組劑量2.5 g/kg 5.0 g/kg 10.0 g/kg 10.0 ml/kg胸腺指數(shù)4.08±0.26 1.22±0.23*1.51±0.33#1.67±0.26##1.55±0.33#1.54±0.19##脾臟指數(shù)3.89±0.77 5.28±0.54*4.88±0.61 4.37±0.60##4.59±0.49##4.56±0.58##
表3 各組小鼠紅細(xì)胞膜ATP酶、肝臟T-AOC和SOD活力測定結(jié)果(±s,n=10)Fig 3 ATPase activity of red cell membrane,T-AOC and SOD activities of mice in each group(±s,n=10)
表3 各組小鼠紅細(xì)胞膜ATP酶、肝臟T-AOC和SOD活力測定結(jié)果(±s,n=10)Fig 3 ATPase activity of red cell membrane,T-AOC and SOD activities of mice in each group(±s,n=10)
注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01Note:vs.normal group,*P<0.01;vs.model group,#P<0.05,##P<0.01
SOD酶活力,U/(mg·prot)3.02±0.30 1.78±0.15*1.91±0.19 2.21±0.21##1.97±0.16#2.06±0.20##正常組模型組紅毛雞干燥體醇提物低劑量組紅毛雞干燥體醇提物中劑量組紅毛雞干燥體醇提物高劑量組陽性對照組2.5 g/kg 5.0 g/kg 10.0 g/kg 10.0 ml/kg 18.9±4.3 11.9±3.9*15.9±3.3#18.3±4.2##17.6±2.2##16.1±4.0#7.32±1.75 2.58±0.86*3.78±1.54#4.34±1.31##4.05±0.87##4.08±1.19##32.9±3.0 24.2±1.9*25.7±1.8 27.7±2.2##26.3±2.1#26.5±1.8#組別 劑量Na+-K+-ATP酶活力,U/ml Ca2+-Mg2+-ATP酶活力,U/ml T-AOC,U/(mg·prot)
3.5 各組小鼠肝臟T-AOC和SOD活力的測定結(jié)果
與正常組比較,模型組小鼠肝臟T-AOC和SOD活力均顯著降低(P<0.01);與模型組比較,紅毛雞干燥體醇提物低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝臟T-AOC和SOD活力顯著升高(P<0.05或P<0.01),詳見表3。
血虛證是中醫(yī)臨床常見病證之一,是血液功能紊亂、臟腑營養(yǎng)不良所致的一種病理狀態(tài),多由失血過多、脾胃虛弱、生血不足、血液瘀滯所致[9];臨床主要表現(xiàn)為面白無華、頭暈眼花、手足發(fā)麻、婦女經(jīng)血紊亂、流產(chǎn)不孕等;病理主要表現(xiàn)為外周血中WBC減少,HCT和紅細(xì)胞膜ATP酶活力降低,免疫功能下降,骨髓造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞增殖受到抑制等。由于生理上和分娩的原因,血虛證在婦女中最為常見,因此本研究選用雌性血虛小鼠模型,來評價紅毛雞干燥體醇提物的補血作用。復(fù)方阿膠漿用于氣血兩虛與貧血,已有多年使用經(jīng)驗,療效較好,故本文將其作為陽性對照藥物。
本研究聯(lián)合使用APH和CTX復(fù)制血虛小鼠模型。APH是一種具有強氧化性的化合物,對RBC具有緩慢氧化損傷作用,使RBC易于裂解出現(xiàn)溶血性貧血,致使RBC、HGB水平和ATP酶活力顯著降低,脾臟、肝臟腫大并分別呈深褐色和暗紅色[10]。CTX是一種免疫抑制劑,可損傷機體免疫器官,臨床表現(xiàn)為WBC顯著降低、胸腺和脾臟萎縮[11]。APH、CTX單用或聯(lián)用可致肝臟中T-AOC和SOD活力下降[12-13],說明血虛小鼠模型復(fù)制成功。
本實驗從小鼠一般行為體征、外周血象、臟器指數(shù)、紅細(xì)胞膜ATP酶活力和肝臟中T-AOC和SOD活力5個方面評價紅毛雞干燥體醇提物的補血作用。一般行為體征可粗略評價補血效果;外周血象可以直接反映血液盈虛狀態(tài);胸腺和脾臟都是重要的免疫器官,脾臟還具有一定的造血功能,因而通過二者質(zhì)量的變化可以間接反映機體的免疫狀態(tài)和造血功能;ATP酶是機體能量的基本來源,其中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶是紅細(xì)胞膜上重要的酶蛋白,對維持紅細(xì)胞的形態(tài)和功能有著重要作用;機體抗氧化能力的增強可能與治療血虛證機制相關(guān)[14]。從實驗結(jié)果可以看出,與模型組比較,各給藥組小鼠外周血象指標(biāo)、胸腺指數(shù)、紅細(xì)胞膜ATP酶和肝臟中TAOC、SOD活力均顯著升高,脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均顯著降低。綜合各項指標(biāo)可以得知,紅毛雞干燥體醇提物補血作用強弱依次為中劑量>高劑量>低劑量??梢?,紅毛雞干燥體醇提物的補血作用并不是劑量越大效果越好,使用合適的劑量,才能發(fā)揮最佳的功效。
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Study on Blood Enriching Effect of Centropus sinensis Dried Body Alcohol Extract on Blood-deficiency Model Mice
ZENG Fanqiang1,2,XU Yongli2,JIANG Sihua2,ZHANG Yueyun2,ZHAO Chengjian2,LI Li1,2(1.College of Pharmacy,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants,Nanning 530023,China)
OBJECTIVE:To study blood enriching effect of Centropus sinensis dried body alcohol extract on the blood-deficiency model mice.METHODS:60 mice were randomly divided into normal group,model group,positive control group(Compound E’jiaojiang,0.1 ml/10 g)and C.sinensis dried body alcohol extract low-dose,medium-dose and high-dose groups(2.5,5.0,10.0 g/kg),with 10 mice in each group.Except for normal group,other groups were hypodermically injected with APH saline solution on 2nd day and 5th day,and then intraperitoneally injected with CTX saline solution from 6th day to 9th day respectively,which was to establish the blood-deficiency model.From the 1st day,the mice in normal group and model group were intragastrically given constant volume of distilled water,and treatment groups were given relevant medicine intragastrically,once a day,for consecutive 9 days.At the end of treatment,WBC,RBC,HGB and HCT were detected by automatic hematological analysis;the thymus index,spleen index,liver index were counted;and the activities of Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase of red cell membrane and TAOC and SOD in liver were determined with kits respectively.RESULTS:Compared with normal group,WBC,RBC,HGB,HCT,thymus index,the activities of Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase,T-AOC and SOD of model group were decreased significantly,while spleen index and liver index were increased significantly(P<0.01).Compared with model group,WBC,RBC,HGB,HCT,thymus index,the activities of Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase,T-AOC and SOD of C.sinensis dried body alcohol extract groups and positive control group were increased significantly;the spleen index and liver index were decreased significantly in C.sinensis dried body alcohol extract medium-dose and high-dose groups and positive control group(P<0.05 or P<0.01).CONCLUSIONS:C.sinensis dried body alcohol extract shows a certain effect on blood enriching by improving peripheral blood routine and organic function of blood-deficiency model mice.
Centropus sinensis;Dried body;Alcohol extract;Blood-deficiency model;Blood enriching;Mice
R965.1
A
1001-0408(2016)31-4373-03
2016-03-20
2016-08-13)
(編輯:劉明偉)
廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(No.桂科重12118005-2-5);南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(No.20123238);廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點科研課題(No.重2012118)
*碩士研究生。研究方向:中藥藥理學(xué)。E-mail:zeng_fanqiang@ 126.com
#通信作者:研究員,博士。研究方向:藥用動物資源利用與保護。電話:0771-2443025。E-mail:liboshi1963@vip.163.com
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.16