黃酮哌酯對前列腺增生模型大鼠的保護作用機制研究Δ

杜麗芬，陳鏡樓（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430033）

黃酮哌酯對前列腺增生模型大鼠的保護作用機制研究Δ

杜麗芬＊，陳鏡樓#（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430033）

目的：研究黃酮哌酯對前列腺增生（BPH）模型大鼠的保護作用機制。方法：將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和黃酮哌酯高、低劑量組（80、40 mg/kg），每組8只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠通過去勢和注射丙酸睪酮復(fù)制BPH模型，丙酸睪酮注射1 h后每組大鼠ig相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)4周。末次給藥后，考察前列腺指數(shù)；采用天狼星紅和Masson染色檢測前列腺膠原沉積；免疫組化檢測前列腺Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白（FN）和上皮鈣黏著蛋白（E-cadherin）的表達；酶聯(lián)免疫吸附法檢測前列腺組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GPx）、丙二醛（MDA）、表皮生長因子（EGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的水平；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測微小RNA21（miR-21）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺膠原沉積增多，前列腺指數(shù)、FN表達、MDA含量和VEGF、EGF、miR-21、TGF-β1水平均升高（P＜0.05），E-cadherin表達、SOD和GPx活力均降低（P＜0.05）。與模型組比較，黃酮哌酯高、低劑量組大鼠前列腺膠原沉積減少，前列腺指數(shù)、FN表達、MDA含量和VEGF、EGF、miR-21、TGF-β1水平均降低（P＜0.05），E-cadherin表達、SOD和GPx活力均升高（P＜0.05）。結(jié)論：黃酮哌酯抗BPH的機制可能與下調(diào)miR-21和TGF-β1表達，抑制氧化應(yīng)激和血管生成，改善上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

黃酮哌酯；前列腺增生；氧化應(yīng)激；血管生成；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；大鼠

下尿路癥狀（Lower urinary tract symptoms，LUTS）在男性常見，其發(fā)病率正快速上升，20～80歲的男性發(fā)病率約為20%、80歲以上男性發(fā)病率約為70%，其最主要的誘因則是良性前列腺增生（Benign prostatic hyperplasia，BPH）[1]。BPH發(fā)病時前列腺局部環(huán)境的慢性炎癥易誘導(dǎo)組織發(fā)生纖維化病變，被認為是BPH導(dǎo)致LUTS形成的核心關(guān)鍵[2-3]。主流的抗BPH藥物包括α受體阻滯藥和5α-還原酶抑制劑（5α-reductase inhibitors，5α-RIs）等，但是老年患者使用α受體阻滯藥容易引發(fā)體位性低血壓，5α-RIs則會導(dǎo)致患者性欲降低和勃起功能障礙等[4]；更重要的是，α受體阻滯藥和5α-RIs長期使用存在因膠原沉積導(dǎo)致的前列腺纖維化變性的風(fēng)險[1]。黃酮哌酯是一種不同于α受體阻滯藥和5α-RIs的藥物，收錄于2015年版《中國藥典》（二部）[5]。黃酮哌酯具有抑制腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶、拮抗鈣離子以及弱的抗毒蕈堿作用，在臨床上用于緩解LUTS癥狀和抑制BPH[6-7]。本研究擬探討黃酮哌酯對BPH模型大鼠的影響和作用機制。

1 材料

1.1 儀器

BA310顯微鏡（福建省廈門市麥克奧迪事業(yè)有限公司）；ABI Stepone Plus實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；3K15離心機（德國Sigma公司，離心半徑：8.2 cm）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸黃酮哌酯片（深圳海王藥業(yè)有限公司，批號：20150301，規(guī)格：每片0.2 g）；丙酸睪酮注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：1508221，規(guī)格：1 ml∶25 mg）；天狼星紅染色劑（湖北百奧斯生物科技有限公司）；Masson染色劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；免疫組化試劑盒（丹麥Dako公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GPx）和丙二醛（MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所）；表皮生長因子（EGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測試盒（武漢博士德生物有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，♂，體質(zhì)量（200±20）g，6周齡，購于華中科技大學(xué)實驗動物中心，合格證號為SCXK（鄂）2010-0009。實驗大鼠于溫度為（22±3）℃、濕度為（50±10）%、晝夜節(jié)律（12 h光照∶12 h黑暗）的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲食。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

取大鼠手術(shù)切除雙側(cè)睪丸去勢，手術(shù)1周后，將大鼠隨機分為模型組和黃酮哌酯高、低劑量組（80、40 mg/kg），每組8只；另取8只大鼠行假手術(shù)（切開腹部后隨即縫合）作為假手術(shù)組。模型組和給藥組大鼠每天ih 10 mg/kg的丙酸睪酮（溶于橄欖油）誘導(dǎo)BPH模型，假手術(shù)組大鼠ih等體積的橄欖油[8]。每日注射1 h后，給藥組大鼠分別ig相應(yīng)劑量的黃酮哌酯[其中高劑量是按照黃酮哌酯臨床常用口服日劑量（0.8 g/70 kg）通過體表面積換算法換算而得]，模型組和正常組大鼠ig等體積的生理鹽水，均連續(xù)給藥4周。

2.2 前列腺指數(shù)的檢測

給藥4周后，處死大鼠，分離前列腺組織，稱質(zhì)量后計算前列腺指數(shù)：前列腺指數(shù)＝前列腺質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）。

2.3 前列腺病理學(xué)觀察

取部分前列腺，石蠟包埋、組織切片，通過天狼星紅和Masson染色后鏡下觀察前列腺組織膠原沉積情況。

2.4 免疫組化檢測

取部分前列腺組織，通過免疫組化法檢測前列腺Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）和上皮鈣黏著蛋白（E-cadherin）表達。

2.5 前列腺氧化應(yīng)激、血管生成水平檢測

前列腺氧化應(yīng)激水平通過檢測組織中抗氧化酶SOD和GPx的活力，以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的水平來評價。前列腺血管生成情況通過ELISA法檢測組織中EGF和VEGF水平來評價。取各組大鼠前列腺組織用冰冷的生理鹽水制備成10%的組織勻漿，然后根據(jù)各測試盒說明書操作步驟檢測相應(yīng)指標。

2.6 前列腺微小RNA（miR）-21和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1水平檢測

取新鮮前列腺組織提取總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。20 μl的逆轉(zhuǎn)錄體系包括1 μg的總RNA、12.5 μl的混合引物、0.5 μl的RNA酶抑制劑、2 μl的dNTPs和1 μl的逆轉(zhuǎn)錄酶，雙蒸水定容；逆轉(zhuǎn)錄參數(shù)為35℃×10 min、42℃×60 min和70℃×10 min。隨后20 μl的qPCR反應(yīng)體系包括5 μl的cDNA、10 μl的qPCR混合液、0.4 μl的上游引物和下游引物，雙蒸水定容；反應(yīng)參數(shù)為95℃反應(yīng)10 min后進行40個循環(huán)，循環(huán)條件為95℃×10 s，60℃×20 s和72℃×20 s。相對表達量通過2－ΔΔct

法（ct為目標擴增產(chǎn)物達到設(shè)定閾值所需的循環(huán)數(shù)）計算，以假手術(shù)組表達水平歸一。各引物由Primer 5.0軟件設(shè)計，其中miR-21（92 bp）的上游引物為5′-GGGGCCTAGCTTATCAGA-CTGA-3′、下游引物為5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′、逆轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-TTCGCACTGGATACGACTCAACA-3′，內(nèi)參為U6（85 bp）；TGF-β1（219 bp）上游引物為5′-TATAGCAACAATTCCTGGCGTTACCT-3′、下游引物為5′-GTCACCTCGACGTTTGGGA-CTGA-3′，內(nèi)參為磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，201 bp）。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 前列腺指數(shù)變化

與假手術(shù)組[（1.00±0.14）mg/g]比較，模型組大鼠前列腺指數(shù)[（1.96±0.21）mg/g]明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，黃酮哌酯高、低劑量組大鼠前列腺指數(shù)[（1.31±0.11）、（1.55± 0.14）mg/g]明顯降低（P＜0.05）。

3.2 前列腺組織膠原沉積情況

前列腺組織膠原沉積情況通過天狼星紅和Masson染色，以及免疫組化檢測組織Ⅰ型膠原表達來綜合評價。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺組織膠原沉積增多，Ⅰ型膠原表達增強。與模型組比較，黃酮哌酯低、高劑量組大鼠前列腺組織膠原沉積減少，Ⅰ型膠原表達減弱。這表明黃酮哌酯有效地減輕了前列腺組織的膠原沉積和Ⅰ型膠原的表達。各組大鼠前列腺切片的天狼星紅、Masson染色圖見圖1，Ⅰ型膠原表達的免疫組化圖見圖2。

圖1 各組大鼠前列腺切片的天狼星紅、Masson染色圖（× 400）Fig 1 Sirius red and masson staining of prostatic sections of rats in each group（×400）

圖2 各組大鼠前列腺中Ⅰ型膠原、FN和E-cadherin表達的免疫組化圖（×400）Fig 2 Immunohistochemistry plot for typeⅠcollagen，F(xiàn)N and E-cadherin in prostate of rats in each group（× 400）

3.3 前列腺中E-cadherin和FN表達情況

大鼠前列腺上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）通過免疫組化檢測EMT特征性事件上皮標記物E-cadherin的缺失情況和間質(zhì)標記物FN的過表達現(xiàn)象來評價。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺中E-cadherin表達明顯缺失，F(xiàn)N呈現(xiàn)過表達。與模型組比較，黃酮哌酯低、高劑量組大鼠前列腺中E-cadherin表達明顯增加，F(xiàn)N的過表達被抑制。各組大鼠前列腺中E-cadherin和FN表達的免疫組化圖見圖2。

3.4 前列腺氧化應(yīng)激和血管生成情況

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺組織中的SOD和GPx活力均明顯降低，MDA含量和VEGF、EGF水平均升高（P＜0.05）。與模型組比較，黃酮哌酯低、高劑量組大鼠前列腺組織中的SOD和GPx活力均升高，MDA含量和VEGF、EGF水平均降低（P＜0.05）。各組大鼠前列腺中SOD、GPx、MDA、VEGF、EGF水平的檢測結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠前列腺中SOD、GPx、MDA、VEGF、EGF水平的檢測結(jié)果（±s，n＝8）Tab 1 The levels of SOD，GPx，MDA，VEGF，EGF in prostate of rats in each group（±s，n＝8）

表1 各組大鼠前列腺中SOD、GPx、MDA、VEGF、EGF水平的檢測結(jié)果（±s，n＝8）Tab 1 The levels of SOD，GPx，MDA，VEGF，EGF in prostate of rats in each group（±s，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.sham operation group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

EGF，pg/ml組別SOD，U/mg GPx，U/mg MDA，nmol/mg VEGF，pg/ml 66.68±8.00 190.89±10.25＊124.88±10.20#98.49±10.84#假手術(shù)組模型組黃酮哌酯低劑量組黃酮哌酯高劑量組79.41±7.08 31.94±7.71＊42.76±6.04#60.25±7.28#104.44±17.35 37.40±6.43＊59.05±8.25#70.38±9.30#7.01±1.20 17.14±1.48＊15.00±1.14#12.35±1.22#35.21±4.84 84.32±9.77＊67.60±5.91#56.36±6.24#

3.5 前列腺中miR-21和TGF-β1水平變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺組織中miR-21和TGF-β1水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，黃酮哌酯低、高劑量組大鼠前列腺組織中miR-21和TGF-β1水平降低（P＜0.05）。各組大鼠前列腺中miRNA-21和TGF-β1水平的檢測結(jié)果見表2。

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.sham operation group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

4 討論

BPH是一種常見的男性疾病，發(fā)病率隨年齡遞增而升高。黃酮哌酯是一種不同于5α-RIs和α受體阻滯藥的治療藥物，隨機對照臨床研究顯示連續(xù)4周的黃酮哌酯治療BPH的有效率為82.1%，且其在改善前列腺癥狀方面的效果與α受體阻滯藥特拉唑嗪差異無統(tǒng)計學(xué)意義[7]。

近年來研究顯示，前列腺疾病與多種生長因子的異常表達有關(guān)，包括VEGF和EGF等，其同為BPH時促進前列腺間質(zhì)和上皮細胞增生的關(guān)鍵因子[9]。其中VEGF是最強力的促血管生成因子之一，BPH作為一種實體瘤已經(jīng)證實其生長與轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的產(chǎn)生，VEGF在BPH中的表達明顯比在正常前列腺細胞中的表達高；而EGF作為一種前列腺上皮細胞有絲分裂的促進調(diào)節(jié)子，在體內(nèi)和體外試驗中均被證實能夠有力地促進VEGF的表達[8]。另一方面，BPH患者常帶有氧化應(yīng)激特征，其體內(nèi)抗氧化酶SOD等的活力被抑制而MDA含量顯著增加，使氧化-抗氧化平衡態(tài)被打破[10]。EMT是一種上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，是纖維化進程的核心關(guān)鍵之一，以上皮標記物E-cadherin等的表達缺失和間質(zhì)標記物FN等的表達增多為特征[11]。有證據(jù)表明，BPH的發(fā)生受到前列腺細胞外基質(zhì)沉積和EMT的共同調(diào)控，膠原蛋白和FN等的表達量與BPH密切相關(guān)[12]。當機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，將促進EMT的發(fā)生[13]。miR作為表觀遺傳調(diào)控的重要組成部分通常由21～24個核苷酸組成，是一種短鏈非編碼單鏈RNA，參與細胞發(fā)育、增生、凋亡等生理過程。其中miR-21具有參與TGF-β1介導(dǎo)EMT調(diào)控過程的功能。當TGF-β1表達增強時，miR-21將顯著活躍并明顯促進EMT發(fā)生[14]。

綜上所述，本文通過檢測前列腺組織氧化應(yīng)激水平指標SOD、GPx和MDA，血管生成調(diào)節(jié)因子EGF和VEGF，EMT標記物E-cadherin和FN，以及miR-21和TGF-β1的水平，探索黃酮哌酯可能的藥理作用機制。研究結(jié)果表明，黃酮哌酯能夠有效改善丙酸睪酮誘導(dǎo)的大鼠BPH，其作用機制與調(diào)控miR-21和TGF-β1表達，抑制氧化應(yīng)激和血管生成，改善EMT有關(guān)。該生理活性很有可能是黃酮哌酯改善BPH患者LUTS癥狀的機制之一，更具體、確切的作用機制探討將在下一步的研究中深入展開。

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Study on the Protective Mechanism of Flavoxate on Prostatic Hyperplasia in Model Rats

DU Lifen，CHEN Jinglou（Dept.of Pharmacy，Puai Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430033，China）

OBJECTIVE：To study the protective mechanism of flavoxate on prostatic hyperplasia in model rats.METHODS：The rats were randomly divided into sham operation group，model group and flavoxate high-dose and low-dose groups（80，40 mg/kg），with 8 rats in each group.Except for sham operation group，those groups were emasculated and given sterandryl to induce BPH model.They were given relevant medicine intragastrically 1 h after administration of sterandryl，once a day，for consecutive 4 weeks.Sirius red and Masson staining were used to detect the precipitation of collagen in prostate；immunohistochemistry was used to detect the expressions of prostatic typeⅠcollagen，F(xiàn)N and E-cadherin；ELISA assay was used to determine the levels of SOD，GPx，MDA，EGF and VEGF in prostate.qPCR assay was used to detect the levels of miR-21 and TGF-β1.RESULTS：Compared with the sham operation group，the prostatic collagen was accumulated；prostatic index，the expression of FN，MDA content and levels of VEGF，EGF，miR-21 and TGF-β1were increased（P＜0.05）；the expression of E-cadherin，and the activity of SOD and GPx were decreased（P＜0.05）.Compared with model group，the precipitation of prostatic collagen was decreased；prostatic index，the expression of FN，MDA content，the levels of VEGF，EGF，miR-21 and TGF-β1were decreased in flavoxate high-dose and low-dose groups（P＜0.05）；while the expression of E-cadherin and the activity of SOD and GPx were increased（P＜0.05）. CONCLUSIONS：Flavoxate can inhibit BPH，the mechanism of which may associated with down-regulating the expressions of miR-21 and TGF-β1，inhibiting oxidative stress and angiogenesis and improving epithelial-mesenchymal transition.

Flavoxate；Benign prostatic hyperplasia；Oxidative stress；Angiogenesis；Epithelial-mesenchymal transition；Rats

R965

A

1001-0408（2016）31-4357-03

2016-01-29

2016-04-25）

（編輯：鄒麗娟）

湖北省自然科學(xué)基金資助項目（No.2015CFB250）；武漢市中青年醫(yī)學(xué)骨干人才培養(yǎng)工程（武衛(wèi)生計生通〔2015〕9號）

＊主管藥師，碩士。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：027-68831324。E-mail：shanghuchuan@126.com

#通信作者：主管藥師，博士。研究方向：黃酮在泌尿生殖系統(tǒng)中的作用研究。電話：027-68831991。E-mail：jinglouchen@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.11