CDK5的表達與腦損傷時間推斷的相關性研究進展

馬詩雨，李如波，羅宇家，呂孟妍，王漢志，王正?。?中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院法醫(yī)病理學研究室，遼寧沈陽000；2.中國醫(yī)科大學臨床醫(yī)學專業(yè)，遼寧沈陽000）

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CDK5的表達與腦損傷時間推斷的相關性研究進展

馬詩雨1，2，李如波1，羅宇家1，2，呂孟妍1，2，王漢志1，王正印1
（1.中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院法醫(yī)病理學研究室，遼寧沈陽110001；2.中國醫(yī)科大學臨床醫(yī)學專業(yè)，遼寧沈陽110001）

摘要：細胞周期蛋白依賴激酶5（cyclin-dependent kinase 5，CDK5）是CDK家族中一類不直接調(diào)控細胞周期的蛋白。CDK5通過靶蛋白的磷酸化在神經(jīng)細胞的發(fā)育、修復及退行性變等方面發(fā)揮著不可替代的作用。腦損傷是指暴力作用于頭部造成的腦組織器質(zhì)性損傷，由于損傷發(fā)生后機體啟動應激及修復機制，腦組織中變化的多種蛋白及酶類物質(zhì)可作為損傷時間判定的指標。本文就CDK5的分布、活性機制、生理作用及其腦損傷研究與其作為腦損傷標志物可能性的研究進展進行綜述。

關鍵詞：法醫(yī)病理學；腦損傷；綜述[文獻類型]；細胞周期蛋白依賴激酶5；損傷時間

近年來，隨著分子生物學、免疫組織化學的快速發(fā)展，細胞周期素依賴蛋白激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的生物學特性研究逐漸被重視，但主要集中在與細胞周期調(diào)控相關的CDK1、CDK2等，對于不直接涉及細胞周期調(diào)控的CDK5及其抑制劑的研究相對匱乏，這些激酶在細胞周期中的作用機制尚未得到完全清晰的解讀[1]。在法醫(yī)病理學領域，腦損傷是一種常見的病理損傷，推斷其發(fā)生時間需要的標志物多為腦中可檢出的活性蛋白、mRNA等。CDK5在哺乳動物大腦中高表達，因此有希望成為法醫(yī)病理學研究中作為損傷時間推斷的標志物，故有必要研究其生理、生化及調(diào)節(jié)作用。

1 CDK5的分布及作用機制

1.1 CDK5的分布

CDK5是一類不能直接調(diào)控細胞周期，但可以參與分裂后神經(jīng)元的靶蛋白磷酸化，以此對神經(jīng)元的遷移、突起的生長和軸突模式進行調(diào)節(jié)的激酶[2]。CDK5最初被認為存在于分裂后、失去增殖能力且CDK家族常常不表達或無活性的神經(jīng)元中，后發(fā)現(xiàn)幾乎整個中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元都能檢測到CDK5轉(zhuǎn)錄體的存在[3]。近來多種實驗表明，哺乳動物腦組織中含有大量CDK5活性物質(zhì)，可能參與小神經(jīng)膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞等許多細胞的分化過程[4]，并在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)外（腎、睪丸、卵巢、空腸、回腸和十二指腸）也有中等程度的表達[5]。

1.2 CDK5的產(chǎn)生與激活

單體形式存在的CDK5無激酶活性，需要通過磷酸化特定位點（thr14、thr15、Alb、Ser159等）與其特異性激活因子p35、p39及p35、p39含碳末端的蛋白水解產(chǎn)物p25和p29等結合，錨定在膜上并磷酸化膜性底物，參與平衡促存活和促凋亡信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)，以此發(fā)揮生物學活性[6]。

1.3 CDK5的生理作用

CDK5雖然不直接調(diào)控細胞周期，但其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、退化過程中的作用是復雜多樣的，CDK5在機體各系統(tǒng)發(fā)揮著不同生理作用。CDK5在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育形成的整個過程（如神經(jīng)元的遷移和分化）中的作用是最早被發(fā)現(xiàn)的，特別是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞骨架形成中起重要作用。CDK5缺失會導致腦皮質(zhì)層狀細胞性結構缺陷，剔除CDK5或p35-/p39-的小鼠近60%會死亡，而這種現(xiàn)象可以被植入p35啟動子下游的CDK5基因轉(zhuǎn)染所逆轉(zhuǎn)[7]，提示活性CDK5在正常神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中有不可替代的作用。彭芳芳等[8]研究表明，在鼠E12~P14神經(jīng)組織發(fā)育、神經(jīng)元大量重構、形成神經(jīng)網(wǎng)絡過程中，CDK5蛋白及p35持續(xù)高表達，CDK5激酶活性顯現(xiàn)，可能通過磷酸化細胞骨架的方式引導神經(jīng)元形態(tài)學改變，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。

2 CDK5在腦損傷時間推斷中的應用

多種實驗表明，CDK5在腦組織及神經(jīng)系統(tǒng)損傷后存在著表達異常，提示其發(fā)揮多樣的生物學作用。了解CDK5的作用機制有助于從生物學層面驗證其作為腦損傷推斷標志物的合理性。

2.1基于CDK5的腦損傷研究

2.1.1急性CO中毒性遲發(fā)型腦病

研究[9]表明，急性一氧化碳（CO）中毒引發(fā)的遲發(fā)型腦病發(fā)病過程中，CDK5、p25、p35的表達均有明顯增高。該研究以morris水迷宮實驗篩選出認知功能正常的大鼠，并通過腹腔追加CO、行為學觀察、HbCO動態(tài)監(jiān)測等方式建立遲發(fā)型腦病大鼠模型。結果發(fā)現(xiàn)，在中毒后1周左右，CDK5的異常激活達到高峰。推測CDK5引發(fā)遲發(fā)型腦病的可能機制為急性CO中毒引發(fā)的缺氧性毒性刺激使p35自身表達上調(diào)，同時一部分裂解為能完全激活CDK5的p25。由于缺乏膜錨定信號，p25-CDK5復合物在細胞內(nèi)的定位改變，造成底物磷酸化失調(diào)，進一步引發(fā)神經(jīng)元病理性損害。2.1.2神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病

神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特定神經(jīng)元的損傷丟失為特征的一組慢性進展性疾病，近期研究[10]表明，此類神經(jīng)元損傷中存在CDK5的異常聚集。CDK5誘導神經(jīng)元凋亡主要通過細胞質(zhì)途徑導致細胞骨架崩解和細胞核途徑干擾促存活基因兩種不同方式[11]，CDK5酶活性異常引發(fā)的tau蛋白異常磷酸化使糖原合成酶激酶3β對tau蛋白的磷酸化易化，從而影響軸漿轉(zhuǎn)運過程，促進了神經(jīng)退行性病變的發(fā)生過程[10]。有研究[12-13]表明，CDK5在軸突導向和靶向性選擇方面起重要作用，p35突變會導致某些神經(jīng)軸突的成簇化和導向生長，CDK5缺陷時運動神經(jīng)元還會出現(xiàn)染色質(zhì)融解、細胞氣球樣變、核偏位伴隨神經(jīng)絲堆積等一系列軸漿運輸障礙現(xiàn)象。

2.1.3放射性損傷

在韓永清等[14]模擬大鼠放射性腦損傷模型的實驗中，給予培養(yǎng)至12d的海馬神經(jīng)元30 Gy X射線的單次照射，用Western印跡法檢測CDK5的激活蛋白p35、p25的水平，并用DAPI染核方法檢測海馬神經(jīng)元凋亡情況，進一步證實CDK5在腦損傷后存在表達的異常增加。DAPI顯示，30 Gy組在照射后24h核固縮百分比為（24.83±3.97）%，其對照組為（1.82±1.08）%；30 Gy+CDK5抑制劑組在照射后24 h核固縮百分比為（7.74±2.27）%；p35蛋白水平在照射后3.5 h和4 h分別比對照組升高（1.51±0.13）、（1.45±0.14）倍，p25蛋白水平在照射后6h比對照組升高（1.62±0.28）倍，各組結果差異均有統(tǒng)計學意義。由此實驗可得，X線照射培養(yǎng)海馬神經(jīng)元后造成腦組織放射性損傷，p35、p25蛋白表達在一定時間內(nèi)隨損傷時間呈增加趨勢，且應用CDK5抑制劑抑制CDK5活性可以減少神經(jīng)元的凋亡。

2.2 CDK5隨損傷時間變化的評估

李偉等[15]在三叉神經(jīng)痛大鼠模型中，已證實CDK5/p35對神經(jīng)系統(tǒng)疼痛信號傳遞調(diào)節(jié)的作用，采用Western印跡、CDK5活性分析等方法檢驗了Vc組織中CDK5及p35的活性時限（三叉神經(jīng)眶下支慢性壓迫性損傷第14天，CDK5活性為第1天的6倍）。上述研究提示，CDK5蛋白在腦損傷后周邊區(qū)隨時間延長表達增多，但具體變化方式尚未明確證實，因此CDK5作為標志物參與腦損傷時間推斷具有一定的先進性。

大量研究總結出許多腦損傷時間推斷標志物在腦挫傷后的分布有其規(guī)律性與特異性，如缺氧誘導因子-1α蛋白、神經(jīng)病靶酯酶與誘導型環(huán)氧合酶、Homer蛋白、載脂蛋白E mRNA、caspase-3在腦挫傷后的表達時限多為單峰[16-19]，腫瘤壞死因子α則為雙峰[20]。故而證實，CDK5在腦損傷后表達的變化曲線對其作為標志物應用有較高的可行意義。

3展　望

腦損傷可參考檢驗的指標眾多，實際工作中需要參考實際案例，根據(jù)鑒定需求、標本組織部位、峰值出現(xiàn)的時間等指標，選擇合適的蛋白或mRNA，采取合適的方式進行分析推斷。CDK5正常情況下通過調(diào)節(jié)底物磷酸化水平調(diào)控神經(jīng)發(fā)育、促進軸突生長，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過程中都有著積極的作用，因此推測其在腦損傷后也必然會有因損傷修復機制啟動造成的表達異常。

為探討大鼠局灶性腦挫傷后腦中p35和p25表達變化的時間規(guī)律性，王漢志等[21]進行了大鼠局灶性腦挫傷后p35及p25的表達變化試驗。以手術方式建立大鼠局灶性腦挫傷模型，通過HE、免疫組織化學染色及Western印跡法等方法進行損傷不同時間后損傷周邊區(qū)腦組織p35及p25的蛋白表達檢測。結果發(fā)現(xiàn)，在局部腦挫傷后，p35蛋白隨挫傷時間的延長表達降低，于12h達到低峰，隨后表達增加，于5d基本恢復正常表達量，呈現(xiàn)單峰變化。而p25作為p35的蛋白降解產(chǎn)物，是一種較p35更為穩(wěn)定、具有更強激活CDK5能力的特異性激活因子，隨挫傷時間延長呈現(xiàn)雙峰變化：挫傷后6 h出現(xiàn)第一個高峰，隨后降低至24 h達到低峰，5 d后出現(xiàn)第二次高峰，隨后逐漸降低恢復正常。p35與p25是CDK5的特異激活劑，這兩種蛋白表達呈現(xiàn)不同的規(guī)律性且有較好的時間相關性，為利用CDK5進行腦挫傷時間推斷提供了有利的論據(jù)。

綜上，CDK5有望成為腦損傷時間推斷的檢測指標，為法醫(yī)病理學鑒定提供一條新的思路。

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（本文編輯：張建華）

·經(jīng)驗交流·

Progress on Correlation between the Expression of CDK5 and Brain Injury Time

MA Shi-yu1,2, LI Ru-bo1, LUO Yu-jia2, Lü Meng-yan2, WANG Han-zhi1, WANG Zheng-yin1
（1. Department of Forensic Pathology, School of Forensic Medicine, China Medical University, Shenyang 110001, China; 2. Specialty of Clinical Medicine, China Medical University, Shenyang 110001, China）

Abstract：Cyclin-dependent kinase 5（CDK5）is a member of cyclin-dependent kinase family, which does not directly regulate cell cycle. Through phosphorylation of target protein, CDK5 plays an irreplaceable role in the development, reparation and degeneration of neurons. Brain injury refers to the organic injury of brain tissue caused by external force hit on the head. Owing to the stress and repair system activated by our body itself after injury, various proteins and enzymes of the brain tissues are changed quantitatively, which can be used as indicators for estimating the time of injury. This review summarizes the progress on the distribution, the activity mechanism and the physiological effects of CDK5 after brain injury and its corresponding potential served as a marker for brain injury determination.

Key words：forensic pathology; brain injuries; review [publication type]; cyclin-dependent kinase 5; injury time

收稿日期：（2014-08-20）

通信作者：李如波，男，博士，教授，主要從事法醫(yī)病理學教學、研究及鑒定；E-mail：rbli@mail.cmu.edu.cn

作者簡介：馬詩雨（1993—），女，碩士研究生，主要從事臨床醫(yī)學、法醫(yī)病理學研究；E-mail：magic23@yeah.net

基金項目：遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2013317）；遼寧省自然科學基金項目（2014021027）

文章編號：1004-5619（2016）01-0058-03

中圖分類號：DF795.1

文獻標志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.01.013