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    液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅曲黃色素的條件優(yōu)化

    2016-12-14 02:25:46李瑞杰謝玉梅何思琴王磊陳莎高夢祥李利
    中國釀造 2016年11期
    關(guān)鍵詞:色價曲菌紅曲

    李瑞杰,謝玉梅,何思琴,王磊,陳莎,高夢祥,李利*

    (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州430025)

    液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅曲黃色素的條件優(yōu)化

    李瑞杰,謝玉梅,何思琴,王磊,陳莎,高夢祥,李利*

    (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州430025)

    以紅色紅曲菌(Monascus ruber)M-7為實驗菌株,以色價和色調(diào)為評價指標(biāo),對液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅色紅曲黃色素的條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,培養(yǎng)基pH值為3~4時,紅色紅曲菌M-7能合成大量的水溶性紅曲黃色素,發(fā)酵液呈鮮艷的黃色色調(diào);培養(yǎng)基最優(yōu)碳源為2%蔗糖,最優(yōu)氮源為0.2%硫酸銨;水溶性紅色紅曲黃色素的色價和色調(diào)值隨著培養(yǎng)時間的延長先升后降,在第8天時達(dá)到最高,色價為5.56 U/mL,OD400nm/OD510nm為10.29,OD400nm/OD470nm為3.93。

    紅色紅曲菌;水溶性紅曲黃色素;液態(tài)發(fā)酵

    隨著人們健康意識的提高,天然食用色素越來越受到國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。紅曲色素(Monascuspigments)是我國近年來增長速度最快的天然食用色素,是紅色紅曲菌(Monascus ruber)發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,包括黃色、橙色和紅色三類色素組分,在我國及東南亞地區(qū)已有超過1000年的應(yīng)用歷史,目前在歐美等國家的肉制品(如火腿腸)中也得到了很好的應(yīng)用[1-2]。

    黃色素是重要的食用色素,約占市場需求量的60%以上[3]。目前,市售的食用黃色素產(chǎn)品以植物提取為主(如姜黃素、梔子黃等[4]),因而易受季節(jié)、氣候、產(chǎn)地等因素的影響。相比之下,采用微生物發(fā)酵法進(jìn)行天然食用色素的生產(chǎn),不受季節(jié)限制、原料轉(zhuǎn)化率高、成本低,是目前世界食品色素添加劑的發(fā)展趨勢。目前,市場上應(yīng)用廣泛的紅曲色素以紅色素為主,而紅曲黃色素的生產(chǎn)起步較晚,目前生產(chǎn)廠家也很少,產(chǎn)品并未大規(guī)模上市,而且存在色價和色調(diào)都不高等問題[3],因此,紅曲黃色素的開發(fā)研究具有廣闊的前景,可產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益。

    有研究表明,紅曲菌所產(chǎn)生的紅曲色素包括醇溶性組分和水溶性組分[1]。目前的紅曲色素產(chǎn)品一般以醇溶性組分為主,水溶性較差,應(yīng)用范圍主要限制于油性食品(如火腿腸、香腸等)中。近年來,通過菌種的選育和發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化來獲得高色價和色調(diào)值的紅曲黃色素已取得一定成果[5-12],但也均以生產(chǎn)醇溶性紅曲黃色素為主。為豐富紅曲黃色素產(chǎn)品的種類,促進(jìn)其在飲料等非油性食品中的應(yīng)用,本研究以紅曲色素高產(chǎn)菌株—紅色紅曲菌M-7為實驗材料,通過液體發(fā)酵法研究了水溶性紅曲黃色素的生產(chǎn)條件,以探索一種安全、高效、低成本的水溶性紅曲黃色素的生產(chǎn)方法,為其工業(yè)規(guī)?;a(chǎn)提供基礎(chǔ)和參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株

    紅色紅曲菌(Monascus ruber)M-7:由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳福生教授惠贈,該菌株為紅曲色素高產(chǎn)菌株。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    紅曲菌孢子培養(yǎng)基(查氏酵母瓊脂(Czapek yeast exatract agar,CYA)):NaNO33 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g,蔗糖30 g,酵母膏5 g,蒸餾水1 L,瓊脂20 g,pH 5.5。

    液態(tài)發(fā)酵種子制備培養(yǎng)基:在1 L蒸餾水中加入去皮馬鈴薯200 g,煮沸30 min,用4層紗布過濾,濾液中加葡萄糖20 g,定容至1 L。

    水溶性紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[13]:谷氨酸鈉5.04 g,KCl 0.5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 1 g,ZnSO4·7H2O 0.01 g,MnSO4·H2O 0.003 g,葡萄糖20 g,0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 3、4、5、6、7或8)0.5 L,蒸餾水0.5 L。

    以上培養(yǎng)基滅菌條件為:121℃,20 min。其中水溶性紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖單獨(dú)滅菌,滅菌條件為115℃,15 min。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TE124S電子分析天平、PB-10 pH計:德國賽多利斯公司;Mini Spin Plus離心機(jī):德國Eppendorf公司;HVE-50高溫滅菌鍋:日本Hirayama公司;U-1900雙光束紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱:上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;疊加式IS-RDS3搖床:美國Crystal公司;GZX-6000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵

    (1)孢子懸浮液的制備:將保存在4℃的菌種接種到CYA斜面上,28℃培養(yǎng)10 d,加入5 mL無菌水洗下孢子,用雙層擦鏡紙過濾除去菌絲,玻璃珠將孢子振蕩打散,血球計數(shù)板計數(shù)。

    (2)種子的培養(yǎng):250 mL三角瓶中裝液態(tài)發(fā)酵種子制備培養(yǎng)基50 mL,接種孢子懸浮液,使孢子的終濃度為103個/mL,28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)40~44 h,作為種子液。

    (3)液態(tài)發(fā)酵:250 mL三角瓶裝水溶性紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL,接入上述種子液10 mL,28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)2~9 d。

    1.3.2 生物量的測定

    采取干質(zhì)量法,即發(fā)酵完成后,發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾得到菌絲體,用3倍體積的蒸餾水洗滌菌絲體,于60℃中干燥至質(zhì)量恒定,稱質(zhì)量。

    1.3.3 色價的測定

    發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾得到濾液,12 000 r/min離心3 min,稀釋一定倍數(shù),于200~600 nm進(jìn)行全波段掃描,分別取波長400 nm、470 nm和510 nm處吸光度值計算黃色素、橙色素和紅色素的色價。色價計算公式:

    1.3.4 色調(diào)的測定

    本實驗色調(diào)定義為黃色素/紅色素=OD400nm/OD510nm;黃色素/橙色素=OD400nm/OD470nm。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pH對紅色紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    據(jù)報道,pH對紅曲色素的產(chǎn)生有一定影響[13-15]。一般認(rèn)為,酸性條件下主要產(chǎn)物為紅曲黃色素和紅曲橙色素;中性或堿性條件下主要產(chǎn)物為紅曲紅色素。為了實現(xiàn)紅曲黃色素的生產(chǎn),首先利用檸檬酸-磷酸鹽緩沖液制備不同pH的發(fā)酵培養(yǎng)基,研究pH對紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素的影響,結(jié)果見圖1。

    圖1 pH對水溶性紅曲黃色素色調(diào)的影響Fig.1 Effect of pH on color tone of water soluble yellow Monascuspigment

    由圖1可知,發(fā)酵培養(yǎng)基的pH對色素的種類影響很大,在pH3和pH4時,紅曲菌M-7產(chǎn)生較多的水溶性黃色素,發(fā)酵液呈鮮艷的黃色色調(diào),OD400nm/OD510nm分別為4.50和3.76,OD400nm/OD470nm分別為2.48和2.40,黃色素的色價分別為1.04U/mL和0.95U/mL;而當(dāng)pH為5、6、7和8時,紅曲菌M-7產(chǎn)生較多的水溶性紅色素,發(fā)酵液呈明顯的紅色色調(diào),OD400nm/OD510nm依次為1.66、1.07、0.69和0.68,OD400nm/OD470nm依次為1.44、1.00、0.74和0.73。該結(jié)果中pH對紅曲色素影響的規(guī)律與文獻(xiàn)報道基本一致[13-15]。因此,將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值控制在3~4,可實現(xiàn)水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵生產(chǎn)。在后續(xù)實驗中,均將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值控制在3~4。

    2.2 碳源種類對紅色紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    分別以2%的可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、蔗糖、馬鈴薯淀粉、葡萄糖為碳源,0.5%谷氨酸鈉為氮源,初始pH值為3.0,發(fā)酵2 d后,考察碳源種類對發(fā)酵液中水溶性紅曲黃色素色價和色調(diào)的影響,結(jié)果見圖2。

    由圖2A可知,以可溶性淀粉、蔗糖和馬鈴薯淀粉為碳源時水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)量較高,色價均>80U/g菌體干質(zhì)量;由圖2B可知,蔗糖為碳源時的色調(diào)值最高,OD400nm/OD510nm、OD400nm/OD470nm分別是4.75、2.35,表明此時產(chǎn)生的水溶性紅曲黃色素所占比例最大,純度較高。因此,確定蔗糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

    圖2 碳源種類對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.2 Effect of carbon sources on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

    2.3 碳源含量對紅色紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    圖3 葡萄糖含量對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.3 Effect of glucose concentration on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

    分別以1%、2%、3%、4%、5%的蔗糖為碳源,0.5%的谷氨酸鈉為氮源,初始pH值為3.0,發(fā)酵2 d后,考察碳源濃度對發(fā)酵液的水溶性紅曲黃色素色價和色調(diào)的影響,結(jié)果見圖3。

    由圖3可知,當(dāng)蔗糖含量>3%時,對水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)生有一定抑制作用,類似結(jié)果在醇溶性紅曲黃色素發(fā)酵過程中也有報道[7],可能是過高的滲透壓對水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)生有不利影響。綜合色價和色調(diào)值來看,產(chǎn)水溶性紅曲黃色素最佳的葡萄糖含量為2%,此時色價為90.03U/g菌體干質(zhì)量,OD400nm/OD470nm為2.35,OD400nm/ OD510nm為4.59。

    2.4 氮源種類對紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    分別以0.5%的酵母膏、蛋白胨、谷氨酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨為氮源,2%的蔗糖為碳源,初始pH值為3.0,發(fā)酵時間2 d后,考察氮源種類對發(fā)酵液中水溶性黃色素色價和色調(diào)的影響,結(jié)果見圖4。

    圖4 氮源種類對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

    由圖4可知,6種氮源中,酵母膏實驗組2 d后未觀察到明顯的水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)生,而其他氮源實驗組均有大量水溶性紅曲黃色素產(chǎn)生。與有機(jī)氮源酵母膏、蛋白胨、谷氨酸鈉相比,無機(jī)氮源硝酸鉀、硫酸銨、硝酸鉀更有利于水溶性黃色素的產(chǎn)生,其中以硫酸銨為氮源時,黃色素的色價(110.69 U/g)和色調(diào)(OD400nm/OD470nm為2.69,OD400nm/OD510nm為4.54)均較高,故選擇硫酸銨為較優(yōu)氮源。

    2.5 氮源含量對紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    分別以0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%的硫酸銨為氮源,2%的蔗糖為碳源,初始pH值為3.0,發(fā)酵時間2 d后,考察氮源濃度對發(fā)酵液中水溶性紅曲黃色素色價和色調(diào)的影響,結(jié)果見圖5。

    圖5 硫酸銨含量對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.5 Effect of ammonium sulphate concentration on color value(A)and tone(B)of water soluble yellow Monascuspigment

    由圖5可知,在所考察的濃度范圍內(nèi),硫酸銨對水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)影響不明顯,從經(jīng)濟(jì)節(jié)約的角度考慮,較優(yōu)硫酸銨含量為0.2%。

    2.6 發(fā)酵時間對紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    由于黃色素是紅曲菌的次級代謝產(chǎn)物,主要在生長后期大量產(chǎn)生,因此,在上述最佳碳、氮源種類和濃度的條件下,以培養(yǎng)時間為單因素,從發(fā)酵培養(yǎng)的第2天開始,每隔24 h測定發(fā)酵液的pH、色價和色調(diào)值,實驗結(jié)果見圖6。

    由圖6可知,發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基的pH是動態(tài)變化的,第2天到第5天緩慢下降,之后又呈上升趨勢,pH變化范圍在2.85~3.10范圍內(nèi),滿足紅色紅曲菌M-7產(chǎn)水溶性黃色素的基本要求。在水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)量方面,前4天色價較低,從第5天開始,色價開始大幅提升,第8天達(dá)到最高值,為5.56 U/mL,第9天開始下降,可能是黃色素開始向紅色素轉(zhuǎn)化。

    圖6 發(fā)酵時間對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.6 Effect of fermentation time on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

    在水溶性紅曲黃色素的純度方面,其變化趨勢基本與黃色素產(chǎn)量相似,從OD400nm/OD470nm和OD400nm/OD510nm的大小來看,5 d后黃色素的比例顯著提高,其中OD400nm/OD510nm在第8天達(dá)最大,為10.29,之后呈下降趨勢,第9天為9.74;而OD400nm/OD470nm一直保持緩慢上升趨勢,第8天為3.93,第9天為4.08。綜合考慮紅曲黃素的產(chǎn)量和純度,最佳發(fā)酵時間為8 d。

    3 結(jié)論

    本實驗以紅色紅曲菌M-7為實驗菌株,以色價和色調(diào)為評價指標(biāo),對液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅曲黃色素的條件進(jìn)行了研究。

    結(jié)果表明,將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH控制在3~4,可實現(xiàn)高純度的水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵生產(chǎn),發(fā)酵產(chǎn)物呈鮮艷的黃色色調(diào)。

    碳源對水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵有顯著影響,以2%的蔗糖最佳,此時水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)值在所考察的碳源中均最高。氮源對水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵有顯著影響,以0.2%的硫酸銨最佳,此時水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)值在所考察的氮源中均最高。

    水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)值隨著培養(yǎng)時間的延長先升后降,在第8天時達(dá)到最高,色價為5.56 U/mL,OD400nm/OD510nm為10.29,OD400nm/OD470nm為3.93。

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    Optimization of liquid-state fermentation conditions for the production of water soluble yellowMonascuspigment

    LI Ruijie,XIE Yumei,HE Siqin,WANG Lei,CHEN Suo,GAO Mengxiang,LI Li*
    (College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 430025,China)

    UsingMonascus ruberM-7 as experimental strain,color value and color tone as evaluation index,the production of water soluble yellow Monascuspigment by liquid state fermentation was investigated.The results showed that when the fermentation medium pH was 3-4,a large portion of water soluble yellowMonascuspigment was synthesized byM.ruberM-7,and the fermentation broths was bright yellow.The optimal carbon source of the medium was sucrose 2%,and the optimal nitrogen source was ammonium sulfate 0.2%,respectively.The color value and the color tone of water soluble yellowMonascuspigment increased in the early stage,decreased in the late stage,and the maximum points were on the 8thday.After 8 d cultivation,the production of water soluble yellowMonascuspigment was 5.56 U/ml,OD400nm/OD510nmwas 10.29 and OD400nm/OD470nmwas 3.93.

    Monascus ruber;water soluble yellowMonascuspigment;liquid-state fermentation

    TS264.4

    0254-5071(2016)11-0073-05

    10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.015

    2016-04-19

    國家自然科學(xué)基金資助項目(31501453;31371829);長江大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(20150089)

    李瑞杰(1994-),女,本科生,研究方向為食品質(zhì)量與安全。

    *通訊作者:李利(1983-),女,講師,博士,研究方向為食品微生物學(xué)。

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