• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅曲黃色素的條件優(yōu)化

    2016-12-14 02:25:46李瑞杰謝玉梅何思琴王磊陳莎高夢祥李利
    中國釀造 2016年11期
    關(guān)鍵詞:色價曲菌紅曲

    李瑞杰,謝玉梅,何思琴,王磊,陳莎,高夢祥,李利*

    (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州430025)

    液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅曲黃色素的條件優(yōu)化

    李瑞杰,謝玉梅,何思琴,王磊,陳莎,高夢祥,李利*

    (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州430025)

    以紅色紅曲菌(Monascus ruber)M-7為實驗菌株,以色價和色調(diào)為評價指標(biāo),對液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅色紅曲黃色素的條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,培養(yǎng)基pH值為3~4時,紅色紅曲菌M-7能合成大量的水溶性紅曲黃色素,發(fā)酵液呈鮮艷的黃色色調(diào);培養(yǎng)基最優(yōu)碳源為2%蔗糖,最優(yōu)氮源為0.2%硫酸銨;水溶性紅色紅曲黃色素的色價和色調(diào)值隨著培養(yǎng)時間的延長先升后降,在第8天時達(dá)到最高,色價為5.56 U/mL,OD400nm/OD510nm為10.29,OD400nm/OD470nm為3.93。

    紅色紅曲菌;水溶性紅曲黃色素;液態(tài)發(fā)酵

    隨著人們健康意識的提高,天然食用色素越來越受到國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。紅曲色素(Monascuspigments)是我國近年來增長速度最快的天然食用色素,是紅色紅曲菌(Monascus ruber)發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,包括黃色、橙色和紅色三類色素組分,在我國及東南亞地區(qū)已有超過1000年的應(yīng)用歷史,目前在歐美等國家的肉制品(如火腿腸)中也得到了很好的應(yīng)用[1-2]。

    黃色素是重要的食用色素,約占市場需求量的60%以上[3]。目前,市售的食用黃色素產(chǎn)品以植物提取為主(如姜黃素、梔子黃等[4]),因而易受季節(jié)、氣候、產(chǎn)地等因素的影響。相比之下,采用微生物發(fā)酵法進(jìn)行天然食用色素的生產(chǎn),不受季節(jié)限制、原料轉(zhuǎn)化率高、成本低,是目前世界食品色素添加劑的發(fā)展趨勢。目前,市場上應(yīng)用廣泛的紅曲色素以紅色素為主,而紅曲黃色素的生產(chǎn)起步較晚,目前生產(chǎn)廠家也很少,產(chǎn)品并未大規(guī)模上市,而且存在色價和色調(diào)都不高等問題[3],因此,紅曲黃色素的開發(fā)研究具有廣闊的前景,可產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益。

    有研究表明,紅曲菌所產(chǎn)生的紅曲色素包括醇溶性組分和水溶性組分[1]。目前的紅曲色素產(chǎn)品一般以醇溶性組分為主,水溶性較差,應(yīng)用范圍主要限制于油性食品(如火腿腸、香腸等)中。近年來,通過菌種的選育和發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化來獲得高色價和色調(diào)值的紅曲黃色素已取得一定成果[5-12],但也均以生產(chǎn)醇溶性紅曲黃色素為主。為豐富紅曲黃色素產(chǎn)品的種類,促進(jìn)其在飲料等非油性食品中的應(yīng)用,本研究以紅曲色素高產(chǎn)菌株—紅色紅曲菌M-7為實驗材料,通過液體發(fā)酵法研究了水溶性紅曲黃色素的生產(chǎn)條件,以探索一種安全、高效、低成本的水溶性紅曲黃色素的生產(chǎn)方法,為其工業(yè)規(guī)?;a(chǎn)提供基礎(chǔ)和參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株

    紅色紅曲菌(Monascus ruber)M-7:由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳福生教授惠贈,該菌株為紅曲色素高產(chǎn)菌株。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    紅曲菌孢子培養(yǎng)基(查氏酵母瓊脂(Czapek yeast exatract agar,CYA)):NaNO33 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g,蔗糖30 g,酵母膏5 g,蒸餾水1 L,瓊脂20 g,pH 5.5。

    液態(tài)發(fā)酵種子制備培養(yǎng)基:在1 L蒸餾水中加入去皮馬鈴薯200 g,煮沸30 min,用4層紗布過濾,濾液中加葡萄糖20 g,定容至1 L。

    水溶性紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[13]:谷氨酸鈉5.04 g,KCl 0.5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 1 g,ZnSO4·7H2O 0.01 g,MnSO4·H2O 0.003 g,葡萄糖20 g,0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 3、4、5、6、7或8)0.5 L,蒸餾水0.5 L。

    以上培養(yǎng)基滅菌條件為:121℃,20 min。其中水溶性紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖單獨(dú)滅菌,滅菌條件為115℃,15 min。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TE124S電子分析天平、PB-10 pH計:德國賽多利斯公司;Mini Spin Plus離心機(jī):德國Eppendorf公司;HVE-50高溫滅菌鍋:日本Hirayama公司;U-1900雙光束紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱:上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;疊加式IS-RDS3搖床:美國Crystal公司;GZX-6000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵

    (1)孢子懸浮液的制備:將保存在4℃的菌種接種到CYA斜面上,28℃培養(yǎng)10 d,加入5 mL無菌水洗下孢子,用雙層擦鏡紙過濾除去菌絲,玻璃珠將孢子振蕩打散,血球計數(shù)板計數(shù)。

    (2)種子的培養(yǎng):250 mL三角瓶中裝液態(tài)發(fā)酵種子制備培養(yǎng)基50 mL,接種孢子懸浮液,使孢子的終濃度為103個/mL,28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)40~44 h,作為種子液。

    (3)液態(tài)發(fā)酵:250 mL三角瓶裝水溶性紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL,接入上述種子液10 mL,28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)2~9 d。

    1.3.2 生物量的測定

    采取干質(zhì)量法,即發(fā)酵完成后,發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾得到菌絲體,用3倍體積的蒸餾水洗滌菌絲體,于60℃中干燥至質(zhì)量恒定,稱質(zhì)量。

    1.3.3 色價的測定

    發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾得到濾液,12 000 r/min離心3 min,稀釋一定倍數(shù),于200~600 nm進(jìn)行全波段掃描,分別取波長400 nm、470 nm和510 nm處吸光度值計算黃色素、橙色素和紅色素的色價。色價計算公式:

    1.3.4 色調(diào)的測定

    本實驗色調(diào)定義為黃色素/紅色素=OD400nm/OD510nm;黃色素/橙色素=OD400nm/OD470nm。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pH對紅色紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    據(jù)報道,pH對紅曲色素的產(chǎn)生有一定影響[13-15]。一般認(rèn)為,酸性條件下主要產(chǎn)物為紅曲黃色素和紅曲橙色素;中性或堿性條件下主要產(chǎn)物為紅曲紅色素。為了實現(xiàn)紅曲黃色素的生產(chǎn),首先利用檸檬酸-磷酸鹽緩沖液制備不同pH的發(fā)酵培養(yǎng)基,研究pH對紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素的影響,結(jié)果見圖1。

    圖1 pH對水溶性紅曲黃色素色調(diào)的影響Fig.1 Effect of pH on color tone of water soluble yellow Monascuspigment

    由圖1可知,發(fā)酵培養(yǎng)基的pH對色素的種類影響很大,在pH3和pH4時,紅曲菌M-7產(chǎn)生較多的水溶性黃色素,發(fā)酵液呈鮮艷的黃色色調(diào),OD400nm/OD510nm分別為4.50和3.76,OD400nm/OD470nm分別為2.48和2.40,黃色素的色價分別為1.04U/mL和0.95U/mL;而當(dāng)pH為5、6、7和8時,紅曲菌M-7產(chǎn)生較多的水溶性紅色素,發(fā)酵液呈明顯的紅色色調(diào),OD400nm/OD510nm依次為1.66、1.07、0.69和0.68,OD400nm/OD470nm依次為1.44、1.00、0.74和0.73。該結(jié)果中pH對紅曲色素影響的規(guī)律與文獻(xiàn)報道基本一致[13-15]。因此,將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值控制在3~4,可實現(xiàn)水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵生產(chǎn)。在后續(xù)實驗中,均將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值控制在3~4。

    2.2 碳源種類對紅色紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    分別以2%的可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、蔗糖、馬鈴薯淀粉、葡萄糖為碳源,0.5%谷氨酸鈉為氮源,初始pH值為3.0,發(fā)酵2 d后,考察碳源種類對發(fā)酵液中水溶性紅曲黃色素色價和色調(diào)的影響,結(jié)果見圖2。

    由圖2A可知,以可溶性淀粉、蔗糖和馬鈴薯淀粉為碳源時水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)量較高,色價均>80U/g菌體干質(zhì)量;由圖2B可知,蔗糖為碳源時的色調(diào)值最高,OD400nm/OD510nm、OD400nm/OD470nm分別是4.75、2.35,表明此時產(chǎn)生的水溶性紅曲黃色素所占比例最大,純度較高。因此,確定蔗糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

    圖2 碳源種類對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.2 Effect of carbon sources on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

    2.3 碳源含量對紅色紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    圖3 葡萄糖含量對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.3 Effect of glucose concentration on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

    分別以1%、2%、3%、4%、5%的蔗糖為碳源,0.5%的谷氨酸鈉為氮源,初始pH值為3.0,發(fā)酵2 d后,考察碳源濃度對發(fā)酵液的水溶性紅曲黃色素色價和色調(diào)的影響,結(jié)果見圖3。

    由圖3可知,當(dāng)蔗糖含量>3%時,對水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)生有一定抑制作用,類似結(jié)果在醇溶性紅曲黃色素發(fā)酵過程中也有報道[7],可能是過高的滲透壓對水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)生有不利影響。綜合色價和色調(diào)值來看,產(chǎn)水溶性紅曲黃色素最佳的葡萄糖含量為2%,此時色價為90.03U/g菌體干質(zhì)量,OD400nm/OD470nm為2.35,OD400nm/ OD510nm為4.59。

    2.4 氮源種類對紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    分別以0.5%的酵母膏、蛋白胨、谷氨酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨為氮源,2%的蔗糖為碳源,初始pH值為3.0,發(fā)酵時間2 d后,考察氮源種類對發(fā)酵液中水溶性黃色素色價和色調(diào)的影響,結(jié)果見圖4。

    圖4 氮源種類對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

    由圖4可知,6種氮源中,酵母膏實驗組2 d后未觀察到明顯的水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)生,而其他氮源實驗組均有大量水溶性紅曲黃色素產(chǎn)生。與有機(jī)氮源酵母膏、蛋白胨、谷氨酸鈉相比,無機(jī)氮源硝酸鉀、硫酸銨、硝酸鉀更有利于水溶性黃色素的產(chǎn)生,其中以硫酸銨為氮源時,黃色素的色價(110.69 U/g)和色調(diào)(OD400nm/OD470nm為2.69,OD400nm/OD510nm為4.54)均較高,故選擇硫酸銨為較優(yōu)氮源。

    2.5 氮源含量對紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    分別以0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%的硫酸銨為氮源,2%的蔗糖為碳源,初始pH值為3.0,發(fā)酵時間2 d后,考察氮源濃度對發(fā)酵液中水溶性紅曲黃色素色價和色調(diào)的影響,結(jié)果見圖5。

    圖5 硫酸銨含量對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.5 Effect of ammonium sulphate concentration on color value(A)and tone(B)of water soluble yellow Monascuspigment

    由圖5可知,在所考察的濃度范圍內(nèi),硫酸銨對水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)影響不明顯,從經(jīng)濟(jì)節(jié)約的角度考慮,較優(yōu)硫酸銨含量為0.2%。

    2.6 發(fā)酵時間對紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

    由于黃色素是紅曲菌的次級代謝產(chǎn)物,主要在生長后期大量產(chǎn)生,因此,在上述最佳碳、氮源種類和濃度的條件下,以培養(yǎng)時間為單因素,從發(fā)酵培養(yǎng)的第2天開始,每隔24 h測定發(fā)酵液的pH、色價和色調(diào)值,實驗結(jié)果見圖6。

    由圖6可知,發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基的pH是動態(tài)變化的,第2天到第5天緩慢下降,之后又呈上升趨勢,pH變化范圍在2.85~3.10范圍內(nèi),滿足紅色紅曲菌M-7產(chǎn)水溶性黃色素的基本要求。在水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)量方面,前4天色價較低,從第5天開始,色價開始大幅提升,第8天達(dá)到最高值,為5.56 U/mL,第9天開始下降,可能是黃色素開始向紅色素轉(zhuǎn)化。

    圖6 發(fā)酵時間對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.6 Effect of fermentation time on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

    在水溶性紅曲黃色素的純度方面,其變化趨勢基本與黃色素產(chǎn)量相似,從OD400nm/OD470nm和OD400nm/OD510nm的大小來看,5 d后黃色素的比例顯著提高,其中OD400nm/OD510nm在第8天達(dá)最大,為10.29,之后呈下降趨勢,第9天為9.74;而OD400nm/OD470nm一直保持緩慢上升趨勢,第8天為3.93,第9天為4.08。綜合考慮紅曲黃素的產(chǎn)量和純度,最佳發(fā)酵時間為8 d。

    3 結(jié)論

    本實驗以紅色紅曲菌M-7為實驗菌株,以色價和色調(diào)為評價指標(biāo),對液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅曲黃色素的條件進(jìn)行了研究。

    結(jié)果表明,將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH控制在3~4,可實現(xiàn)高純度的水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵生產(chǎn),發(fā)酵產(chǎn)物呈鮮艷的黃色色調(diào)。

    碳源對水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵有顯著影響,以2%的蔗糖最佳,此時水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)值在所考察的碳源中均最高。氮源對水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵有顯著影響,以0.2%的硫酸銨最佳,此時水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)值在所考察的氮源中均最高。

    水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)值隨著培養(yǎng)時間的延長先升后降,在第8天時達(dá)到最高,色價為5.56 U/mL,OD400nm/OD510nm為10.29,OD400nm/OD470nm為3.93。

    [1]FENG Y,SHAO Y,CHEN F.Monascuspigments[J].Appl MicrobiolBiotechnol,2012,96:1421-1440.

    [2]梁彬霞,白衛(wèi)東,楊曉暾,等.紅曲色素的功能特性研究進(jìn)展[J].中國釀造,2012,31(3):21-24.

    [3]周波,吳吉林,朱明軍,等.基于代謝途徑提高紅曲黃色素生成及控制橘霉素產(chǎn)生的研究[J].食品科技,2011,36(2):242-248.

    [4]周波,吳吉林,朱明軍,等.微生物黃色素的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報,2010,37(9):1362-1368.

    [5]周波,楊玲,崔思穎,等.響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基提高紅曲黃色素的色調(diào)[J].華南理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008,36(11):91-95.

    [6]周波,王菊芳,吳振強(qiáng),等.高產(chǎn)紅曲黃色素菌株的選育[J].微生物學(xué)通報,2008,35(12):1909-1914.

    [7]毛鵬.紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵技術(shù)研究[D].無錫:江南大學(xué),2015.

    [8]周波,浦躍武,朱明軍,等.氮源對紅曲霉突變株產(chǎn)黃色素的影響[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24(2):123-127.

    [9]XIONG X,ZHANG X,WU Z,et al.Accumulation of yellowMonascus pigments by extractive fermentation in nonionic surfactant micelle aqueous solution[J].Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(3):1173-1180.

    [10]JIRASATID S,NOPHARATANA M,KITSUBUN P,et al.Statistical optimization for Monacolin K and yellow pigment production and citrinin reduction byMonascus purpureusin solid-state fermentation[J].J Microbiol Biotechn,2013,23(3):364-374.

    [11]YONGSMITH B,THONGPRADIS P,KLINSUPA W,et al.Fermentation and quality of yellow pigments from golden brown rice solid culture byaselectedMonascusmutant[J].Appl Microbiol Biotechn,2013, 97(20):8895-8902.

    [12]KLINAUPA W,PHANSIRI S,THONGPRADIS P,et al.Enhancement of yellow pigment production by intraspecific protoplast fusion of Monascusspp.yellow mutant(ade(-))and white mutant(prototroph)[J]. J Biotechnol,2016,217:62-71.

    [13]KANG B,ZHANG X,WU Z,et al.Production of citrinin-freeMonascus pigments bysubmerged culture at low pH[J].Enzyme Microb Technol, 2014,55:50-57.

    [14]OROZCO S F B,KILIKIAN B V.Effect of pH on citrinin and red pigments production byMonascus purpureusCCT3802[J].World J Microbiol Biotechnol,2008,24:263-268.

    [15]CHEN M H,JOHNS M R.Effect of pH and nitrogen source on pigment production byMonascus purpureus[J].Appl Microbiol Biot,1993,40 (1):132-138.

    Optimization of liquid-state fermentation conditions for the production of water soluble yellowMonascuspigment

    LI Ruijie,XIE Yumei,HE Siqin,WANG Lei,CHEN Suo,GAO Mengxiang,LI Li*
    (College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 430025,China)

    UsingMonascus ruberM-7 as experimental strain,color value and color tone as evaluation index,the production of water soluble yellow Monascuspigment by liquid state fermentation was investigated.The results showed that when the fermentation medium pH was 3-4,a large portion of water soluble yellowMonascuspigment was synthesized byM.ruberM-7,and the fermentation broths was bright yellow.The optimal carbon source of the medium was sucrose 2%,and the optimal nitrogen source was ammonium sulfate 0.2%,respectively.The color value and the color tone of water soluble yellowMonascuspigment increased in the early stage,decreased in the late stage,and the maximum points were on the 8thday.After 8 d cultivation,the production of water soluble yellowMonascuspigment was 5.56 U/ml,OD400nm/OD510nmwas 10.29 and OD400nm/OD470nmwas 3.93.

    Monascus ruber;water soluble yellowMonascuspigment;liquid-state fermentation

    TS264.4

    0254-5071(2016)11-0073-05

    10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.015

    2016-04-19

    國家自然科學(xué)基金資助項目(31501453;31371829);長江大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(20150089)

    李瑞杰(1994-),女,本科生,研究方向為食品質(zhì)量與安全。

    *通訊作者:李利(1983-),女,講師,博士,研究方向為食品微生物學(xué)。

    猜你喜歡
    色價曲菌紅曲
    紅曲黃色素的研究進(jìn)展
    藥食兩用話紅曲
    中老年保健(2020年5期)2020-12-11 01:16:06
    高色價紅曲米液態(tài)制種的培養(yǎng)條件優(yōu)化
    梔子黃色素提取工藝及品質(zhì)評價
    紅曲黃色素的多樣性及產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的討論
    43例肺曲菌病誤診的CT表現(xiàn)
    8株紅曲菌生產(chǎn)特性研究
    果膠酶法提取紫甘藍(lán)花青素工藝條件研究
    紅曲菌ISSR分子標(biāo)記體系的構(gòu)建和聚類分析
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:04
    橙色紅曲菌及其pksCT基因缺失株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)橘霉素及色素的變化
    国产男女内射视频| 一级毛片精品| 亚洲av熟女| 午夜福利欧美成人| 又黄又粗又硬又大视频| 操美女的视频在线观看| 成人免费观看视频高清| 欧美精品啪啪一区二区三区| 性少妇av在线| 国产精品一区二区在线观看99| 国产在线观看jvid| 欧美不卡视频在线免费观看 | x7x7x7水蜜桃| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 国产主播在线观看一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 悠悠久久av| 69av精品久久久久久| 97人妻天天添夜夜摸| 成人三级做爰电影| 99国产精品免费福利视频| 国产精品综合久久久久久久免费 | 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲中文av在线| 老熟女久久久| 热99国产精品久久久久久7| 国产高清videossex| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲第一av免费看| 又黄又粗又硬又大视频| 女人精品久久久久毛片| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品乱码久久久久久99久播| 纯流量卡能插随身wifi吗| 激情在线观看视频在线高清 | 免费在线观看日本一区| 久久九九热精品免费| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 视频区图区小说| 久久国产精品大桥未久av| 老熟女久久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产午夜精品久久久久久| 999久久久国产精品视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 99久久精品国产亚洲精品| 午夜福利,免费看| 欧美日韩精品网址| 国产片内射在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产真人三级小视频在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 大码成人一级视频| 岛国毛片在线播放| 欧美日韩精品网址| 一区二区日韩欧美中文字幕| 老熟妇仑乱视频hdxx| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲五月天丁香| 国产亚洲欧美在线一区二区| 天天影视国产精品| 国产99白浆流出| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 欧美中文综合在线视频| 日韩有码中文字幕| 精品免费久久久久久久清纯 | 视频区图区小说| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美日本中文国产一区发布| 在线观看免费视频日本深夜| 看片在线看免费视频| 大码成人一级视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 大型av网站在线播放| 黄色视频不卡| 一a级毛片在线观看| av天堂在线播放| 妹子高潮喷水视频| 欧美乱色亚洲激情| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 无人区码免费观看不卡| 女人久久www免费人成看片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 下体分泌物呈黄色| 午夜91福利影院| 亚洲在线自拍视频| 在线av久久热| 日韩有码中文字幕| 99riav亚洲国产免费| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 男女午夜视频在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 精品少妇久久久久久888优播| 黑人猛操日本美女一级片| 很黄的视频免费| 午夜精品在线福利| 日韩人妻精品一区2区三区| 午夜福利在线免费观看网站| 一进一出好大好爽视频| 国产深夜福利视频在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 欧美日韩瑟瑟在线播放| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲av电影在线进入| 午夜福利欧美成人| 亚洲 国产 在线| 国产精品免费视频内射| 国产成+人综合+亚洲专区| 国精品久久久久久国模美| 色尼玛亚洲综合影院| av片东京热男人的天堂| 欧美成狂野欧美在线观看| 夜夜爽天天搞| 一夜夜www| 视频区欧美日本亚洲| 国产三级黄色录像| 欧美午夜高清在线| 一a级毛片在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 超碰97精品在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产熟女午夜一区二区三区| 又大又爽又粗| 精品福利永久在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 久久国产精品大桥未久av| 一二三四社区在线视频社区8| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 香蕉国产在线看| av超薄肉色丝袜交足视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 日韩三级视频一区二区三区| 精品国产美女av久久久久小说| 免费黄频网站在线观看国产| 91字幕亚洲| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品乱码一区二三区的特点 | ponron亚洲| 久久香蕉精品热| 在线观看66精品国产| 国产精品99久久99久久久不卡| 中文字幕精品免费在线观看视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲欧美激情在线| 女性被躁到高潮视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 成人精品一区二区免费| 久久影院123| 搡老乐熟女国产| 亚洲avbb在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 99香蕉大伊视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品欧美亚洲77777| 久久草成人影院| 国产成人啪精品午夜网站| 五月开心婷婷网| 亚洲第一av免费看| 久久久久久人人人人人| 亚洲精品久久午夜乱码| 校园春色视频在线观看| 国产成人影院久久av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲精品av麻豆狂野| 成人影院久久| 国产在线精品亚洲第一网站| xxx96com| 免费观看精品视频网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品一区二区免费欧美| 国产在线精品亚洲第一网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美国产精品一级二级三级| 99久久综合精品五月天人人| 老司机午夜福利在线观看视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | svipshipincom国产片| 欧美精品av麻豆av| 黄色丝袜av网址大全| 看片在线看免费视频| av国产精品久久久久影院| 9色porny在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产激情久久老熟女| 91麻豆av在线| 777米奇影视久久| 亚洲成国产人片在线观看| 日本wwww免费看| 无人区码免费观看不卡| 亚洲欧美激情综合另类| 国产区一区二久久| 极品人妻少妇av视频| 美女 人体艺术 gogo| 无人区码免费观看不卡| 99久久精品国产亚洲精品| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲国产精品合色在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 成年人午夜在线观看视频| 老司机在亚洲福利影院| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 久热爱精品视频在线9| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美 日韩 精品 国产| 日本五十路高清| 久久狼人影院| 亚洲,欧美精品.| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 精品国产亚洲在线| 亚洲午夜理论影院| 精品欧美一区二区三区在线| 久久精品成人免费网站| 天堂√8在线中文| av中文乱码字幕在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美大码av| aaaaa片日本免费| 电影成人av| 高清视频免费观看一区二区| 韩国精品一区二区三区| www日本在线高清视频| 中文字幕最新亚洲高清| 午夜老司机福利片| av网站免费在线观看视频| www.999成人在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 校园春色视频在线观看| 午夜精品在线福利| 亚洲黑人精品在线| 青草久久国产| 性少妇av在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 最近最新中文字幕大全电影3 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 黄色丝袜av网址大全| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲成人手机| 99国产精品一区二区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 老汉色∧v一级毛片| 99精品久久久久人妻精品| 久久ye,这里只有精品| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 少妇粗大呻吟视频| 日本五十路高清| 午夜免费观看网址| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲精华国产精华精| 久9热在线精品视频| e午夜精品久久久久久久| 国产片内射在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 9热在线视频观看99| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲成人免费av在线播放| 一进一出好大好爽视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 99国产精品一区二区蜜桃av | 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲熟女毛片儿| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲成人国产一区在线观看| 日韩视频一区二区在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 午夜精品久久久久久毛片777| 男女高潮啪啪啪动态图| 看免费av毛片| 香蕉久久夜色| 国产视频一区二区在线看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 成年动漫av网址| 男女床上黄色一级片免费看| 国产有黄有色有爽视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 黄色视频,在线免费观看| 精品一品国产午夜福利视频| 国产亚洲一区二区精品| 国产在视频线精品| 国产激情久久老熟女| 午夜精品久久久久久毛片777| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 精品视频人人做人人爽| 午夜视频精品福利| 欧美日韩av久久| 亚洲国产欧美网| 淫妇啪啪啪对白视频| av网站在线播放免费| 三级毛片av免费| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲精品自拍成人| 日韩视频一区二区在线观看| 一进一出好大好爽视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产国语露脸激情在线看| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品国产高清国产av | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美日韩一级在线毛片| 久久人妻av系列| 黄色成人免费大全| 成年动漫av网址| 极品教师在线免费播放| 99热国产这里只有精品6| 伦理电影免费视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲av美国av| a级毛片在线看网站| 亚洲成国产人片在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 久久九九热精品免费| 国产成人啪精品午夜网站| av不卡在线播放| 亚洲全国av大片| 国产一区二区三区综合在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 夫妻午夜视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲精品粉嫩美女一区| 成人黄色视频免费在线看| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品 国内视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 成人永久免费在线观看视频| 老熟女久久久| 90打野战视频偷拍视频| 天天添夜夜摸| 久久精品成人免费网站| 婷婷丁香在线五月| av不卡在线播放| av中文乱码字幕在线| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 麻豆国产av国片精品| 国产成人av激情在线播放| 国产一区二区三区视频了| 深夜精品福利| 欧美日韩视频精品一区| 午夜福利,免费看| 欧美日韩福利视频一区二区| 不卡av一区二区三区| 搡老岳熟女国产| 黄色视频不卡| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品国内亚洲2022精品成人 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 99热只有精品国产| 在线观看免费午夜福利视频| 看免费av毛片| 动漫黄色视频在线观看| 两个人免费观看高清视频| 久久久国产精品麻豆| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美中文综合在线视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产麻豆69| 久久精品国产综合久久久| 好男人电影高清在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产成人av激情在线播放| 国产成人欧美| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 老司机亚洲免费影院| 国产精品久久久av美女十八| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 免费不卡黄色视频| 美国免费a级毛片| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久中文字幕一级| 精品久久蜜臀av无| 色老头精品视频在线观看| av欧美777| 国产精品久久视频播放| 在线播放国产精品三级| 亚洲熟女毛片儿| 久久精品国产清高在天天线| 99香蕉大伊视频| 一区二区三区国产精品乱码| 精品亚洲成a人片在线观看| 91av网站免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 久久精品亚洲av国产电影网| 最新美女视频免费是黄的| 久久香蕉精品热| 欧美黑人欧美精品刺激| 69精品国产乱码久久久| 91精品国产国语对白视频| videos熟女内射| 99国产综合亚洲精品| 两人在一起打扑克的视频| av电影中文网址| 99re在线观看精品视频| cao死你这个sao货| 国产高清国产精品国产三级| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日韩欧美一区视频在线观看| cao死你这个sao货| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲男人天堂网一区| 国产麻豆69| 老司机在亚洲福利影院| 91精品三级在线观看| 人人妻人人澡人人看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 午夜福利欧美成人| a在线观看视频网站| 丁香六月欧美| av在线播放免费不卡| 午夜免费成人在线视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产有黄有色有爽视频| 欧美中文综合在线视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 老汉色av国产亚洲站长工具| x7x7x7水蜜桃| 下体分泌物呈黄色| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 又紧又爽又黄一区二区| 一夜夜www| 色播在线永久视频| 欧美日本中文国产一区发布| 多毛熟女@视频| 男人舔女人的私密视频| 91国产中文字幕| 香蕉久久夜色| 国产又爽黄色视频| 老鸭窝网址在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 精品乱码久久久久久99久播| 91麻豆av在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 叶爱在线成人免费视频播放| 在线播放国产精品三级| 成人国产一区最新在线观看| a级毛片在线看网站| 免费在线观看日本一区| 午夜福利视频在线观看免费| 国产精品久久视频播放| 欧美最黄视频在线播放免费 | 露出奶头的视频| 免费在线观看黄色视频的| 午夜91福利影院| 久热这里只有精品99| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久中文看片网| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品国产乱子伦一区二区三区| 色在线成人网| 中文欧美无线码| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产xxxxx性猛交| 一区在线观看完整版| 超碰成人久久| 天堂√8在线中文| 精品午夜福利视频在线观看一区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久中文字幕人妻熟女| 国产精品一区二区在线不卡| 三上悠亚av全集在线观看| 日本a在线网址| 国产99久久九九免费精品| 久久狼人影院| 香蕉国产在线看| 精品高清国产在线一区| 国产欧美日韩一区二区三| 极品人妻少妇av视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美国产精品一级二级三级| 日韩欧美国产一区二区入口| 18在线观看网站| 成人永久免费在线观看视频| 一二三四社区在线视频社区8| 91麻豆av在线| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲av熟女| 一级毛片高清免费大全| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美乱妇无乱码| 脱女人内裤的视频| 黄色 视频免费看| 一a级毛片在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 午夜亚洲福利在线播放| 国产黄色免费在线视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 大型黄色视频在线免费观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 丁香欧美五月| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 身体一侧抽搐| 久久精品成人免费网站| 精品久久久久久久久久免费视频 | 久9热在线精品视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 免费观看人在逋| 精品少妇久久久久久888优播| 成年动漫av网址| 99热网站在线观看| 黄色 视频免费看| 男人的好看免费观看在线视频 | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产在线精品亚洲第一网站| 99re在线观看精品视频| 首页视频小说图片口味搜索| ponron亚洲| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品国产高清国产av | 国产99久久九九免费精品| 1024香蕉在线观看| 夫妻午夜视频| 一a级毛片在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 免费看十八禁软件| 老司机在亚洲福利影院| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲午夜理论影院| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| xxx96com| 黄色女人牲交| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲免费av在线视频| av中文乱码字幕在线| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 老司机福利观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 99国产综合亚洲精品| 窝窝影院91人妻| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产成人啪精品午夜网站| 久久国产乱子伦精品免费另类| 精品国产一区二区久久| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 国产免费男女视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 丁香六月欧美| 日韩三级视频一区二区三区| 伦理电影免费视频| 在线观看免费视频网站a站| 777米奇影视久久| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 在线观看日韩欧美| 悠悠久久av| 久久九九热精品免费| 亚洲熟女毛片儿| a在线观看视频网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 午夜亚洲福利在线播放| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99精品在免费线老司机午夜| 国产欧美日韩精品亚洲av| 午夜免费鲁丝| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 91大片在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 亚洲精品国产区一区二| 这个男人来自地球电影免费观看| 少妇 在线观看| 国产黄色免费在线视频| 女同久久另类99精品国产91| 这个男人来自地球电影免费观看| 一二三四在线观看免费中文在| 久久久久久久久久久久大奶|