補(bǔ)腎益髓方促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠髓鞘再生的作用

王永強(qiáng) 師一民 安辰 趙暉 李明 齊放 張秋霞 陳振振 樊永平 王蕾

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·論著·

補(bǔ)腎益髓方促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠髓鞘再生的作用

王永強(qiáng) 師一民 安辰 趙暉 李明 齊放 張秋霞 陳振振 樊永平 王蕾

目的 觀察補(bǔ)腎益髓方促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠髓鞘再生的作用。方法 80只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對照、模型、醋酸潑尼松及補(bǔ)腎益髓方組。以髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendroglia glycoprotein，MOG)35-55誘導(dǎo)小鼠EAE模型。治療組小鼠每天給予相應(yīng)藥物灌胃治療，共40天，醋酸潑尼松為陽性對照藥物。每天觀察動物的一般情況，記錄小鼠神經(jīng)功能評分，統(tǒng)計(jì)小鼠的發(fā)病率、潛伏期、病程和疾病負(fù)荷等。取小鼠腦和脊髓經(jīng)固藍(lán)染色觀察其髓鞘變化，免疫組化法測定髓鞘再生相關(guān)蛋白硫酸軟骨素蛋白多糖2膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)的表達(dá)。結(jié)果 補(bǔ)腎益髓方能夠延長小鼠發(fā)病潛伏期、縮短EAE病程、降低小鼠疾病負(fù)荷(P<0.05)，減少小鼠腦和脊髓內(nèi)炎細(xì)胞浸潤和髓鞘脫失；本方還可促進(jìn)NG2和MBP蛋白的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論 補(bǔ)腎益髓方對EAE小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用，并能減輕髓鞘損傷和促進(jìn)髓鞘修復(fù)。

補(bǔ)腎益髓方； 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎； 髓鞘再生

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦白質(zhì)脫髓鞘為病變特點(diǎn)的自身免疫性疾病[1-2]，髓鞘脫失、軸突損傷和少突膠質(zhì)細(xì)胞等破壞是MS的病理特征[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在疾病早期髓鞘尚有一定的再生能力[4]。MS脫髓鞘后，髓鞘再生主要由少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)募集至損傷部位，分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocytes，OLs)并產(chǎn)生髓磷脂包裹受損的軸突[5-7]，最終實(shí)現(xiàn)再髓鞘化來恢復(fù)神經(jīng)功能。因此在治療上，除了控制炎癥以減輕神經(jīng)損傷外，促進(jìn)髓鞘再生也是治療MS的重要環(huán)節(jié)[8]。目前西醫(yī)采用免疫治療(如激素、干擾素等)以控制其炎癥，糖皮質(zhì)激素(如醋酸潑尼松等)是治療MS的基本藥物[9]，但長期大量使用，毒副作用明顯，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在髓鞘再生方面幾乎無藥可用[10]。而越來越多的文獻(xiàn)報道顯示了中醫(yī)藥在治療MS疾病方面存在的優(yōu)勢[11]。補(bǔ)腎益髓方具有滋陰補(bǔ)腎、化痰活血的功用，能夠改善MS患者癥狀和體征，延長緩解期控制復(fù)發(fā)；同時能夠調(diào)節(jié)免疫功能，促進(jìn)軸突及髓鞘的修復(fù)再生，臨床效果明顯[12]。研究發(fā)現(xiàn)，髓鞘形成過程中在OPCs階段主要表達(dá)NG2和A2B5，在髓鞘OLs階段主要表達(dá)MBP和O4成熟的特異性蛋白[13-14]。因此本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，利用MS動物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠，觀察補(bǔ)腎益髓方對EAE小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并通過免疫組化法觀察其對NG2和MBP表達(dá)的影響，以探討本方促進(jìn)EAE小鼠髓鞘再生的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57BL/6雌性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量15～17 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心國家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室。置于獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)單籠飼養(yǎng)，溫度18～22℃，相對濕度40%～60%，自由飲食和飲水。所有實(shí)驗(yàn)步驟均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 藥物和試劑

補(bǔ)腎益髓方(生地黃10 g、熟地黃10 g、制何首烏10 g、酒大黃2 g、益母草10 g、浙貝母6 g、水蛭3 g、全蝎2 g、天麻3 g、連翹6 g)由北京亞東生物制藥有限公司制備。制備方法簡述如下：浙貝母研粉過篩；其余藥物煎煮濃縮成稠膏，與浙貝母粉混勻備用。醋酸潑尼松片由天津力生制藥有限公司生產(chǎn)。

髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)35-55由北京旭和源生物科技有限公司合成；滅活結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，H37Ra，MTB，批號：4283842，購自BD公司)；完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant, CFA，批號：SLBH7316V，購自Sigma公司)；百日咳毒素(pertussis toxin，PTX，批號：SLBP1591V，購自Sigma公司)； NG2抗體(批號：GR26516-29，購自abcam公司)；MBP抗體(批號：GR170892-2，購自abcam公司)。

1.3 分組及模型制備

將80只小鼠隨機(jī)分為正常對照組(n=20)、模型組(n=20)、醋酸潑尼松組(n=20)及補(bǔ)腎益髓方組(n=20)。在免疫當(dāng)天及免疫后第7天于小鼠后背中線兩側(cè)皮下4點(diǎn)注射MOG35-55與CFA按1∶1混合的乳化抗原0.2 mL(含50 μg MOG35-55、100 μL CFA，0.3 mg的MTB和100 μL生理鹽水)，且免疫當(dāng)天及48小時后，腹腔注射PTX 500 ng/只，誘導(dǎo)小鼠建立EAE模型。正常對照組小鼠用同體積生理鹽水代替。

1.4 給藥和處理方法

免疫第一天開始分別灌胃給予醋酸潑尼松(5 mg/kg 體重)和補(bǔ)腎益髓方(3.02 g生藥/kg體重)。正常對照組和模型組均灌服相同體積蒸餾水。每天1次，連續(xù)40天，每天觀察小鼠神經(jīng)行為學(xué)變化。各組小鼠分別于發(fā)病急性期(20天)、緩解期(40天)取腦和脊髓。

1.5 組織標(biāo)本采集及處理

在發(fā)病第20、40天，每組取4只小鼠予10%水合氯醛(190 mg/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心臟灌流，取腦和脊髓，石蠟包埋成2 μm厚度的切片，固藍(lán)(luxol fast blue,LFB)染色，光鏡觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 小鼠神經(jīng)行為學(xué)觀察 小鼠造模后，每天對小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。神經(jīng)功能評分采用15分記分法：尾巴活動分為3級：無癥狀者0分，尾巴張力減低或尾巴遠(yuǎn)端癱瘓1分，尾巴全癱2分；肢體活動分為4級:無癥狀者0分，步態(tài)不穩(wěn)1分，肢體輕癱，行走時肢體拖曳2分，肢體全癱，行走時肢體外翻3分。通過累積分?jǐn)?shù)得出總分。若出現(xiàn)死亡則記為15分。計(jì)算小鼠的發(fā)病率、潛伏期、病程和疾病負(fù)荷。疾病負(fù)荷是指觀察期內(nèi)每只小鼠神經(jīng)功能評分的總和。

1.6.2 NG2與MBP免疫組化染色觀察 小鼠腦和脊髓切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫至水，PBS沖洗后，放入檸檬酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)20分鐘，取出，室溫下自然冷卻至35℃以下，用3%H2O2孵育10分鐘，滴加一抗稀釋液NG2(1∶150)/ MBP(1∶350)，4℃孵育12小時。取出后，在37℃放置1小時，再依次加入聚合酶輔助劑一、抗兔IgG多聚體(試劑二)后，37℃孵育1小時。DAB顯色1～5分鐘，脫水、透明、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察照相，并用NIS-Elements BR 3.2軟件測定積分光密度(integral optical density，IOD)值。

人力資本可以劃分為：員工擁有知識的多樣性；員工解決問題的能力；員工的受教育背景或者高學(xué)歷員工的比例；員工的基本技能；員工的學(xué)習(xí)能力或工作經(jīng)驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎益髓方對EAE小鼠神經(jīng)行為學(xué)變化的影響

模型組小鼠于造模12天后開始發(fā)病，并于造模19天達(dá)到高峰，發(fā)病率為100%，隨后成緩慢下降趨勢，但在40天時發(fā)病率仍為80%。醋酸潑尼松和補(bǔ)腎益髓方治療組發(fā)病率變化趨勢與模型組相一致，但其發(fā)病高峰期稍有后移，發(fā)病率均低于模型組。其中醋酸潑尼松組于造模12天開始發(fā)病，第20天發(fā)病率最高為90%，在40天時發(fā)病率降至50%；補(bǔ)腎益髓方組于造模后13天開始發(fā)病，造模21天發(fā)病率最高為90%，在40天時發(fā)病率下降為40%。

表1顯示，模型組小鼠潛伏期為(14.4±0.6)天，而醋酸潑尼松和補(bǔ)腎益髓方明顯延長了EAE小鼠的潛伏期，較模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組小鼠的病程最長，為(36.2±2.1)天，醋酸潑尼松組的病程縮短為(31.9±2.0)天，補(bǔ)腎益髓方組的病程明顯縮短為(28.9±2.3)天,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且醋酸潑尼松和補(bǔ)腎益髓方組較模型組均能夠降低EAE小鼠疾病負(fù)荷值(P<0.05)。

表1 各組小鼠發(fā)病潛伏期、病程及疾病負(fù)荷的變化±s)

注： 與模型組相比，aP<0.05。

2.2 補(bǔ)腎益髓方對EAE小鼠腦及脊髓髓鞘的影響

LFB染色結(jié)果分析得出，在20天時正常對照組大鼠腦及脊髓均著色均勻，結(jié)構(gòu)有序完整；模型組有大量炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，髓鞘板層結(jié)構(gòu)疏松呈泡沫狀、髓鞘不連續(xù)、甚至呈片狀脫失。醋酸潑尼松組及補(bǔ)腎益髓方組均有炎細(xì)胞浸潤及髓鞘脫失現(xiàn)象，但均相對于模型組較輕。見圖1、2。

第20天，模型組小鼠腦和脊髓中NG2表達(dá)較正常對照組明顯升高(P<0.001)，醋酸潑尼松和補(bǔ)腎益髓方組NG2表達(dá)與模型組相比均明顯降低(P<0.001)；但在第40天時，模型組小鼠腦和脊髓中NG2表達(dá)較正常對照組明顯降低(P<0.001)，醋酸潑尼松和補(bǔ)腎益髓方組小鼠NG2表達(dá)均較模型組明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見圖3、圖4，表2。

2.4 補(bǔ)腎益髓方對EAE小鼠腦及脊髓組織中MBP表達(dá)的影響

在第20天和第40天，模型組小鼠腦和脊髓中MBP表達(dá)較正常對照組均明顯降低(P<0.05，P<0.001)，但經(jīng)過醋酸潑尼松和補(bǔ)腎益髓方治療后，小鼠腦和脊髓中MBP表達(dá)均較明顯升高，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見圖5、圖6，表3。

注：A.正常對照組;B.模型組;C.醋酸潑尼松組;D.補(bǔ)腎益髓方組

注： A.正常對照組;B.模型組;C.醋酸潑尼松組;D.補(bǔ)腎益髓方組

注： A.正常對照組(20天);B.模型組(20天);C.醋酸潑尼松組(20天);D.補(bǔ)腎益髓方組(20天)E.正常對照組(40天);F.模型組(40天);G.醋酸潑尼松組(40天);H.補(bǔ)腎益髓方組(40天)

注：A.正常對照組(20天);B.模型組(20天);C.醋酸潑尼松組(20天);D.補(bǔ)腎益髓方組(20天)E.正常對照組(40天);F.模型組(40天);G.醋酸潑尼松組(40天);H.補(bǔ)腎益髓方組(40天)

組別n腦第20天第40天脊髓第20天第40天正常對照組420．48±0．6220．30±0．3619．35±0．5020．27±1．05模型組436．55±1．17a13．76±0．48a34．82±1．31a13．06±1．30a醋酸潑尼松組429．02±1．08d16．47±0．93c27．63±0．58d16．19±0．40b補(bǔ)腎益髓方組428．46±1．12d17．91±0．64d28．89±1．70d17．46±0．56c

注： 與正常對照組比較，aP<0.001；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01，dP<0.001。

注：A.正常對照組(20天);B.模型組(20天);C醋酸潑尼松組(20天); D.補(bǔ)腎益髓方組(20天)E.正常對照組(40天);F.模型組(40天);G.醋酸潑尼松組(40天);H.補(bǔ)腎益髓方組(40天)

注：A.正常對照組(20天);B.模型組(20天);C.醋酸潑尼松組(20天);D.補(bǔ)腎益髓方組(20天)E.正常對照組(40天);F.模型組(40天);G.醋酸潑尼松組(40天);H.補(bǔ)腎益髓方組(40天)

組別n腦第20天第40天脊髓第20天第40天正常對照組426．84±0．8826．41±0．7526．12±0．9825．54±0．79模型組417．20±2．02a13．82±0．93a16．32±0．40a12．42±0．44a醋酸潑尼松組422．12±0．70b17．39±0．66b22．04±0．85d16．64±0．61d補(bǔ)腎益髓方組421．78±0．67b20．39±1．37d20．84±1．34c19．32±0．49d

注： 與正常對照組比較，aP<0.001；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01，dP<0.001。

3 討論

MS屬于中醫(yī)“痿癥”范疇，根據(jù)臨床癥狀觀察該病與“骨痿”最為相似[15-16]。目前中醫(yī)對該病的認(rèn)識為本虛標(biāo)實(shí)，腎虛為發(fā)病之本，濕熱濁毒為標(biāo)，與腎、脾、肝密切相關(guān)[16-17]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，MS患者的肝腎陰虛和痰瘀阻絡(luò)證具有普遍性，因此，以補(bǔ)腎配伍化痰活血法為指導(dǎo)創(chuàng)立了補(bǔ)腎益髓方。方中生地黃、熟地黃滋腎養(yǎng)陰，奏扶正之功；浙貝母、益母草、水蛭、全蝎等，化痰祛瘀通絡(luò)，起祛邪之用。前期研究證實(shí)補(bǔ)腎益髓方對EAE模型具有明顯治療作用[12]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎益髓方能夠明顯降低EAE小鼠發(fā)病率，延長發(fā)病潛伏期、縮短了病程，并明顯降低了EAE小鼠的疾病負(fù)荷，與之前的結(jié)果一致。研究顯示，在本病初期，CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目增多，并從外周經(jīng)血腦屏障進(jìn)入CNS攻擊髓鞘等，最終造成脫髓鞘損傷[18]，是導(dǎo)致MS患者神經(jīng)功能障礙的主要原因。從LFB染色結(jié)果分析得出，補(bǔ)腎益髓方能夠減輕EAE小鼠炎細(xì)胞浸潤及髓鞘脫失現(xiàn)象，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

NG2是一種表達(dá)在OPCs細(xì)胞膜上的糖蛋白，稱為硫酸軟骨素蛋白多糖NG2，其可作為OPCs的特異性細(xì)胞標(biāo)志物[19]。MBP是一種具有黏附作用并在髓鞘的形成中起到關(guān)鍵作用的一個重要的髓鞘組成成分[20]，在OPCs分化過程中，有絲分裂后期的少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟階段，髓鞘抗原MBP被合成[21]，并在髓鞘外緣形成穩(wěn)定膜狀板層結(jié)構(gòu)，從而保證了髓鞘的完整性，故MBP是成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性期EAE小鼠腦和脊髓NG2表達(dá)明顯升高，在緩解期卻明顯降低，而MBP水平無論急性期還是緩解期均顯著降低。研究證實(shí)，當(dāng)CNS系統(tǒng)受到損傷后，NG2細(xì)胞在損傷區(qū)的周圍迅速做出反應(yīng)。如在動物脊髓半損傷、興奮性中毒以及脫髓鞘模型中，均出現(xiàn)腦NG2細(xì)胞的增殖反應(yīng)[22]。有學(xué)者認(rèn)為NG2增殖機(jī)制可能與臨近的神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞通過Notch信號通路調(diào)節(jié)NG2細(xì)胞有關(guān)[23]。由于NG2細(xì)胞上存在腺苷受體，其激活又會抑制NG2的過度增殖而加速其髓鞘化過程[24]，因此在緩解期NG2的表達(dá)量顯著降低，推測可能與OPCs逐漸分化以補(bǔ)償損失的髓鞘成分有關(guān)。MBP水平的持續(xù)降低說明EAE疾病發(fā)生后，大量炎癥細(xì)胞攻擊髓鞘，導(dǎo)致髓鞘損傷，雖然髓鞘的再生發(fā)生在EAE中，但其能力是有限的。原因可能是脫髓鞘后產(chǎn)生的抑制環(huán)境，特別是影響OPCs功能的內(nèi)源性和外源性因素，如轉(zhuǎn)錄因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、抑制因子、趨化因子等異常表達(dá)，阻礙了OPCs完成髓鞘再生過程，導(dǎo)致髓鞘再生失敗[25-26]。然而補(bǔ)腎益髓方明顯降低急性期EAE小鼠NG2，升高緩解期NG2水平，同時明顯升高了急性期和緩解期MBP的表達(dá)，說明補(bǔ)腎益髓方促進(jìn)髓鞘再生的作用與OPCs增殖有關(guān)。Yang T等[27]的研究中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益髓方促進(jìn)髓鞘再生的作用還與調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄因子Olig1和Olig2有關(guān)。

綜上所述，補(bǔ)腎益髓方可減輕EAE動物的神經(jīng)損傷并促進(jìn)其髓鞘再生，這些結(jié)果為本方臨床治療MS疾病提供了依據(jù)，但其深入的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Effects ofBushenYisuiformula on promoting remyelination in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis

WANGYong-qiang，SHIYi-min，ANChen，etal.

SchoolofTraditionalChineseMedicine,BeijingKeyLabofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China

WANGLei,E-mail:tmwangl@ccmu.edu.cn

Objective To observe the effect ofBushenYisuiformula on promoting remyelination in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Methods 80 female C57BL/6 mice were randomly divided into normal control, model, prednisone acetate andBushenYisuiformula-treated groups. EAE model was established through the injection of myelin oligodendroglia glycoprotein (MOG)35-55. The mice in treatment groups were administrated administration with corresponding medicines daily for 40 days. Prednisone acetate was considered as the positive control. Animal condition was observed and neurofunctional score was recorded every day. Meanwhile, the morbidity, latency, disease course and disease burden were acquired. Luxol fast blue staining of the brain and spinal cord was performed to observe the changes of myelin. The expressions of myelin regeneration associated proteins chondroitin sulfate proteoglycan 2 and myelin basic protein (MBP) were determined by the immunohistochemistry technique. ResultsBushenYisuiformula could prolong the latent period, shorten the course, lighten the disease burden(P<0.05).It could reduce inflammatory cell infiltration and demyelination in the brain and spinal cord of EAE mice.BushenYisuicould also improve the protein expressions of NG2 and MBP(P<0.01). ConclusionBushenYisuihad neuroprotective effects on EAE mice. It was able to alleviate myelin injury and promote the recovery of myelin.

BushenYisuiformula； Experimental autoimmune encephalomyelitis； Remyelination

國家自然科學(xué)基金(81273742、81573898)；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃-長城學(xué)者項(xiàng)目(CIT&TCD20140329)

100069 北京，首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[王永強(qiáng)(碩士研究生)、師一民(碩士研究生)、安辰(碩士研究生)、趙暉、李明、齊放、張秋霞、陳振振、王蕾]；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院中醫(yī)科(樊永平)

王永強(qiáng)(1989- )，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治腦病研究。E-mail：644750798@qq.com

王蕾(1967- )，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥防治腦病研究。E-mail：tmwangl@ccmu.edu.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.12.002

2016-04-14)