氨氯地平對(duì)肺纖維化大鼠的影響研究*

陳菊屏，羅秀芳，劉茗心，范賢明，王文軍，湛曉勤

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

論著

氨氯地平對(duì)肺纖維化大鼠的影響研究*

陳菊屏，羅秀芳，劉茗心，范賢明，王文軍，湛曉勤

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

目的研究氨氯地平對(duì)大鼠肺纖維化的保護(hù)作用和可能的分子機(jī)制，為肺纖維化的治療尋找新的途徑。方法選取240只實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行研究，隨機(jī)分為空白組、模型組、吡非尼酮組和氨氯地平組，每組各60只。模型組、吡非尼酮組和氨氯地平組采用氣管內(nèi)灌注博來霉素建立肺纖維化大鼠模型，空白組則氣管內(nèi)灌注等量生理鹽水；然后空白組和模型組大鼠給予相同量生理鹽水處理，氨氯地平組大鼠則給予1/2量的氨氯地平和1/2量的生理鹽水處理；吡非尼酮組給予1/2量的吡非尼酮和1/2量的生理鹽水處理。采用單因素方差分析和u檢驗(yàn)分析1、2及4周后4組大鼠肺泡炎、肺纖維化的評(píng)分，并分析大鼠的血小板反應(yīng)蛋白1（TSP-1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）及I型膠原和III型膠原mRNA的含量變化情況。結(jié)果氨氯地平組和吡非尼酮組大鼠各時(shí)間段的TSP-1、TGF-β1及I型膠原和III型膠原mRNA的含量均低于模型組（P＜0.05），且氨氯地平組較吡非尼酮組也降低（P＜0.05），大鼠的肺泡炎和肺纖維化評(píng)分結(jié)果顯示氨氯地平組和吡非尼酮組低于模型組（P＜0.05），且氨氯地平組顯著低于吡非尼酮組（P＜0.05）。結(jié)論氨氯地平可能通過抑制TGF-β1、TSP-1的生成水平和減少I型膠原和III型膠原mRNA的表達(dá)達(dá)到減輕大鼠肺組織肺泡炎及肺纖維化程度的臨床效果。

氨氯地平；吡非尼酮；博來霉素；肺纖維化

肺纖維化[1]（pulmonary fibrosis，PF）多累及肺間質(zhì)、肺泡和細(xì)支氣管。最顯著特征[2-3]為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞聚集、成纖維細(xì)胞（Fibroblast，F(xiàn)B）增生、細(xì)胞外基質(zhì)增加、膠原蛋白沉積等，起病初多有肺泡及間質(zhì)非特異性炎癥改變，繼之出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)損害，反復(fù)發(fā)生，呈新舊病灶并存現(xiàn)象。該病發(fā)病率較高，傳統(tǒng)的一線治療藥物糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞毒類藥物治療效果不好。大量文獻(xiàn)顯示[4-5]，氨氯地平能明顯抑制心肌以及腎臟和肝臟的纖維化進(jìn)程，故其可能對(duì)肺纖維化形成有一定的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)[6]肺纖維化大鼠模型I、III膠原mRNA含量、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）含量是增高的，但仍不能作為PF確診的依據(jù)。而另有研究[7-8]認(rèn)為血小板反應(yīng)蛋白1（thrombos pondin 1，TSP1）在組織纖維化的發(fā)展中起到重要作用，可作為診斷纖維化形成的參考指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)擬通過觀察氨氯地平干預(yù)下肺纖維化大鼠上述指標(biāo)含量變化，以及對(duì)肺泡炎、肺纖維化的評(píng)分方面的影響，以期發(fā)現(xiàn)氨氯地平在肺纖維化方面的作用與可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇健康的SD大鼠240只。材料選自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)scxk[（川）2013-17]，鼠齡均為同批次6周大鼠，平均體重為（208±41）g。藥物選擇：博來霉素（15 mg/支，批號(hào)Y32480，日本化藥株式會(huì)社），氨氯地平（中國大連輝瑞制藥有限公司）。病理切片機(jī)（型號(hào)：LEICA KM I135德國石蠟切片機(jī)），光鏡（型號(hào)：LEICA DM LB德國顯微鏡），日本OLYMPUS全自動(dòng)顯微攝像系統(tǒng)，Q520圖像分析儀（英國Cambridge公司），MIAS-300mRNA圖像分析軟件（四川大學(xué)）。

1.2 建立大鼠模型

將240只健康大鼠分為4組（空白組、模型組、吡非尼酮組及氨氯地平組），每組各60只。所有大鼠喂養(yǎng)1周后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先完成大鼠麻醉：按照0.35 ml/100 g體重行腹腔注射10%水合氯醛[9]，麻醉完成后將大鼠固定于鼠板成仰臥位，經(jīng)18號(hào)氣管插管完成大鼠外置氣道的建立，放置碎棉絮實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠的氣道通暢情況。空白組經(jīng)氣道注入生理鹽水（按照1 ml/kg體重），模型組、吡非尼酮組及氨氯地平組均經(jīng)氣道注入相同質(zhì)量的博來霉素A5完成模型的制備。完畢后立即將動(dòng)物直立、旋轉(zhuǎn)，動(dòng)物清醒可后隨意進(jìn)食作為模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)[10]?？瞻捉M和模型組經(jīng)食道灌注生理鹽水（按照5 mg/kg體重），吡非尼酮組及氨氯地平組（按照生理鹽水∶藥物=1∶1）灌注等量相應(yīng)藥物。所有模型建立完成后的1、2及4周分別處死4組大鼠各20只。

1.3 大鼠組織病理切片和染色

取出處死動(dòng)物肺臟進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋[11]，采用病理切片機(jī)連續(xù)組織切片（厚4μm，型號(hào)：LEICA KM I135德國石蠟切片機(jī)），取切片完成HE染色和三色（Masson）染色，光鏡（型號(hào)：LEICA DM LB德國顯微鏡）和日本OLYMPUS全自動(dòng)顯微攝像系統(tǒng)做圖像采集，觀察肺組織變化情況。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)TGF-β1和TSP-1

將石蠟切片行脫水脫蠟處理，70%酒精潤(rùn)洗行PAP法[12]染色，選擇Im-30634大鼠TGF-β1免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒和Im-30208大鼠血小板反應(yīng)蛋白/凝血酶敏感蛋白1免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析（上述材料均選自上海雅吉生物科技有限公司）。對(duì)于染色結(jié)果則使用Q520圖像分析儀（英國Cambridge公司）進(jìn)行定量檢測(cè)。高倍鏡下根據(jù)不同的表達(dá)部位選擇5個(gè)視野，計(jì)算平均光密度。

1.5 I型膠原和III型膠原mRNA含量檢測(cè)

Northern印跡分子雜交法[13]完成對(duì)I、III型膠原mRNA的測(cè)驗(yàn)，方法依照杜衛(wèi)東等[14]對(duì)肝纖維化α1（I）和α1（III）前膠原mRNA表達(dá)的測(cè)驗(yàn)，膠原重組質(zhì)粒由美國Mon-li Chu博士提供。采用MIAS-300圖像分析軟件（材料選自四川大學(xué)）對(duì)雜交后圖像進(jìn)行分析，分別計(jì)算出I、III型膠原mRNA的相對(duì)含量。

1.6 肺纖維化和肺泡炎評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)

參照文獻(xiàn)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[15]分為4級(jí)：0級(jí)表示無明顯肺纖維化或炎癥病灶出現(xiàn)；I級(jí)表示肺纖維化或炎癥程度達(dá)全肺的20%；II級(jí)表示肺纖維化或炎癥程度達(dá)全肺的20%～50%；III級(jí)表示肺纖維化或炎癥程度達(dá)全肺的5%以上。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)描述。計(jì)量資料組間比較采用方差分析，對(duì)等級(jí)資料使用非秩和秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)）進(jìn)行組間分析，兩兩比較則采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺纖維化程度（Masson染色）評(píng)分

模型組大鼠隨著時(shí)間的推移，肺纖維化嚴(yán)重程度逐漸加重，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組較空白組肺纖維化程度均加重（P＜0.05），說明建立大鼠模型成功，博來霉素對(duì)大鼠肺組織的影響明顯。第1周剩余3組間的肺纖維化程度相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第2周時(shí)氨氯地平組纖維增生較對(duì)照組和吡非尼酮組均減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第4周時(shí)氨氯地平組較模型組纖維增生減輕（P＜0.05），吡非尼酮組較模型組纖維增生減輕（P＜0.05），氨氯地平組較吡非尼酮組纖維增生減輕（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 肺纖維化程度評(píng)分比較（n=60，例）

圖1 大鼠肺纖維化Masson染色（40×10）

表2 肺泡炎程度評(píng)分比較（n=60，例）

2.2 大鼠肺泡炎程度（HE染色）評(píng)分

炎癥反應(yīng)的發(fā)生具有突然性，在本次試驗(yàn)中完成灌注后的一段時(shí)間內(nèi)均有炎癥出現(xiàn)。但空白組大鼠在3個(gè)時(shí)間段的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度均低于其余3組（P＜0.05）。隨著時(shí)間推移模型組炎癥反應(yīng)得到一定改善，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第2周和第4周時(shí)，氨氯地平組和吡非尼酮組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度、肺泡間隔增寬范圍均低于模型組（P＜0.05）。見表2。

2.3 大鼠TGF-β1和TSP-1含量

3個(gè)時(shí)間點(diǎn)空白組較其他3組TGF-β1和TSP-1均較低（P＜0.05）；模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的TGF-β1和TSP-1含量均高于氨氯地平組和吡非尼酮組（P＜0.05）；且氨氯地平組較吡非尼酮組大鼠各時(shí)間段TGF-β1和TSP-1含量降低（P＜0.05）。見表3。免疫組織化學(xué)見圖2。

2.4 大鼠I型膠原和III型膠原mRNA含量

3個(gè)時(shí)間點(diǎn)空白組較其他3組I、III型膠原mRNA含量均較低（P＜0.05）；模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)均高于氨氯地平組和吡非尼酮組（P＜0.05）；且氨氯地平組較吡非尼酮組大鼠各時(shí)間段含量降低（P＜0.05）。見表4。

表3 TGF-β1和TSP-1含量（IOD）比較（±s）

表3 TGF-β1和TSP-1含量（IOD）比較（±s）

注：1）空白組與其他3組比較，P＜0.05；2）模型組與氨氯地平組和吡非尼酮組比較，P＜0.05；3）氨氯地平組與吡非尼酮組比較，P＜0.05

組別第1周第2周第4周TGF-β1TGF-β1TGF-β1TSP-1空白組8.48±0.211）4.42±0.151）8.83±0.231）4.37±0.111）8.56±0.271）4.51±0.161）TSP-1TSP-1模型組氨氯地平組167.37±5.872）142.45±4.433）148.67±25.522）114.58±21.133）178.28±5.332）94..33±4.123）152.26±41.182）88.20±16.583）183.34±4.482）11.35±2.283）136.35±38.852）74.82±1.153）吡非尼酮組152.42±4.28133.96±22.45112.36±4.63109.01±23.3119.97±4.4520.23±0.97 F值，P值5968.410，0.000214.254，0.0005827.97，0.000122.659，0.00012852.240，0.000189.025，0.000空白組vs模型組（t值，P值）-118.06，0.000-22.795，0.000-131.053，0.000-18.654，0.000-164.521，0.000-21.456，0.000空白組vs氨氯地平組（t值，P值）-99.549，0.000-17.408，0.000-66.126，0.000-10.574，0.000-2.626，0.010-11.442，0.000空白組vs吡非尼酮組（t值，P值）-106.957，0.000-20.471，0.000-80.070，0.000-13.199，0.000-10.740，0.000-2.558，0.013模型組vs氨氯地平組（t值，P值）18.517，0.0005.387，0.00064.927，0.0008.080，0.000161.895，0.00010.014，0.000模型組vs氨氯地平組（t值，P值）11.109，0.0002.325，0.02350.983，0.0005.455，0.000153.781，0.00018.898，0.000氨氯地平組vs吡非尼酮組（t值，P值）-7.408，0.000-3.063，0.003-13.944，0.000-2.625，0.010-8.114，0.0008.884，0.000

圖2 TGF-β1和TSP-1免疫組織化學(xué)染色（40×10）

表4 I、III型膠原mRNA含量比較（±s）

表4 I、III型膠原mRNA含量比較（±s）

注：1）空白組與其他3組比較，P＜0.05；2）模型組與氨氯地平組和吡非尼酮組比較，P＜0.05；3）氨氯地平組與吡非尼酮組比較，P＜0.05

組別第1周第2周第4周I型I型I型III型空白組0.57±0.061）0.68±0.101）0.56±0.051）0.67±0.091）0.56±0.081）0.66±0.111）III型III型模型組氨氯地平組0.77±0.052）0.64±0.053）0.89±0.112）0.76±0.083）0.81±0.042）0.65±0.073）0.95±0.112）0.81±0.103）0.88±0.052）0.63±0.043）0.99±0.122）0.74±0.083）吡非尼酮組0.71±0.040.83±0.070.74±0.110.88±0.080.77±0.090.81±0.10 F值，P值58.758，0.00019.641，0.00044.739，0.00031.238，0.00088.029，0.00036.923，0.000空白組vs模型組（t值，P值）-12.525，0.000-7.267，0.000-10.885，0.000-9.257，0.000-14.840，0.000-10.077，0.000空白組vs氨氯地平組（t值，P值）-4.384，0.000-2.769，0.007-3.919，0.000-4.628，0.000-3.246，0.000-2.443，0.000空白組vs吡非尼酮組（t值，P值）-8.767，0.000-5.191，0.000-7.837，0.000-6.942，0.000-9.739，0.000-4.580，0.000模型組vs氨氯地平組（t值，P值）8.141，0.0004.499，0.0006.966，0.0004.628，0.00011.594，0.0007.634，0.000模型組vs氨氯地平組（t值，P值）3.757，0.0002.076，0.0413.048，0.0032.314，0.0235.101，0.0005.496，0.000氨氯地平組vs吡非尼酮組（t值，P值）-4.384，0.000-2.422，0.018-3.919，0.000-2.314，0.023-6.492，0.000-2.138，0.000

3 討論

氨氯地平是一種長(zhǎng)效的鈣離子拮抗劑，半衰期約23 h，除了其可靠的降動(dòng)脈壓及極低的毒副作用以外，它在逆轉(zhuǎn)心肌的纖維化也有不俗的表現(xiàn)，可能與其抑制早期增生反應(yīng)基因c-myc、c-fos和c-jun和激活抗增生基因有關(guān)[16]。另外，也有資料表明氨氯地平可一定程度改善腎纖維化，可能是因?yàn)槠淠芤种朴裳芫o張素II（AngII）及血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）誘導(dǎo)的SHR大鼠腎小球系膜細(xì)胞的肥大與增殖有關(guān)[17]。氨氯地平在肝纖維化的減輕也有值得稱道的地方。因此，本研究認(rèn)為在肺纖維化方面，氨氯地平也有可能起到抑制肺纖維化發(fā)展的作用。盡管在既往的研究中發(fā)現(xiàn)[18]，肺纖維化大鼠模型I、III膠原mRNA含量、TGF-β1含量是增高的，但仍不能作為PF確診的依據(jù)。研究[19]中發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)展過程中，TSP1表達(dá)顯著上調(diào)，其改變程度與腎功能損害密切相關(guān)。學(xué)者們根據(jù)腎間質(zhì)與肺間質(zhì)在組織學(xué)發(fā)生上的同源性[20]，考慮在肺纖維化的進(jìn)程中，是否存在TSP1的密切相關(guān)以及在其診斷中的地位的研究已成為組織纖維化研究中新的熱點(diǎn)。TSP1又稱血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白，由789個(gè)氨基酸殘基組成，存在于血小板的α顆粒體和內(nèi)皮細(xì)胞Weibei-Palade小體（棒狀小體）內(nèi)，在化學(xué)因子刺激下，α顆粒體和棒狀小體迅速與胞膜融合而在細(xì)胞膜上表達(dá)，介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的起始黏附，在炎癥和血栓形成等方面起重要作用。

在本次實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，空白組TSP-1、TGF-β1及I型膠原和III型膠原mRNA含量較其他3組均低，說明大鼠注入博來霉素后的一段時(shí)間內(nèi)TSP-1、TGF-β1的表達(dá)均增加，且I型、III型膠原mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯增強(qiáng)。而氨氯地平組和吡非尼酮組大鼠各時(shí)間段的指標(biāo)含量低于模型組，且氨氯地平組較吡非尼酮組也降低，說明兩種藥物對(duì)上述指標(biāo)的表達(dá)有抑制作用且氨氯地平效果較吡非尼酮更顯著，而實(shí)驗(yàn)最后兩組的上述指標(biāo)水平未為達(dá)到正常水平可能的原因是注射博來霉素對(duì)大鼠肺組織帶來不可逆性損傷或者是實(shí)驗(yàn)時(shí)間不夠長(zhǎng)，藥物未達(dá)到最終療效。而大鼠肺組織纖維化masson染色和肺泡炎的HE染色顯示大鼠的肺泡炎和肺纖維化評(píng)分結(jié)果顯示：空白組較其余3組較輕，而氨氯地平組和吡非尼酮組低于模型組，且氨氯地平組低于吡非尼酮組（P＜0.05）也證實(shí)上述觀點(diǎn)。

綜上所述：氨氯地平對(duì)于人工注射博來霉素形成的肺組織纖維化和肺泡炎抑制作用顯著，可能與抑制TSP-1、TGF-β1的表達(dá)和抑制I型膠原和III型膠原mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯有關(guān)系，為氨氯地平藥物療效的臨床研究和臨床使用提供參考。

本次實(shí)驗(yàn)的不足之處在于：①忽略氣管灌注對(duì)大鼠本身肺組織帶來的損傷；②實(shí)驗(yàn)時(shí)間過短，導(dǎo)致藥物療效的證明存在弊端（無法確定藥物是否能治愈肺纖維化），應(yīng)適當(dāng)增加時(shí)限；③實(shí)驗(yàn)分組存在不科學(xué)性：可增加氨氯地平和吡非尼酮藥物聯(lián)合使用組，證實(shí)單獨(dú)使用氨氯地平的臨床療效。

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（張蕾 編輯）

Effect of Amlodipine on pulmonary fibrosis in rats*

Ju-ping Chen,Xiu-fang Luo,Ming-xin Liu,Xian-ming Fan,Wen-jun Wang,Xiao-qin Zhan
(Department of Respiratory Medicine,the Affiliated Hospital,Southwest Medical University, Luzhou,Sichuan 646000,China)

Objective To study the protective effect of Amlodipine on pulmonary fibrosis in rats and the possible molecular mechanism,so as to find new ways for the treatment of pulmonary fibrosis.Methods Totally 240 rats were divided into control group,model group,Pirfenidone group and Amlodipine group at random.The rats in the model group,Pirfenidone group and Amlodipine group were perfused with Bleomycin through trachea to build the model of pulmonary fibrosis,those in the control group were perfused with saline.Then the rats in the control and model groups were given normal saline,but the rats of the Amlodipine group and the Pirfenidone group were treated with half volume of Amlodipine and Pirfenidone respectively together with half amount of normal saline.Single factor analysis andUtest were used to analyze the pulmonary fibrosis score and alveolitis score at 1,2 and 4 weeks in the 4 groups,and also the content of thrombospondin 1(TSP-1),TGF-β1and mRNA of type I collagen and type III collagen was analyzed.Results The four indexes in the Amlodipine group and the Pirfenidone group were significantly lower than those in the model group at each time point(P＜0.05),they were obviously lower in the Amlodipine group than in the Pirfenidone group(P＜0.05).The alveolitis and pulmonary fibrosis scores in the Amlodipine and Pirfenidone groups were significantly lower than those in the model group(P＜0.05),and they were obviously lower in the Amlodipine group than in the Pirfenidone group(P＜0.05).Conclusions Amlodipine can significantly reduce lung alveolitis and pulmonary fibrosis,possibly through inhibition of TGF-β1and TSP-1 and reduction of type I and III collagen mRNA expression.

Amlodipine;Pirfenidone;Bleomycin;pulmonary fibrosis

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.22.001

1005-8982（2016）22-0001-06

2016-05-28

四川省衛(wèi)生廳項(xiàng)目（No：110343）