RD105缺失基因檢測(cè)法在結(jié)核分枝桿菌分型中的應(yīng)用※

李 斌，劉 壽，杜文琪，汪海靜，蘇效東，文國(guó)穎，梁 軍，王兆芬

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，810001 西寧)

?

RD105缺失基因檢測(cè)法在結(jié)核分枝桿菌分型中的應(yīng)用※

李 斌，劉 壽，杜文琪，汪海靜，蘇效東，文國(guó)穎，梁 軍，王兆芬*

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，810001 西寧)

目的 探討RD105缺失基因檢測(cè)法在結(jié)核分枝桿菌分型中的應(yīng)用。方法 133株結(jié)核分枝桿菌分別采用Spoligotyping分型法和RD105基因缺失法鑒別北京基因型。結(jié)果 133株結(jié)核分枝中114株為北京基因型，占85.7%，19株為非北京基因型，占14.3%，經(jīng)RD105缺失基因檢測(cè)133株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，115株為北京基因型，占86.4%，18株為非北京基因型，占13.6%，Spoligotyping基因分型法與RD105缺失基因檢測(cè)法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.333，P=0.563)，RD105缺失基因檢測(cè)法的靈敏度為99.1%，特異度為89.5%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.3%，陰性預(yù)測(cè)值為94.4%。ROC曲線下面積為0.943。結(jié)論 RD105基因缺失法檢測(cè)可以替代Spoligotyping基因分型法。

結(jié)核分枝桿菌 RD105 Spoligotyping ROC曲線下面積

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)基因型分型技術(shù)在該病的流行病學(xué)研究中起到了重要的作用，通過(guò)對(duì)MTB的分型可以判斷出該區(qū)域流型菌株的類型、病例與病例之間的關(guān)系等。MTB中有一組具有相似遺傳特征的北京型基因(Beijing genotype)。之前有研究表明青海省流行菌株為北京基因型[1]。北京基因型菌株是一類源于共同祖先的后代菌株，自1995年有van Soolingen等首次報(bào)道以來(lái)，全球已發(fā)現(xiàn)該菌株的流行，在亞洲地區(qū)該菌株為主要流行菌株。近年來(lái)隨著研究深入，研究者發(fā)現(xiàn)在北京基因型中RD105存在缺失區(qū)域，提出了RD105可以作為北京基因型菌株的分子標(biāo)志物[2]。本研究采用基于PCR法的RD105缺失檢測(cè)法和間隔區(qū)寡核苷酸分型方法(spacer oligonucleotide typing，Spoligotyping)對(duì)青海省133株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行基因分型，探討RD105基因缺失檢測(cè)法在結(jié)核分枝桿菌基因分型中的運(yùn)用。

1 材料與方法

1.1 菌株

133株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv由青海省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 DNA

用生理鹽水從L-J培養(yǎng)基的斜面上洗脫菌體，80 ℃孵育30 min滅活，離心(12000r/min)3 min，棄上清收集菌體，用500 μL生理鹽水充分懸浮、100 ℃水浴1 h，離心(12000r/min)5 min取上清即為PCR擴(kuò)增模板。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑盒、儀器

2×Taq Master Mix、0.5×TBE、DNA MarkerⅡ(北京天根生物公司)，凝膠成像儀(Bio-RAD，USA)。

1.4 Spoligotyping基因分型法與RD105缺失基因檢測(cè)法

1.4.1 Spoligotyping基因分型法

DR區(qū)引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件及43個(gè)寡核苷酸探針設(shè)計(jì)參照參考文獻(xiàn)[3]，將Spoligotyping結(jié)果進(jìn)行數(shù)字轉(zhuǎn)化，并通過(guò)SpolDB4.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析確定菌株的類型。

1.4.2 RD105缺失基因檢測(cè)法

引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[4]，RD105F：CAAGGTACGGCGGCTGGGGATTC；RD105R：GCGGCGGGGTTAAACAGGGTGAT。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 1 min；變性94 ℃ 30 s；退火68 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 285 s，26個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃ 10 min。取10 μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，用DNA Marker確定其分子相對(duì)量，以標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為對(duì)照。目的片段為408 bp，出現(xiàn)此片段為非北京基因型，未出現(xiàn)此片段為北京基因型。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

所得資料采用Stata10.0軟件進(jìn)行分析，兩種方法比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，分別計(jì)算靈敏度(sensitivity)、特異度(specificity)、預(yù)測(cè)值(predictive value)、ROC曲線下面積(the area under the ROC curve)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Spoligotyping基因分型法結(jié)果

用Spoligotyping基因分型法，通過(guò)SpolDB4.0數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析。H37Rv雜交結(jié)果為20、21，33～36位點(diǎn)陰性，其余位點(diǎn)均為陽(yáng)性。1～34位點(diǎn)陰性，35～43陽(yáng)性者為典型北京家族基因型(Beijing genotype)，35～43位點(diǎn)間或缺失，但陽(yáng)性位點(diǎn)至少有4個(gè)為北京基因型(Beijing-like)或非典型北京家族基因型。以上兩種基因型統(tǒng)稱為北京家族基因型。133株結(jié)核分枝中114株為北京基因型，占85.7%，19株為非北京基因型，占14.3%。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 部分Spoligotyping基因分型結(jié)果

Figure 1 The partial results of genotypic identification with Spoligotyping test

2.2 RD105缺失基因檢測(cè)法結(jié)果

用RD105缺失基因法，檢測(cè)133株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，115株為北京基因型，占86.4%，18株為非北京基因型，占13.6%。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 RD105檢測(cè)結(jié)果

Figure 2 The result of RD105 deletion test

2.3 RD105缺失基因檢測(cè)北京型菌株的評(píng)價(jià)效果

Spoligotyping基因分型法是檢測(cè)北京型基因的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，故采用此方法來(lái)評(píng)價(jià)RD105缺失基因檢測(cè)法。兩種方法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.333，P=0.563)。RD105缺失基因檢測(cè)法的靈敏度為99.1%，特異度為89.5%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.3%，陰性預(yù)測(cè)值為94.4%。ROC曲線下面積為0.943。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Evaluation of Beijing type strain

3 討論

傳統(tǒng)的流行病學(xué)方法只能從疾病的“三間分布”了解情況，不能很好地揭示結(jié)核病的傳播規(guī)律。分子生物學(xué)DNA指紋技術(shù)，與傳統(tǒng)的傳染病流行病學(xué)研究相結(jié)合，可以確定傳染病的起源、傳播、分布、消長(zhǎng)和流行規(guī)律[6]。傳統(tǒng)的分型技術(shù)包括藥敏分型、生物化學(xué)多樣性等方法，但這些方法存在諸多缺陷。隨著研究者們?cè)诮Y(jié)核分子流行病研究技術(shù)上的不斷深入，分子分型技術(shù)現(xiàn)今成為結(jié)核病流行病學(xué)的主要研究方法之一?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)以其簡(jiǎn)便、快捷、敏感性好和特異性高而廣泛應(yīng)用。其中IS6110-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，IS6110-RFLP)、多位點(diǎn)可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列分析(multiple loci VNTR analysis，MLVA)及Spoligotyping分析等已成為結(jié)核菌株分型的重要方法。

IS6110-RFLP是國(guó)際一致公認(rèn)的DNA分型方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但I(xiàn)S6110-RFLP分型方法需要提取結(jié)核菌大量的DNA，獲得結(jié)果的時(shí)間長(zhǎng)，且結(jié)果的重復(fù)性和比較性較差，對(duì)于IS6110拷貝小于5個(gè)或無(wú)拷貝結(jié)核菌株分辨能力差，需要一些特殊的軟件分析結(jié)果，影響了該方法的推廣。

可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable-number tandem repeat，VNTR)存在高度多態(tài)性，DNA片段高度重復(fù)。因此將多個(gè)VNTR位點(diǎn)聯(lián)合起來(lái)可提高鑒別能力，即MLVA，其基因分型方法的辨識(shí)能力幾乎等同于以IS6110為基礎(chǔ)的基因分型，但該技術(shù)簡(jiǎn)便快速，可操作性強(qiáng)。不但彌補(bǔ)了IS6110-RFLP基因分型技術(shù)在低拷貝菌株分型中的不足，而且它一般不需用高度純化的DNA，可直接使用結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)物。且結(jié)果是數(shù)字化的，易于建立數(shù)據(jù)庫(kù)，便于與其他菌株間的比較。但與Spoligotyping分型方法比較顯得工作過(guò)于繁重。

Spoligotyping基本原理是基于直接重復(fù)區(qū)(direct repeat，DR)的多態(tài)性，DR區(qū)只出現(xiàn)于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，由若干個(gè)保守的長(zhǎng)為36 bp的直接重復(fù)序列組成，并被間隔區(qū)分開(kāi)，每個(gè)間隔區(qū)序列長(zhǎng)為35～41 bp，不同的MTB菌株在43個(gè)間隔區(qū)存在不同的序列，由此可對(duì)MTB進(jìn)行鑒別。該方法是一種獨(dú)特的以PCR為基礎(chǔ)的分子分型方法，其操作簡(jiǎn)便、結(jié)果易于數(shù)字處理、可重復(fù)性高、分型效果穩(wěn)定并且具有較豐富的多態(tài)性，在世界范圍內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用。

而近些年通過(guò)比較基因組學(xué)的一些方法發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌的基因上存在片段缺失，這些容易發(fā)生缺失的片段稱為L(zhǎng)arge sequence polymorphism或Regions of Difference，簡(jiǎn)稱LSP或RD。有學(xué)者以RD為分類靶標(biāo)研究全球范圍收集的結(jié)核分枝桿菌，發(fā)現(xiàn)全球結(jié)核分枝桿菌的流行具有明顯地域性，并據(jù)此將結(jié)核分枝桿菌分為6個(gè)具有進(jìn)化關(guān)系的分化支：印度-大洋洲系(Indo-Oceanic)，東亞系(East Asian)、東非-印度系(East African-Indian)、歐美系(Euro-American)、西非-1系(West African 1)和西非-2系(West African 2)[7]。該方法基于PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)，且單次的實(shí)驗(yàn)方法在技術(shù)、人力、物力和財(cái)力等方面要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Spoligotyping分型方法。

RD105基因缺失存在于北京基因型，在非北京基因型非常罕見(jiàn)[2]。RD105基因缺失檢測(cè)方法基于PCR技術(shù)，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，易操作，對(duì)于結(jié)果不需要特殊的軟件進(jìn)行分析，易于實(shí)施。本研究采用該技術(shù)對(duì)于133株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行分型，結(jié)果115株(86.4%)為北京基因型，18株(13.6%)為非北京基因型。而采用Spoligotyping分型方法進(jìn)行菌株分型，133株結(jié)核分枝中114株為北京基因型，占85.7%，19株為非北京基因型，占14.3%。

王娟[8]等人通過(guò)比較兩種方法得到二者的Kappa值為0.8，提示RD105不能完全替代Spoligotyping。但是本研究通過(guò)Spoligotyping基因分型法評(píng)價(jià)RD105基因缺失法檢測(cè)，靈敏度為99.1%，特異度為89.5%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.3%，陰性預(yù)測(cè)值為94.4%。ROC曲線下面積為0.943，兩種檢測(cè)方法比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.333，P=0.563)，說(shuō)明RD105基因缺失法檢測(cè)可以替代Spoligotyping基因分型。這與劉敬華[9]等人研究結(jié)果一致，RD105與Spoligotyping檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)100.0%，Kappa值為1.0。

診斷實(shí)驗(yàn)是一種評(píng)價(jià)診斷方法準(zhǔn)確性和重要性的研究方法。其目的是通過(guò)“金標(biāo)準(zhǔn)”去評(píng)價(jià)待檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。在診斷實(shí)驗(yàn)中靈敏度和特異度能很好反映診斷實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，這兩個(gè)指標(biāo)越接近100.0%，顯示準(zhǔn)確性越高。而預(yù)測(cè)值同樣也是評(píng)價(jià)診斷實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的指標(biāo)，該指標(biāo)受到靈敏度和特異度的影響，會(huì)隨著靈敏度和特異度的升高或降低而發(fā)生改變。ROC曲線綜合反映診斷實(shí)驗(yàn)對(duì)待評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法診斷價(jià)值。并且ROC曲線兼顧了靈敏度和特異度，通過(guò)對(duì)ROC曲線下的面積大小來(lái)判斷診斷實(shí)驗(yàn)的優(yōu)良性。ROC曲線下面積接近1，診斷實(shí)驗(yàn)效果越好。反之，接近0.5，診斷效果越差。而本研究所得結(jié)果顯示，靈敏度和特異度均接近100.0%，預(yù)測(cè)值也在90.0%以上，ROC曲線下面積也接近1，說(shuō)明RD105基因缺失檢測(cè)法對(duì)MTB進(jìn)行北京基因型和非北京基因型鑒別效果良好，存在誤差較小。

綜上所述，RD105基因缺失法與Spoligotyping基因分型法比較存在簡(jiǎn)便易行，讀取結(jié)果方便，不需要借助其他軟件進(jìn)行分析的優(yōu)點(diǎn)，比Spoligotyping基因分型法更加可行。因此，RD105基因缺失法可以替代Spoligotyping基因分型法。

[1]李斌，劉海燦，王兆芬，等.青海省結(jié)核分枝桿菌臨床分離株可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列基因多態(tài)性研究[J].中華流行病學(xué)雜志，2015，36(10)：1158-1161.

[2]劉桂艷，張煒煜，王博，等.RD105基因缺失法鑒定95株結(jié)核分枝桿菌北京基因型及其耐藥相關(guān)性分析[J].中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué).2012，11(5)：363-365.

[3]王兆芬，李斌，馬永成，等.青海省結(jié)核分枝桿菌的間隔寡核苷酸分型研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2015，49(6)：565-567.

[4]李斌，文飛，劉壽，等.RD105缺失基因檢測(cè)法用于青海省北京/W系結(jié)核分枝桿菌鑒定[J].廣州醫(yī)藥，2015，46(5)：11-14.

[5]Dong H，Shi L，Zhao X，et al.Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from Tibetans in Tibet，China[J].PLoS One，2012，7(3)：e33904.

[6]文建強(qiáng)，田衛(wèi)花，劉志廣，等.結(jié)核分枝桿菌臨床分離株MLVA法分型分析[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2012，28(8)：1081-1083.

[7]Gagneux S，DeRiemer K，Van T，et al.Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis.ProcNatlAcadSci USA[J].2006，103(5)：2869-2873.

[8]Wang J，Liu Y，Zhang CL，et al.Genotypes and characteristics of clustering and drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis isolates collected in Heilongjiang Province，China[J].Journal of clinical microbiology，2011，49(4)：1354-1362.

[9]Liu JH，Liu Y，Zhang CL，et al.Genotypes and characteristics of clustering and drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis isolates collected in Heilongjiang Province，China[J].Journal of clinical microbiology，2013，49(3)：1356-1362.

Identification of the Mycobacterium tuberculosis detected by RD105 deletion test※

Li Bin，Liu Shou，Du Wenqi，Wang Haijing，SuXiaodong，Wen Guoying，Liang Jun，Wang Zhaofeng※

(Dept.Of Public Health，Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai 810001)

Objective To identify theMycobacteriumtuberculosisdetected by RD105 deletion test.Methods 133 strains of M.tuberculosiswere identified with Spoligotyping testand RD105 deletion test respectively to classify the Beijing genotype.Results Of the 133 clinical isolates ofM.Tuberculosis，114 strains(85.7%)were belonged to the Beijing genotype，and 19strains(14.3%)were belonged to the non-Beijing genotype identified by the Spoligotyping test.While 115 strains(86.4%)were belonged to the Beijing genotype and 18strains(13.6%)were belonged to the non-Beijing genotype identified by the RD105 deletion test.There were no significant differences between the two kinds of test(χ2=0.333，P=0.563).The sensitivity，specificity，positive predictive value，negative predictive value and ROC curve area of the RD105 deletion test were 99.1%，89.5%，98.3%，94.4%，0.943，respectively.Conclusions RD105 deletion testcan replace the Spoligotyping test.

MycobacteriumtuberculosisRD105 deletion test Spoligotyping test the area under the ROC curve

※：國(guó)家自然科學(xué)基金(81160356)；青海省科技廳自然科學(xué)基金(2014-ZJ-910)；青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中青年科研基金(2013-KY-02)；*：通訊作者，E-mail：kristy@126.com 李 斌(1983～)男，蒙古族，河北籍，講師，碩士

R735.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.007

2015-12-12