家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因的生物信息學(xué)分析

王文棟, 束梅影, 張達(dá)艷, 徐世清*

(1. 河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北張家口075000； 2. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州215123)

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DOI:10.11984/j.issn.1000-7083.20150316

家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因的生物信息學(xué)分析

王文棟1, 束梅影2, 張達(dá)艷2, 徐世清2*

(1. 河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北張家口075000； 2. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州215123)

晝夜節(jié)律是最普遍的生物節(jié)律現(xiàn)象，受遺傳基因調(diào)控，其分子機(jī)制在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中有較為深入的研究，在其他昆蟲(chóng)中的研究相對(duì)較少。家蠶Bombyxmori的滯育是對(duì)晝夜節(jié)律授時(shí)因子響應(yīng)的一種現(xiàn)象，可作為研究的參照。通過(guò)電子克隆的方法獲得了家蠶生物鐘基因Bmvri，Bmcyc，Bmtim2，Bmpdp完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)序列，以及Bmclk基因的ORF片段，并對(duì)上述基因及其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析、染色體定位和系統(tǒng)的分子進(jìn)化分析，根據(jù)這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征結(jié)合現(xiàn)有的數(shù)據(jù)資源，整合了家蠶晝夜節(jié)律生物鐘反饋環(huán)路。

家蠶；晝夜節(jié)律；生物鐘；生物信息學(xué)；分子進(jìn)化

晝夜節(jié)律(circadian rhythm)又稱近日節(jié)律，是最普遍的生物節(jié)律現(xiàn)象，受遺傳基因調(diào)控，是生物體生命活動(dòng)以近24 h為周期的變動(dòng)。無(wú)論是單細(xì)胞生物，還是高等動(dòng)植物均具有晝夜節(jié)律現(xiàn)象。昆蟲(chóng)晝夜節(jié)律生物鐘的分子機(jī)制在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中有較為深入的研究，在其他昆蟲(chóng)中的研究相對(duì)較少(Williams & Sehgal，2001)。目前在果蠅中已確認(rèn)的主要晝夜節(jié)律生物鐘基因有周期蛋白基因(Period，Per)、永恒蛋白基因(Timeless，Tim1)、時(shí)鐘蛋白基因(Clock，Clk)、周期循環(huán)蛋白基因(Cycle，Cyc)、旋轉(zhuǎn)蛋白基因(Vrille，Vri)和隱花色素基因(Cryptochrome，Cry)等(Young，2000)。盡管不同物種中生物鐘基因的結(jié)構(gòu)和功能存在著某些細(xì)節(jié)差異，但它們的基本反饋環(huán)路是非常保守的(Sauman & Reppert，1996；Rubinetal.，2006；Coddetal.，2007)。

昆蟲(chóng)的晝夜節(jié)律生物鐘基因不僅是驅(qū)動(dòng)自身生理和行為晝夜節(jié)律輸出的分子基礎(chǔ)(Hall，2003)，還調(diào)控了多種近年節(jié)律生物行為的時(shí)相，例如滯育和遷徙等(Saunders，2002)，這些現(xiàn)象可成為研究晝夜節(jié)律生物鐘基因的參照。目前，大紅斑蝶Danausplexippus已經(jīng)成為研究晝夜節(jié)律生物鐘在昆蟲(chóng)遷徙過(guò)程中導(dǎo)航作用的模式物種(Reppert，2006)。而昆蟲(chóng)滯育的季節(jié)性則是研究昆蟲(chóng)對(duì)光周期響應(yīng)的典范。

家蠶Bombyxmori是卵滯育鱗翅目昆蟲(chóng)，其滯育發(fā)生在胚胎初期，受親代胚胎發(fā)育后期與胚后時(shí)期晝夜節(jié)律授時(shí)因子(溫度和光照等)的誘導(dǎo)，是一種典型的對(duì)外界環(huán)境特征主動(dòng)適應(yīng)的現(xiàn)象。目前家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因Cry1、Cry2、Per和Tim已經(jīng)完成了克隆和鑒定(Iwaietal.，2006；王文棟等，2011)，其在不同光照條件下的組織表達(dá)已經(jīng)有所研究，但關(guān)于家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因的研究還是相對(duì)較少，而家蠶的滯育是對(duì)晝夜節(jié)律授時(shí)因子(溫度和光照等)響應(yīng)的一種現(xiàn)象，這為研究家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因提供了一個(gè)很好的參照。在家蠶中是否具有與果蠅或大紅斑蝶類似的生物鐘基因網(wǎng)絡(luò)呢？對(duì)家蠶晝夜節(jié)律生物鐘相關(guān)基因的克隆和鑒定，最終獲得基因反饋環(huán)路是我們研究的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料

電子克隆、基因結(jié)構(gòu)及分子進(jìn)化分析所使用的表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags, EST)、全基因組鳥(niǎo)槍法(whole genome shotgun, WGS)和蛋白序列均來(lái)自美國(guó)國(guó)家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2 電子克隆

家蠶Bmvri、Bmpdp、Bmcyc、Bmtim2和Bmclk基因的電子克隆分別以柞蠶AntheraeaperhyiVRI蛋白序列(登錄號(hào)：AAS92609)、黑腹果蠅PDP蛋白序列(登錄號(hào)：AAF20153)、黑腹果蠅CYC蛋白序列(登錄號(hào)：AAF49107)、黑腹果蠅TIM2蛋白序列(登錄號(hào)：AAF54908)和柞蠶CLK蛋白序列(登錄號(hào)：AAR14936)作為質(zhì)詢序列在家蠶的ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行tblastn比對(duì)，檢索出與質(zhì)詢序列有同源性或有部分重疊的ESTs(同源長(zhǎng)度≥100 bp，同源性在50%以上，85%以下)，用DNAstar軟件中的SeqMan將檢出序列拼接成Contig，再用Contig為質(zhì)詢序列進(jìn)行nblast檢索和Contig的拼接和校對(duì)，直至沒(méi)有新的EST 可供拼接為止。利用DNAstar軟件的EditSeq尋找Contig中的開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)，用Translation tool將它們翻譯成蛋白序列。

1.3 基因結(jié)構(gòu)和染色體定位分析

應(yīng)用NCBI提供的blastn界面，將克隆獲得的家蠶Bmvri，Bmcyc，Bmtim2和Bmpdp基因的ORF序列在家蠶WGS數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確定外顯子、內(nèi)含子區(qū)域，進(jìn)一步用Sim4在線工具(Floreaetal.，1998)進(jìn)行驗(yàn)證，利用GSDS(郭安源等，2007)繪制基因結(jié)構(gòu)圖?；蛉旧w定位采用SilkDB數(shù)據(jù)庫(kù)(Xiaetal.，2004)提供的在線分析軟件SilkMap。采用蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器ExPASy(Gasteigeretal.，2003)提供的Translate tool界面將ORF轉(zhuǎn)化為蛋白序列。

1.4 芯片表達(dá)譜分析

將家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因的ORF序列在BmMDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://silkworm.swu.edu.cn/microarray/index.php)中進(jìn)行blast比對(duì)，尋找到目的基因的探針序列，最終獲得目的基因在5L-3d多組織(器官)中的芯片檢測(cè)表達(dá)譜，統(tǒng)計(jì)分析熒光值作為基因表達(dá)量值，繪制柱形圖。

1.5 蛋白序列分析

同源性分析和多序列比對(duì)由在線工具ClustalW(Thompsonetal.，1994)和Weblogo(Crooksetal.，2004)完成。蛋白翻譯和基序(MOTIFS)分析分別采用蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器ExPASy提供的Translate tool界面和ScanProsite分析界面。蛋白質(zhì)功能域的預(yù)測(cè)由SMART在線工具(Letunicetal.，2009)完成。

1.6 分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

應(yīng)用MEGA 4.0軟件(Tamuraetal.，2007)對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分子系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用Bootstrap Test of Phylogeny界面中的鄰接法(neighbor-joining，NJ；Saitou & Nei，1987)，5 000次重復(fù)構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行分子系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定和克隆家蠶中可能存在的晝夜節(jié)律生物鐘基因

目前已經(jīng)克隆和登錄的家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因有BmPer，BmTim1，Bmcry1和Bmcry2基因。利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)資源，電子克隆了家蠶中與果蠅其他晝夜節(jié)律生物鐘基因(Vri，Pdp，Tim2，Cyc)同源基因的完整ORF序列(長(zhǎng)度分別為：1 164 bp，858 bp，3 756 bp和1 986 bp)，以及家蠶中果蠅Clk基因的同源基因的ORF片段(1 266 bp)，根據(jù)克隆獲得的Bmvri，Bmpdp，Bmtim2和Bmcyc基因的ORF序列推導(dǎo)它們編碼產(chǎn)物BmVRI、BmCYC、BmTIM2和BmPDP蛋白的序列(表1)?？梢?jiàn)家蠶基本具有果蠅晝夜節(jié)律生物鐘基因的同源基因，這為建立家蠶的晝夜節(jié)律生物鐘網(wǎng)絡(luò)及研究其分子機(jī)制提供了序列基礎(chǔ)。

表1 家蠶基因組中存在的晝夜節(jié)律生物鐘基因

2.2 芯片檢測(cè)表達(dá)譜分析

家蠶5齡第3天10種組織(器官)的芯片檢測(cè)表達(dá)譜顯示(圖1：A，B)，Bmpdp基因在頭和中腸表達(dá)豐度最高，在脂肪體和血淋巴中較低，在睪丸、卵巢、體壁、絲腺(前、中、后部)和馬氏管中都有一定的表達(dá)。Bmtim2基因在生殖腺(睪丸、卵巢)和絲腺(前、中、后部)中表達(dá)豐度最高，在馬氏管中較低，在其他組織(器官)均有一定表達(dá)。Bmcyc基因在馬氏管和后部絲腺中表達(dá)豐度最高，在中腸和血淋巴中表達(dá)量很低，在其他組織(器官)均有一定表達(dá)。Bmvri基因在生殖腺、頭部、中腸和絲腺(前、中、后部)表達(dá)豐度最高，在脂肪體中表達(dá)量較低，在其他組織(器官)中均有一定表達(dá)。

圖1 家蠶Bmpdp，Bmtim2，Bmcyc和Bmvri基因芯片表達(dá)譜

Fig. 1 Microarray expression profiles ofBmpdp,Bmtim2,BmcycandBmvrigenes

2.3 染色體定位和基因結(jié)構(gòu)分析

2.3.1Bmvri，Bmcyc，Bmtim2和Bmpdp基因的染色體定位 染色體定位結(jié)果(圖2：A)顯示，Bmpdp基因位于家蠶第1號(hào)染色體的nscaf2734上，具體位置為(114 154～122 417) nt；Bmtim2基因位于家蠶第9號(hào)染色體的nscaf3048上，具體位置為(444 426～477 441) nt；Bmcyc基因位于家蠶第1號(hào)染色體的nscaf2734上，具體位置為(280 403～296 865) nt；Bmvri基因位于家蠶第27號(hào)染色體的nscaf3072上，具體位置為(2 451 469～24 527 593) nt。Bmpdp與Bmcyc基因位于同一條染色體的同一個(gè)nscaf上，只是具體位置存在差異。

2.3.2Bmvri,Bmcyc,Bmtim2和Bmpdp基因的結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)電子克隆拼接Bmpdp，Bmtim2，Bmcyc，Bmvri基因的ORF序列，應(yīng)用NCBI提供的blastn界面，分別在家蠶WGS全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，獲得了它們的基因結(jié)構(gòu)(圖2：B)。

Bmvri基因的ORF分布在WGS-BABH01026441上，具有2個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子。Bmpdp基因的ORF分布在WGS-BABH01031184上，具有7個(gè)外顯子，6個(gè)內(nèi)含子。Bmtim2基因的ORF分布在WGS-BABH01032134上，具有21個(gè)外顯子，20個(gè)內(nèi)含子。Bmcyc基因具有10個(gè)外顯子，9個(gè)內(nèi)含子，第1～7外顯子位于WGS-BABH01031197上，第8～10外顯子位于WGS-BABH01031193上，第7內(nèi)含子存在缺口，WGS-AADK01000483可以修補(bǔ)這個(gè)缺口，從而獲得完整的第7內(nèi)含子。這些基因的內(nèi)含子/外顯子邊界均符合GT-AG法則。

圖2 家蠶Bmpdp,Bmtim2,Bmcyc,Bmvri基因的染色體定位(A)及基因結(jié)構(gòu)分析(B)

Fig. 2 Chromosome locations (A) and structures (B) ofBmpdp,Bmtim2,BmcycandBmvrigenes

2.4 家蠶晝夜節(jié)律生物鐘蛋白的功能域及基序位點(diǎn)

2.4.1 VRI和PDP SMART分析結(jié)果(圖3：A-1，A-2)顯示，家蠶VRI(BmVRI)與黑腹果蠅VRI(DmVRI)及哺乳動(dòng)物小鼠Musmusculus的NFIL3/E4BP4(MmNFIL3/E4BP4)都具有bZIP domain和DNA binding domain，而家蠶PDP(BmPDP)與黑腹果蠅PDP(DmPDP)及小鼠的HLF(MmHLF)除具有bZIP domain和DNA binding domain以外，還具備轉(zhuǎn)錄活性域(TDA domain)及脯氨酸和酸性氨基酸富集區(qū)(PAR domain)。

Weblogo序列比對(duì)分析結(jié)果(圖3：A-3)顯示，不同物種的VRI、NFIL3/E4BP4、PDP和HLF的DNA binding domain是高度保守的，只有個(gè)別氨基酸殘基有差異。家蠶BmVRI和BmPDP蛋白的DNA binding domain氨基酸殘基序列非常相似，推測(cè)它們可以結(jié)合相似的DNA序列，這很可能就是Clk基因的啟動(dòng)子序列。

2.4.2 PER和TIM(TIM1和TIM2) 結(jié)果(圖3：B-1，B-2)顯示，家蠶BmPER與果蠅DmPER和小鼠的3種PER蛋白(MmPER1、MmPER2和MmPER3)一樣，都具備2個(gè)PAS功能域(信號(hào)蛋白的信號(hào)傳感功能域)以及1個(gè)PAC功能域(存在于PAS基序的C-端，有助于PAS結(jié)構(gòu)域的折疊)。

家蠶BmTIM1和BmTIM2，果蠅DmTIM1和DmTIM2，小鼠MmTIM1都具備ARM功能域(參與蛋白的信號(hào)傳導(dǎo))，但在家蠶BmTIM1、果蠅DmTIM1中還具備PER-binding domain，從結(jié)構(gòu)上看，昆蟲(chóng)的TIM1可以與PER結(jié)合，而昆蟲(chóng)的TIM2與哺乳動(dòng)物小鼠的MmTIM1相似，都沒(méi)有PER-binding domain，從功能域組成上看，昆蟲(chóng)的TIM2與脊椎動(dòng)物的TIM1相似。

PER和TIM(TIM1和TIM2)都不具備DNA結(jié)合位點(diǎn)，但它們都具有蛋白質(zhì)互相作用的基序位點(diǎn)?？梢?jiàn)PER和TIM是通過(guò)蛋白質(zhì)互作實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳感的。

2.4.3 CYC和CLK 家蠶BmCYC與果蠅的DmCYC、大紅斑蝶的DpCYC、柞蠶的ApBMAL和小鼠的MmBMAL相似，都具有參與蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的bHLH、PAS、PAC功能域(圖3：C-1)，除此之外，鱗翅目昆蟲(chóng)家蠶BmCYC、大紅斑蝶的DpCYC、柞蠶的ApBMAL還具備與小鼠MmBMAL相似的轉(zhuǎn)錄激活功能域(transactivation domain)，而且這個(gè)功能域很保守，都具有一段N-EAAMAVIMSL序列(圖3：C-2)。從功能域上看，鱗翅目昆蟲(chóng)的CYC與果蠅的CYC差異大于與脊椎動(dòng)物的BMAL的差異。

在家蠶中沒(méi)有電子克隆獲得Clock基因，但在大紅斑蝶、柞蠶中都存在Clock基因，它們編碼的CLK蛋白與果蠅的DmCLK、小鼠的MmCLK相似，都具備bHLH、PAS、PAC功能域，但DmCLK和MmCLK中都有Ploy-Q，而柞蠶中沒(méi)有這個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖3：C-3)。

圖3 家蠶晝夜節(jié)律生物鐘蛋白的功能域與基序位點(diǎn)

Fig. 3 Putative functional domains and motifs onBombyxmoricircadian rhythm clock proteins

2.5 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

2.5.1 VRI和PDP 昆蟲(chóng)VRI在脊椎動(dòng)物中的同源蛋白為NFIL3/E4BP4，昆蟲(chóng)PDP在脊椎動(dòng)物中的同源蛋白為HLF/TEF。分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建結(jié)果(圖4：A，B)顯示，家蠶中的VRI和PDP分屬于昆蟲(chóng)的VRI與PDP蛋白組群，與其在脊椎動(dòng)物中的同源蛋白進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。

2.5.2 PER 通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，發(fā)現(xiàn)脊椎動(dòng)物(人Homosapiens、小鼠、奶牛Bostaurus、斑馬魚(yú)Daniorerio)都具有PER1、PER2和PER3蛋白，其中斑馬魚(yú)的PER1又分為PER1a和PER1b兩種亞型，在原雞Gallusgallus中只查詢到了PER2和PER3，而在爪蟾Xenopuslaevis中只查詢到PER1和PER2。此外，在植物中沒(méi)有查詢到相應(yīng)的PER蛋白。在昆蟲(chóng)(家蠶、柞蠶、大紅斑蝶、黑腹果蠅、埃及伊蚊Aedesaegypti、致倦庫(kù)蚊Culexquinquefasciatus、蜜蜂Apismellifera、赤擬谷盜Triboliumcastaneum、體虱、點(diǎn)蜂緣蝽Riptortuspedestris)中只發(fā)現(xiàn)1種PER。

利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖4：C)后發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物的PER(PER1、PER2和PER3)聚為一大類，昆蟲(chóng)的PER聚為一大類，其中脊椎動(dòng)物的PER1和PER2進(jìn)化距離更近，同綱目昆蟲(chóng)物種的PER進(jìn)化距離較近，符合它們的親緣關(guān)系。

2.5.3 TIM1(TIMELESS)和TIM2(TIMEOUT)

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，發(fā)現(xiàn)在昆蟲(chóng)(家蠶、柞蠶、大紅斑蝶、黑腹果蠅、麻蠅、瘧蚊、埃及伊蚊、致倦庫(kù)蚊、蜜蜂、赤擬谷盜)和脊椎動(dòng)物(人、奶牛、綿羊Ovisaries、小鼠、斑馬魚(yú)、爪蟾)中都具有TIM1，此外植物擬南芥Arabidopsisthaliana也具有TIM1，稱為ATIM?？梢?jiàn)TIM1從植物到昆蟲(chóng)再到脊椎動(dòng)物是普遍存在的。

目前關(guān)于TIM2的報(bào)道還不是很多，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有查詢到脊椎動(dòng)物的TIM2，只有部分昆蟲(chóng)(黑腹果蠅、瘧蚊、赤擬谷盜、蜜蜂)中報(bào)道具有TIM2，我們根據(jù)黑腹果蠅的TIM2蛋白序列，電子克隆了家蠶的Tim2基因，并翻譯為蛋白序列用于進(jìn)化分析。

分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建結(jié)果(圖4：D)顯示，選取的蛋白數(shù)據(jù)聚為兩大類：脊椎動(dòng)物的TIM1與昆蟲(chóng)的TIM2聚為一類，昆蟲(chóng)的TIM1聚為一類。擬南芥的ATIM(TIM1)與昆蟲(chóng)的TIMEOUT進(jìn)化距離較近。無(wú)論從進(jìn)化距離還是功能域組成，昆蟲(chóng)的TIM2都與脊椎動(dòng)物的TIM1相似，而蜜蜂的TIM1與脊椎動(dòng)物的TIM1進(jìn)化距離較近，蜜蜂的TIM2與昆蟲(chóng)的TIM1進(jìn)化距離較近。由此可見(jiàn)脊椎動(dòng)物的TIM1在昆蟲(chóng)中的真正同源蛋白是TIM2，而不是TIM1。

圖4 晝夜節(jié)律生物鐘蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

2.5.4 CLK和CYC(BMAL) 分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建結(jié)果(圖4：E)顯示,昆蟲(chóng)的CYC與脊椎動(dòng)物的BMAL分屬兩類，脊椎動(dòng)物的BMAL是CYC在脊椎動(dòng)物中的同源蛋白，而在昆蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物中均還存在一種TANGO/ARNT蛋白，它們與CYC/BMAL進(jìn)化關(guān)系較近，推測(cè)CYC/BMAL與TANGO/ARNT起源于同一種蛋白，進(jìn)化產(chǎn)生了分歧，形成了2個(gè)大的分支。

而CLK在昆蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物中是普遍存在的，它們分為昆蟲(chóng)CLK和脊椎動(dòng)物CLK兩類，同綱目昆蟲(chóng)物種同源蛋白進(jìn)化距離較近，符合它們的親緣關(guān)系。

2.6 家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因網(wǎng)絡(luò)的初步整合

根據(jù)家蠶中已知和克隆獲得的晝夜節(jié)律生物鐘基因和它們編碼蛋白的功能域特性，以及果蠅(Giebultowicz，2001；Leise & Moin，2007)和大紅斑蝶(Zhuetal.，2008)的晝夜節(jié)律生物鐘網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制，整合了家蠶的晝夜節(jié)律生物鐘基因網(wǎng)絡(luò)(圖5)。

在第一個(gè)環(huán)路中，BmCLK和BmCYC蛋白結(jié)合形成異二聚體，在細(xì)胞核中結(jié)合到Bmcry2、Bmper、Bmtim1基因和受生物鐘基因調(diào)控和控制的某些生理和行為的基因E-box上，正向調(diào)節(jié)它們的轉(zhuǎn)錄。而B(niǎo)mCRY1、BmPER和BmTIM1在細(xì)胞漿堆積形成BmCRY1/BmPER/BmTIM1三聚體，當(dāng)BmCRY1感受到光刺激后將信號(hào)傳到這個(gè)三聚體，BmTIM1被降解，從而B(niǎo)mCRY1/BmPER異二聚體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，抑制BmCLK/BmCYC異二聚體的形成，從而抑制它們自身的轉(zhuǎn)錄，此環(huán)路主要是調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的周期長(zhǎng)短和時(shí)相。

在第二個(gè)環(huán)路上，BmVRI和BmPDP分別是BmClk基因轉(zhuǎn)錄的阻遏物和激活物，Bmvri基因編碼的BmVRI蛋白屬于bzip轉(zhuǎn)錄因子，Bmpdp基因(PAR domain protein)編碼的BmPDP蛋白含有PAR(Proline and Acidic Rich)，它們的DNA結(jié)合位點(diǎn)高度相似，推測(cè)可結(jié)合相同的DNA序列位點(diǎn)，即Bmclk基因的啟動(dòng)子序列。BmCLK可能同時(shí)激活Bmvri和Bmpdp基因的轉(zhuǎn)錄。BmVRI比BmPDP堆積和消失得早，從而B(niǎo)mCLK/BmCYC的抑制和激活在時(shí)間上分離，BmVRI和BmPDP互相協(xié)調(diào)使得BmCLK的表達(dá)呈現(xiàn)晝夜振蕩。第二個(gè)環(huán)路主要調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的幅度和特定的晝夜輸出(王文棟，2011)。

圖5 家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因互作網(wǎng)絡(luò)

3 討論

在果蠅中，VRI和PDP蛋白分別是Clk基因轉(zhuǎn)錄的阻遏物和激活物，它們競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Clk基因的啟動(dòng)子序列，在家蠶中也存在這2種蛋白，并且它們具有高度相似的DNA結(jié)合功能域，這為它們競(jìng)爭(zhēng)和結(jié)合相同的DNA序列(Clk基因的啟動(dòng)子)提供了序列結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。BmPER和BmTIM(BmTIM1和BmTIM2)都不具備DNA結(jié)合位點(diǎn)，但都具有蛋白質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)互作基序位點(diǎn)，而且BmTIM1上有與PER蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，BmPER和BmTIM1是可以結(jié)合的，可見(jiàn)BmPER和BmTIM1是通過(guò)蛋白質(zhì)互作實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳感的。BmCYC除具有蛋白質(zhì)互作基序位點(diǎn)(bHLH、PAS、PAC)外，還具備高度保守的轉(zhuǎn)錄激活功能域。

昆蟲(chóng)的VRI、PDP、CYC和CLK在脊椎動(dòng)物中的同源蛋白分別為NFIL3/E4BP4、HLF/TEF、BMAL和CLK。而在脊椎動(dòng)物中PER有3種，PER1、PER2和PER3，昆蟲(chóng)中只有1種PER。而無(wú)論從進(jìn)化距離還是功能域來(lái)看，昆蟲(chóng)的TIM2都與脊椎動(dòng)物的TIM1相似，可見(jiàn)脊椎動(dòng)物的TIM1在昆蟲(chóng)中的真正同源蛋白是TIM2，而不是TIM1。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，家蠶的BmVRI、BmPDP、BmPER、BmTIM1、BmTIM2和BmCYC分屬于昆蟲(chóng)相應(yīng)的蛋白組群，同綱目昆蟲(chóng)物種的同源蛋白進(jìn)化距離較近，符合它們的親緣關(guān)系。

隨著基因和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的發(fā)展和完善，晝夜節(jié)律生物鐘相關(guān)基因在越來(lái)越多物種中被克隆和鑒定。家蠶的滯育是典型的對(duì)溫度和光照主動(dòng)適應(yīng)的現(xiàn)象，所以進(jìn)一步研究溫度、光照和食物對(duì)家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因Bmcry1，Bmcry2，Bmper，Bmtim1，Bmtim2，Bmcyc，Bmclk，Bmvri，Bmpdp等的影響，將整合出詳盡的家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因網(wǎng)絡(luò)圖，也對(duì)研究其他昆蟲(chóng)物種的生物鐘基因有所幫助。

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Bioinformatics Analysis of Circadian Rhythm Biological Clock Genes inBombyxmori

WANG Wendong1, SHU Meiying2, ZHANG Dayan2, XU Shiqing2*

(1. Collgege of Lab Medicine, Hebei North University, Zhangjiakou, Hebei Province 075000, China;2. Medical College of Soochow University, Suzhou, Jiangsu Province 215123, China)

Circadian rhythm is the most common phenomenon of biological rhythms, which is regulated by the genetic clock genes. Intensive research about molecular mechanism of circadian rhythm has been carried out inDrosophilamelanogaster. Diapause of the silkworm (Bombyxmori) is a phenomenon to response the circadian rhythm zeitgeber, therefore it can be used as reference to circadian rhythm research. The open reading frame (ORF) sequences ofBmvri,Bmcyc,Bmtim2,BmpdpandBmclkfragment were cloned in silico, followed by genetic structure analysis, chromosome location and molecular phylogenetic analysis of those genes and their expression products. With the data resources, the current feedback loop of circadian rhythm in silkworm was integrated according to the structural characteristics of biological clock genes and their expression products.

Bombyxmori; circadian rhythm; biological clock; bioinformatics; molecular evolution

2015-10-13 接受日期：2015-12-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“基于Ea4與Sod基因互作的滯育生物鐘分子調(diào)控機(jī)制研究”(30771632); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“基于家蠶晝夜節(jié)律生物鐘信號(hào)途徑基因發(fā)掘的滯育誘導(dǎo)授時(shí)信號(hào)輸入機(jī)制研究”(31172264)

王文棟, 女, 碩士, 講師, 研究方向: 生物化學(xué)與分子生物學(xué)、生物信息學(xué), E-mail：190594526@qq.com

*通信作者Corresponding author， 博士, 教授, 研究方向: 發(fā)育功能基因與分子調(diào)控機(jī)理、動(dòng)物分子遺傳與基因工程, E-mail：xushiqingsd@126.com

S8；Q78

A

1000-7083(2016)02-0275-08