截短側耳素產生菌原生質體的制備條件優(yōu)化及再生＊

都雯玥，王鳴剛，梁劍平，陸錫宏，李雪虎

（1蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州730000；2中國科學院近代物理研究所，蘭州 730000）

截短側耳素產生菌原生質體的制備條件優(yōu)化及再生＊

都雯玥1,2，王鳴剛1，梁劍平2，陸錫宏2，李雪虎2

（1蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州730000；2中國科學院近代物理研究所，蘭州 730000）

以截短側耳素產生菌Clitopilus pinsitus為材料，通過單因素和正交實驗，研究菌齡、酶系、酶濃度、酶解時間、溫度及穩(wěn)滲劑對C.pinsitus原生質體制備和再生的影響。實驗結果表明，制備原生質體的最佳條件為：5d菌齡，0.4mol/L甘露醇穩(wěn)滲劑，2.0%蝸牛酶和2.0%纖維素酶混合酶，25℃酶解1.5h，原生質體產量5.9×107個/mL，其再生率為1.2‰。實驗為截短側耳素高產菌株原生質體誘變育種奠定基礎。

微生物；斜蓋菇屬；原生質體；單因素實驗；正交實驗；優(yōu)化

自1951年Kavanagh發(fā)現(xiàn)斜蓋菇屬中個別菌株能夠生產抗生素截短側耳素以來，研究者進一步發(fā)現(xiàn)還有大約8種斜蓋菇屬的菌種具有產生截短側耳素的能力，如Clitopiluspinsitus[1，2]。截短側耳素是二萜類抗生素，研究表明它對青霉素及鏈霉素抗性葡萄球菌具有較高的抗菌作用，而且截短側耳素經過化學基團修飾后，其衍生物具有更強的抗菌性[3，4]。由于截短側耳素產生菌發(fā)酵生長較慢，截短側耳素產量偏低，越來越難以滿足日漸提高的市場需求[5]，所以要求通過工業(yè)誘變育種的方法獲得截短側耳素高產菌株。

原生質體對誘變劑敏感，原生質體誘變技術與常規(guī)誘變相比有較高的突變率并在抗生素、維生素、氨基酸等高產菌株選育中均取得較好的進展[6]。李艷麗對刺芹側耳原生質體進行紫外誘變，選育出多糖和漆酶高產菌株[7]。Stewart使用5%諾瓦酶234在25℃水解2h獲得C.pinsitus原生質體并進行常規(guī)誘變處理，選育出截短側耳素高產菌株[8]。因此，原生質體誘變育種是一種工業(yè)育種的重要手段。原生質體制備則是原生質體誘變育種的基礎，提高原生質體產量是該育種技術成功應用的重要前提[9]。

原生質體產量受酶系、菌齡、穩(wěn)滲劑等多個條件的影響。張萍使用纖維素酶、蝸牛酶、溶菌酶對黑曲霉、冬菇、平菇等多種絲狀真菌進行酶解法制備原生質體[10]。李江研究菌齡、酶解時間對毛栓菌原生質體制備的影響，其制備率為5.0×106個/mL[11]。李春麗優(yōu)化蛹蟲草原生質制備溫度、穩(wěn)滲劑等條件，原生質體產量為9.2×106個/mL[12]。實驗以C.pinsitus為材料，通過設計單因素實驗和正交實驗，優(yōu)化影響制備C.pinsitus原生質體的條件，如破壁酶系、穩(wěn)滲劑、酶解溫度等，為截短側耳素高產菌原生質體誘變育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1）供試菌株。截短側耳素生產菌Clitopiluspinsitus由山東東藥藥業(yè)股份有限公司提供。

2）培養(yǎng)基及試劑。斜面培養(yǎng)基：麥芽提取物1.9%、葡萄糖0.4%、酵母浸粉0.4%、棉籽粉0.3%、瓊脂2.0%、pH自然。

液體培養(yǎng)基：麥芽提取物1.9%、葡萄糖0.4%、酵母浸粉0.4%、棉籽粉0.3%、硝酸鈣0.05%、碳酸鈣0.05%、pH6.2。

甘露醇穩(wěn)滲劑：按實驗設計濃度，稱取甘露醇溶于去離子水中，高壓滅菌備用。

蔗糖穩(wěn)滲劑：按實驗設計濃度，稱取蔗糖溶于去離子水中，高壓滅菌備用。

硫酸鎂穩(wěn)滲劑：按實驗設計濃度，稱取MgSO4? 7H2O溶于去離子水中，0.22μm濾膜過濾除菌備用

氯化鉀穩(wěn)滲劑：按實驗設計濃度，稱取氯化鉀

溶于去離子水中，高壓滅菌備用。

酶解液：按實驗設計的濃度要求精確稱取溶壁酶（上海索寶生物科技有限公司）、蝸牛酶（上海索寶生物科技有限公司）、纖維素酶溶解于相應穩(wěn)滲劑中，0.22μm濾膜過濾除菌備用。

1.2 方法

1）菌絲培養(yǎng)及收集從斜面培養(yǎng)基鏟取約5mm2大小菌塊，加5mL0.9%NaCl并用研磨器研磨后，菌液接入250mL錐形瓶中，溫度25℃，濕度40%～50%，靜置培養(yǎng)至實驗設計要求的時間[9]。

培養(yǎng)至時間要求的菌絲移入離心管，在15mL離心管中加入5mL0.9%NaCl，振蕩混勻，2000r/min離心10min，棄上清液，重復兩次。加入實驗設計要求的穩(wěn)滲液，2000r/min離心10min，棄上清液，獲得菌絲。稱量記錄菌絲濕重。

2）原生質體制備及計數(shù)按照每克菌絲加入5mL酶解液的比例，15mL離心管中加入酶解液，振蕩混勻后放入水浴鍋，按實驗設計要求的溫度、時間酶解，每隔30min振蕩一次。酶解終止后，四層滅菌擦鏡紙過濾酶解混合液[13]。收集濾液，2000r/min離心10min，棄上清液，除去酶解液。沉淀中加入5mL穩(wěn)滲劑，輕微振蕩混勻，2000r/min離心10min，棄上清液，洗去殘余酶解液，重復兩次。最后加入1mL穩(wěn)滲劑，得到原生質體懸浮液。血球計數(shù)板計數(shù)。

1.2.3 單因素試驗

1)酶系種類優(yōu)化實驗 選取溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶、溶壁酶蝸牛酶復合酶、溶壁酶纖維素酶復合酶、蝸牛酶纖維素酶復合酶總計6種酶系進行酶解破壁。酶解液濃度2%，0.6mol/L甘露醇穩(wěn)滲劑，25℃酶解2h制備的原生質體懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)，以原生質體產量最高為指標，篩選最佳制備酶。

2)穩(wěn)滲劑種類優(yōu)化實驗選取甘露醇、蔗糖、硫酸鎂、氯化鉀4中穩(wěn)滲劑制備原生質體。確定穩(wěn)滲劑濃度為0.6mol/L,2%溶壁酶，25℃酶解2h制備的原生質體懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)，以原生質體產量最高為指標，篩選最佳制備穩(wěn)滲劑。

3)酶解時間優(yōu)化實驗 設定0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，3.0h6個酶解時長。2%溶壁酶，0.6mol/L甘露醇穩(wěn)滲劑，25℃酶解制備的原生質體懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)，以原生質體產量最高為指標，篩選最佳制備時間。

4）正交實驗設計L(45)正交實驗優(yōu)化菌齡、酶濃度、穩(wěn)滲劑濃度、和酶解溫度條件（見表1）。制備的原生質體懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)，以原生質體產量最高為指標，篩選最佳制備條件。

表1 原生質體制備及再生條件因素水平表

2 結果與分析

2.1 原生質體制備酶系種類優(yōu)化

如圖1所示，使用2%蝸牛酶＋2%纖維素酶復合酶制備出的原生質體產量較高，為1.6×107個/mL。2%纖維素酶，2%溶壁酶＋2%纖維素酶復合酶，以及2%溶壁酶＋2%蝸牛酶復合酶較低，為106個/mL。纖維素酶單酶原生質體產量最低。實驗確定使用2%蝸牛酶＋2%纖維素酶復合酶為最優(yōu)酶系。

圖1 不同酶系對原生質體制備的影響

2.2 原生質體制備穩(wěn)滲劑種類優(yōu)化

有機穩(wěn)滲劑更有利于制備原生質體。甘露醇是制備原生質體的最優(yōu)穩(wěn)滲劑（如圖2所示）。使用甘露醇穩(wěn)滲劑，原生質體產量達到3.9×107個/mL，而使用無機穩(wěn)滲劑，如硫酸鎂穩(wěn)滲劑，其原生質體產量僅為5.0×106個/mL。

2.3 原生質體制備酶解時間優(yōu)化

根據(jù)圖3所示，隨時間的增加，破壁酶分解細胞壁，使原生質體不斷釋放，在酶解1.5h后原生質體產

量為9.8×107個/mL。之后原生質體產量成平緩下降的趨勢。實驗確定1.5h為最優(yōu)酶解時長。

圖2 不同穩(wěn)滲劑對原生質體制備的影響

圖3 酶解時間對原生質體制備的影響

2.4 原生質體制備其他條件優(yōu)化及再生

正交實驗結果直觀分析表明（見表2），菌齡對原生質體制備有顯著影響（見表3），也是影響原生質體再生的主要因素。5d菌齡的菌絲體其原生質體產量最高，3d菌齡或9d菌齡的產量偏低，而且5d菌齡的原生質體再生率也高于其他的菌齡。溫度對原生質體制備影響最低，但是對原生質體的再生有較大影響，故為保證原生質體再生率較高，實驗選取25℃作為酶解溫度。穩(wěn)滲劑濃度對原生質體制備的影響次之，確保原生質體生物活性，最有利于原生質體產量的穩(wěn)滲劑濃度為0.2mol/L，但實驗表明最適合原生質體再生的穩(wěn)滲劑濃度為0.4mol/L，為確保原生質體不會脹破，實驗選定0.4mol/L甘露醇為最優(yōu)穩(wěn)滲劑。酶濃度對原生質體的制備與再生沒有顯著影響（見表3，表4）。實驗表明2.5%蝸牛酶+2.5%纖維素酶混合酶使原生質體質量最高，是最佳制備酶濃度，但1.5%蝸牛酶+1.5%纖維素酶混合酶更有利于原生質體的再生。

最終確定最佳制備及再生條件為5d菌齡，2.0%蝸牛酶+2.0%纖維素酶復合酶，0.4mol/L甘露醇，酶解1.5h。該條件重復試驗3次，原生質體制備量為5.9×107個/mL，其再生率為1.20‰。

表2 正交試驗結果直觀分析表

表3 原生質體制備正交實驗方差分析

表4 原生質體再生正交實驗方差分析

3 討論

酶解法制備原生質體是一種酶促反應，受酶種類、酶濃度、時間等條件的影響。酶的選取是依據(jù)細胞壁成分和菌種的不同決定的。曹文芩等使用蝸牛酶和溶壁酶的復合酶制備靈芝原生質體,陳敏等使用溶壁酶制備杏鮑菇原生質體，均獲得滿足實驗需求數(shù)量的原生質體[15，16]。實驗考察6種不同酶系，結果表明適用于C.pinsitus原生質體制備的酶系為蝸牛酶和纖維素酶復合酶。真菌細胞壁由幾丁質和β-葡聚糖構成，蝸牛酶和纖維素酶分別以幾丁質和β-葡聚糖為底物分解細胞壁，促使原生質體釋放。溶壁酶是分解幾丁質和β-葡聚糖的復合酶[17]。實驗溶壁酶中加入蝸牛酶或纖維素酶，原生質體產量反而降低，這是由于作用于細胞壁的酶濃度過高導致原生質體破裂，結果降低了產量[18]。實驗酶解時間也是影響原生質體制備的重要因素。實驗表明酶解時間不應過長，過長則降低原生質體的產量。細胞壁酶解殘余物有助于原生質體再生，過長時間的酶解破壞原生質體細胞壁，降低其再生率，二是破壁酶降低原生質體活性，也會影響再生率[15]。

菌齡對原生質體制備有顯著影響。實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)5d的菌絲處于對數(shù)生長期，菌絲量足，細胞壁較薄，最有利于原生質體制備[16]。3d菌齡偏小，菌絲嬌嫩，原生質體不穩(wěn)定，產量也較低，而9d菌齡偏老，細胞壁較厚，色素沉積，破壁困難[13]。

曹文芩研究發(fā)現(xiàn)有機穩(wěn)滲劑更有利于原生質體的穩(wěn)定釋放[15]，與實驗結果相一致。穩(wěn)滲劑使細胞皺縮，一是形成質壁分離的狀態(tài)利于細胞壁分解，二是保證原生質體不會脹破，維持其生理活性[16]。穩(wěn)滲劑為破壁酶提供作用環(huán)境，也提供原生質體的存在環(huán)境，對原生質體制備十分重要。實驗表明甘露醇是最優(yōu)的有機穩(wěn)滲劑，何小慧等研究結論相符，而穩(wěn)滲劑濃度對原生質體產量沒有顯著影響，為避免原生質體脹破選擇較高的濃度[14-16]。

實驗靜置培養(yǎng)菌絲進行原生質體制備，研究比較搖床培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)后者是最佳菌絲培養(yǎng)方式。搖床培養(yǎng)形成致密的菌絲球，不利于內部菌絲與破壁酶接觸，而靜置培養(yǎng)形成絮狀菌絲，增加了菌絲和酶的接觸，提高了原生質體產量[9、19]。

影響原生再生關鍵因素是制備的細胞是否含有細胞核。張萍等[10]觀察制得的原生質體，發(fā)現(xiàn)有空泡或不完整的原生質體，這些細胞最終都不能再生，所以從絲狀真菌制備原生質體的再生率一般都很低。

原生質體誘變技術是對原生質體進行物理或化學誘變處理，經過再生培養(yǎng)，選育突變菌株。丁曉兵用N＋輻照鈍齒棒桿菌原生質體，選育再生菌株，獲得遺傳穩(wěn)定性較好的L-異亮氨酸高產菌，其產率比原始菌株提高43.66%。針對實驗使用的C.pinsitus這類絲狀多核體的擔子菌，特別是其在實驗室環(huán)境培養(yǎng)下不產生孢子這一特點[8]，采用原生質體誘變技術既能獲得單個細胞進行誘變選育，也能拓寬突變株的變異幅度。因此，優(yōu)化截短側耳素產生菌原生質體制備條件為高產菌株誘變選育奠定了基礎，為微生物誘變育種提供了一種新方法。

[1]Kavanagh F,Hervby A,Robbins W.J Antibiotic Substances From Basidiomycetes.VIII.Pleurotus mutilus(FR.)SACC. AndPleurotusPasseckerianusPilat[J].PNAS,1951,37∶570-574.

[2]Hartley A.J,de Mattos-Shipley K,Collins C.M,et al.Investigating pleuromutilin-producing Clitopilus species and related basidiomycetes[J].FEMSMicrobiolLetter,2009,297∶24-30.

[3]Davidovich C,Bashan A,Auerbach-Nevo T,et al.Induced-fit tightens pleuromutilins binding to ribosomes and remote in teractions enable their selectivity[J].PNAS,2007,104(11)∶4291-4296.

[4]Tsukagoshi T,Tokiwano T,Oikawa H.Studies on the later stage of the biosynthesis of pleuromutilin[J].Biosci.Biotech nol.Biochem,2007,71(12),3116-3121.

[5]Mattos-Shipley K,Hayes R.Collins C,et al,Biobased antibiotics from basidios∶a case study on the identification and manipulation of a gene cluster involved in pleuromutilin biosyn thesis from Clitopilus passeckerianus[R].Proceedings of the 7th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products,2011,section mycosourced molecules and nutritional quality∶224-231.

[6]丁曉兵,李宗偉,劉曉波等.原生質體誘變在工業(yè)微生物育種中的應用進展[J].食品工業(yè)科技.2008,29(7)∶260-262.

[7]李艷麗.原生質體技術篩選刺芹側耳高產多糖和漆酶菌株的研究[D].吉林∶吉林農業(yè)大學,2012.

[8]Stewart K R.Amethod for preparation of protoplasts from Clitopilus pinsitus[J].Journal of Antibiotics,1986,39(10)1486-1487.

[9]朱堅,張鵬.白靈菇原生質體制備條件的優(yōu)化[J].中國農學通報,2011,27(25)∶153-157.

[10]張萍,馬宗孚.幾種絲狀真菌原生質體的形成與再生[J].云南大學學報(自然科學版),1990, 12(3)∶255-261.

[11]李江,袁月祥,閆志英,劉曉風,廖銀章,李娜.毛栓菌原生質體制備和再生及單核菌株產漆酶特性[J].菌物學報, 2012,31(1)∶102～109.

[12]李春麗,劉曉蘭,鄭喜群,等.蛹蟲草原生質體紫外誘變選育胞外多糖高產菌株.工業(yè)微生物,2011,41(2)∶51-56.

[13]劉玉霞.側耳屬真菌原生質體技術選育高產菌株研究[D].河北∶河北大學,2006.

[14]何小慧,楊民和.杏鮑菇原生質體制備條件的研究[J].安徽農學通報,2014,20(06)∶15-17.

[15]張鵬,龔玲鳳,莊衛(wèi)東等.杏鮑菇原生質體制備條件初探[J].中國農學通報,2013,29(31)∶91-95.

Q93-33

甘肅省隴藥產業(yè)發(fā)展專項(Y361010SJ0)項目；甘肅省國際科技合作專項（1504WKCA098）。