hTERT基因沉默對乳腺癌細胞生物學特性及COX-2表達的影響

于宏建，趙 楊，趙世銘，馬洪奎，李 光

(1.天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院 檢驗科,天津300350;2.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院)

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hTERT基因沉默對乳腺癌細胞生物學特性及COX-2表達的影響

于宏建1，趙 楊1，趙世銘1，馬洪奎1，李 光2

(1.天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院 檢驗科,天津300350;2.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院)

目的 本研究探討hTERT基因沉默后對乳腺癌細胞生物學特性及環(huán)氧化酶-2(COX-2)的影響。方法 設計合成特異性針對hTERT mRNA的siRNA，電轉染入乳腺癌細胞，以致目的基因沉默。應用RT-PCR及Western blot法檢測沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7細胞的mRNA及蛋白的表達狀況；應用流式細胞儀檢測細胞周期；并通過CCK-8 增殖實驗檢測沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力；經(jīng)小室侵襲實驗檢測沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7細胞的侵襲能力。利用免疫組織化學法檢測COX-2蛋白的表達。結果 hTERT基因沉默48 h后,hTERT轉染組在沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7細胞的mRNA及蛋白表達呈現(xiàn)明顯降低(P<0.05)；細胞周期檢測結果示乳腺癌MCF-7腫瘤干細胞停滯在G0/G1周期，S期的細胞數(shù)目減低，三組比較統(tǒng)計學差異明顯(P<0.05)；CCK-8 增殖實驗結果表明乳腺癌MCF-7腫瘤干細胞在hTERT轉染組的增殖得到顯著抑制(P<0.05)；小室侵襲實驗結果表明，hTERT轉染組穿過濾膜的細胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)；免疫組織化學法檢測結果顯示，COX-2蛋白在hTERT轉染組的表達明顯降低，并與hTERT基因的表達相關聯(lián)。結論 hTERT基因沉默后對乳腺癌細胞的增值和遷移能力均有影響，并能降低COX-2蛋白的表達，從而改善乳腺癌患者預后。

乳腺癌；hTERT基因；基因沉默；COX-2

(ChinJLabDiagn,2016,20:1817)

乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第一位，嚴重危害婦女同志健康[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)hTERT基因與COX-2在乳腺癌的發(fā)病機制中發(fā)揮作用，hTERT表達量升高，能促使端粒酶活性增強，延長端粒、恢復端粒功能，進而使染色體穩(wěn)定并免受末端降解酶的影響，促使細胞無限制的分裂、增殖，使乳腺癌得以發(fā)生發(fā)展[4-6]。COX-2可以在多種細胞因子的作用下呈高表達，正常組織細胞表達很少，在腫瘤或炎癥等病理反應，大量存在。研究發(fā)現(xiàn)COX-2在多種人類惡性腫瘤及癌前病變有高表達，這為腫瘤的防治貢獻了新思路[7-9]。本研究旨在觀察將HTERT基因沉默電轉染乳腺癌MCF-7細胞后，對乳腺癌細胞生物學特性及COX-2的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人乳腺癌MCF-7細胞購自于中國醫(yī)學科學院。將細胞株在37℃，5%CO2，常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅活的新生小牛血清中(100 u/ml青霉素、100 U/llll鏈霉素的RIPMl640培養(yǎng)液中)。

1.1.2 主要試劑與儀器

見表1。

表1 主要試劑和儀器

1.2 方法

1.2.1 siRNA設計、合成及MCF-7細胞的電轉染

設計合成特異性針對hTERT mRNA的siRNA，由美國Ambion公司設計合三對siRNA：siRNA正義鏈為：5’-GGAACACCAAGAAGUUCAU-TT-3 7(1521-1539)；反義鏈為：5 7-AUGAACUUCUUGGUGUUCC-TT-37，將其克隆入pGenesil-1.1質粒中，重組成hTERT mRNA-siRNA的表達載體，產(chǎn)生RNA干擾作用，以致目的基因沉默。

電轉染乳腺癌MCF-7細胞：將處于對數(shù)生長期的細胞，制成單細胞懸液，利用PBS清洗并經(jīng)胰酶消化，離心后重懸于電轉液中。 將轉染后的hTERT- MCF-7細胞，放置于室溫30 min，細胞移入DMEM培養(yǎng)基，含10%小牛血清，1%雙抗的培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2孵箱內培育。于轉染后48h將培養(yǎng)板于熒光顯微鏡下觀察轉染效率,并進行RNA干擾效應的檢測。

1.2.2 細胞實驗分組

hTERT基因沉默后，乳腺癌MCF-7細胞轉染時分為3組：hTERT轉染組(轉染pGenesil-1.1-hTERT-siRNA載體者)；空載質粒組(轉染pGenesil-1.1組)；未轉染組(MCF-7組)；于轉染后48 h行RNA干擾效應的檢測。

1.2.3 RealTime RT-PCR檢測轉染MCF-7細胞hTERT mRNA的表達

采用TRIzol法提取總RNA后參考文獻[9]，以0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳并觀察RNA的完整性。根據(jù)cDNA合成試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，設計引物序列為：上游引物：5-CTGAAGTGTCACAGCCTGTTT-3，下游引物：5-CACACATGCGTGAAACCTGTA-3，產(chǎn)物大?。?11 bp；內參β-actin上游引物：5-TATCGGACGCCTGGTTAC-3，下游引物：5-CTCAGCCTTGACTGTGCC-3，產(chǎn)物大小：151 bp。PCR擴增產(chǎn)物取5 ml進行電泳，電泳后應用Image-Pro Plus8.0軟件分析hTERT的條帶與β-actin條帶的相對灰度比值。

1.2.4 Westem blot檢測轉染MCF-7細胞hTERT蛋白的表達

提取總蛋白經(jīng)BCA法測定蛋白質濃度，吸取50 μg總蛋白，去離子水補至20 μl，入等體積2×上樣緩沖液調整蛋白濃度至1 mg/ml，99 ℃ 變性10 min，離心30 s；同時加入蛋白質分子量標準品進行電泳；電轉移印跡到PVDF膜上，觀察膜上有蛋白分子量標準條帶，標記正反面；封閉液中孵育1 h。加入1∶1000稀釋的HTERT一抗4℃過夜。TBST洗膜5 min,共3次。加入1∶5000 HRP標記的二抗及GAPDH,37℃孵育2 h。PBS洗滌3次，每次10min,用辣根過氧化物酶染色，避光靜置1 min,暗室曝光X 光片，將膜置入儀器中成像，分析結果。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期

于轉染48 h后收集各組MCF-7細胞，4℃預冷，調整細胞濃度為1×106/L,置入含50 μg/ml RNA 酶的Tris-HCL緩沖液(pH7.4)中共同孵育30 min。用流式細胞儀檢測，并采用其附帶軟件對MCF-7細胞的DNA含量分布進行分析，并計算出各個周期細胞的百分率，實驗重復進行3次。

1.2.6 CCK-8實驗檢測MCF-7的增殖能力

收集對數(shù)生長期MCF-7細胞，以1×103個/每孔接種細胞于96孔板中,并設6個復孔在每組，培育24 h后，于轉染后1-4 d天，每天各取一96孔板經(jīng)CCK-8試劑室溫融化，加入CCK-820 μl置于每孔里，行CCK-8法檢測細胞增殖情況。并進行數(shù)據(jù)處理分析。繪制對細胞生長影響的各組曲線圖，并計算出細胞的生長抑制率。

1.2.7 小室侵襲實驗檢測MCF-7侵襲能力

以50 μg/孔在聚碳酸酯微孔濾膜上鋪Matrigel，加入10%的胎牛血清在聚合好的小室下室中作為條件培養(yǎng)液，將上述3組處理過的G666-1細胞懸液100 μl(3×105/L)加入上室中，經(jīng)培育箱中培育24小時，利用棉簽輕輕刮除濾膜上室面未穿過的G666-1細胞，再采用95%乙醇固定5 min，采取PBS清洗小室，等待其自然涼干后，封片；干燥后光鏡下記數(shù)5個視野的侵襲細胞數(shù)，并計算出其平均值。

1.2.8 免疫組化法檢測COX-2蛋白的表達

利用免疫組化S-P 法檢測COX-2蛋白的表達：實驗步驟嚴格按照試劑盒說明操作。石蠟切片脫蠟，用75%酒精室溫下浸泡 5 min，清水反復沖洗2 min，再用PBS 洗滌3 min，已清除內源性過氧化物酶。經(jīng)抗原修復后放置于室溫下培育15 min經(jīng)PBS洗滌后棄掉PBS 液，滴加三抗于每張切片上，室溫下培育20 min。于顯微鏡下觀察細胞核的顯色。結果應用雙評分半定量法進行評分。

1.2.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 RT-PCR檢測HTERT siRNA抑制hTERT mRNA的表達

hTERT因沉默48h后,與空載質粒組及未轉染組相比較，hTERT轉染組HTERT基因沉默后的乳腺癌MCF-7細胞的mRNA的條帶明顯變窄，表明mRNA的表達明顯降低，統(tǒng)計學差異明顯(P<0.05)。hTERT轉染組與空載質粒組比較，hTERT轉染組與未轉染組(MCF-7組)比較，差異均有統(tǒng)計學意義，見圖1。

圖1 RT-PCR檢測MCF-7細胞中HTERT mRNA的表達

2.2 Westem blot檢測siRNA 抑制 HTERT 蛋白的表達

HTERT因沉默48 h后,與空載質粒組及未轉染組相比較，hTERT轉染組HTERT基因沉默后的乳腺癌MCF-7細胞的HTERT蛋白條帶明顯變窄，表明HTERT蛋白的表達有明顯降低，統(tǒng)計學差異明顯(P<0.05)。hTERT轉染組與空載質粒組比較，hTERT轉染組與未轉染組(MCF-7組)比較，差異均有統(tǒng)計學意義，見圖2。

圖2 Western blot檢測MCF-7細胞中HTERT protein的表達

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期

流式細胞儀檢測結果顯示，乳腺癌MCF-7腫瘤干細胞在G0/G1周期略有增加，S期的細胞數(shù)目減低，M期細胞無明顯變化，hTERT轉染組與空載質粒組比較，hTERT轉染組與未轉染組(MCF-7組)比較，差異均有統(tǒng)計學意義。說明MCF-7細胞有明顯的S期阻滯(表2)。

表2 乳腺癌MCF-7腫瘤干細胞周期的變化

和未轉染組、空載質粒組比較，aP<0.05

2.4 CCK-8增殖實驗檢測結果

通過CCK-8法分別測得各組MCF-7細胞的A450(OD)值。結果表明乳腺癌MCF-7細胞在hTERT轉染組的增殖得到顯著抑制，與空載質粒組及未轉染組比較，統(tǒng)計學差異明顯(P<0.05)；見表3。

表3 各組乳腺癌MCF-7細胞的A450(OD)

和未轉染組、空載質粒組比較，aP<0.05

2.5 小室侵襲實驗檢測結果

小室侵襲實驗結果示，與空載質粒組、未轉染組穿過濾膜的細胞數(shù)量比較，(46.12±1.20)和(45.17±2.02)；hTERT轉染組穿過濾膜的細胞數(shù)量明顯減少(26.14±0.34)，統(tǒng)計學差異明顯(P<0.05)。見圖3。

圖3 hTERT轉染組穿過濾膜的細胞數(shù)量較空載質粒組和未轉染組明顯減少(P<0.05).

2.6 免疫組化法檢測COX-2蛋白表達

免疫組化S-P 法檢測COX-2蛋白的表達結果顯示，未轉染組COX-2呈現(xiàn)強表達；空載質粒組呈現(xiàn)強表達；hTERT轉染組呈弱表達，見圖4。

圖4 COX-2基因陽性表達率

3 討論

乳腺癌的復發(fā)率及轉移率在全世界范圍內均較高，它的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素的復雜過程。目前的研究認為乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是環(huán)境與遺傳因素共同作用的結果[10-12]?，F(xiàn)階段的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌腫瘤起始的源泉就是腫瘤干細胞，腫瘤干細胞在維持腫瘤的生長、轉移及促進血管生成中發(fā)揮了決定性作用，腫瘤干細胞可以在化療后繼續(xù)存留，且不受外界影響進行惡性增殖和多向分化，最終發(fā)展為新的腫瘤進而致使癌癥復發(fā)。另有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌干細胞的遷移性增強是導致乳腺癌轉移的重要原因。因此抑制乳腺癌細胞的增值及遷移是治療乳腺癌的關鍵步驟。

端粒酶是一種維持端粒長度的反轉錄酶，hTERT是端粒酶的催化亞單位，是能以RNA為模板反轉錄合成端粒酶，具有多重生物學效應。 正常組織hTERT表達是被抑制的，但在腫瘤、癌細胞系中卻呈現(xiàn)高表達。研究發(fā)現(xiàn)hTERT基因經(jīng)電轉染可以取得有效而持久的作用。有實驗研究發(fā)現(xiàn)，用電穿孔法轉染基因，發(fā)現(xiàn)目的基因瞬時表達率高于脂質體轉染方法，因此電轉染法可作為一個簡單可行、有效的方法[13,14]。本研究通過設計合成特異性針對hTERT mRNA的siRNA，沉默HTERT基因后，經(jīng)改良的電轉染法，轉染乳腺癌MCF-7細胞，檢測結果中觀察到HTERT mRNA和蛋白的表達量均下降，提示HTERT基因沉默可以改善乳腺癌預后。

環(huán)氧化酶(COX-2)是前列腺素合成過程的一個主要限速酶，正常組織細胞中較少發(fā)現(xiàn)，當受各種因素刺激時可表達增強，COX-2參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在靜息細胞內檢測不到，只有當細胞接受相應的刺激才開始合成。本實驗采用免疫組化sP法檢測乳腺COX-2的陽性表達，結果顯示:未轉染組及空載質粒組呈現(xiàn)強表達而hTERT轉染組呈弱表達，與文獻報道基本一致[15]。結果表明COX-2蛋白表達與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關。等人的研究結果證明了COX-2高表達患者的預后均較差。

本研究采用沉默HTERT基因后，用設計、合成的特異性針對hTERT mRNA的siRNA對MCF-7細胞進行電轉染，流式細胞儀檢測結果顯示，在hTERT轉染組的乳腺癌MCF-7細胞周期在G0/G1期略有增加，S期的細胞數(shù)目減低，M期細胞無明顯變化，提示MCF-7細胞出現(xiàn)明顯的S期阻滯；通過CCK-8 增殖實驗檢測結果表明了乳腺癌MCF-7細胞在hTERT轉染組的增殖得到顯著抑制；小室侵襲實驗結果示hTERT轉染組的侵襲能力受到抑制。綜上所述，通過HTERT siRNA可以明顯抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖及侵襲能力，能使細胞的活力下降，轉染后細胞生長被抑制。因此認為沉默HTERT基因與COX-2的弱表達可能有關，COX-2可能是乳腺癌端粒酶激活和調節(jié)的機制之一，這為乳腺癌的靶向治療提供了新的思路。

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Effect of hTERT gene silencing on biological characteristics and COX-2 expression in breast cancer cells

YUHong-jian，ZHAOYang,ZHAOShi-ming,etal.

(XianshuiguHospitalofJinnanDistrict,Tianjin,Laboratory,Tianjin300350,China)

Objective This study was to investigate the effect of hTERT gene silencing on the biological characteristics of breast cancer cells and to investigate the effect of hTERT gene silencing on the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) in breast cancer cells.Methods The siRNA targeting hTERT mRNA was synthesized and cloned into pGenesil-1.1 plasmid.The hTERT mRNA-siRNA expression vector was transfected into breast cancer cells by electroporation to produce RNA interference effect,so that the target gene was silenced.The mRNA and protein expression of breast cancer MCF-7 cells were detected by RT-PCR and Western blot.The cell cycle was detected by flow cytometry.MCF-7 cells,and the invasive ability of breast cancer MCF-7 cells after silencing hTERT gene was detected by cell invasion assay.The expression of COX-2 protein was detected by immunohisto chemistry.Results After hTERT gene silencing,the mRNA and protein expression of hTERT gene in breast cancer MCF-7 cells after hTERT transfection were significantly lower than those in untransfected plasmid group and untransfected group (P<(P<0.05).The results of CCK-8 proliferation test indicated that the breast cancer MCF-7 tumor stem cells stagnated in G0/G1 cycle and the number of cells in S phase was decreased,the difference was statistically significant (P<0.05) The proliferation of MCF-7 tumor stem cells in hTERT-transfected group was significantly inhibited (P<0.05).The invasion of MCF-7 cells in hTERT-transfected group was significantly lower than that in control group(P<0.05),and the difference was statistically significant (P<0.05).The expression of COX-2 protein in hTERT-transfected group was significantly lower than that in control group(P<0.05).The expression of COX-2 protein was correlated with the expression of hTERT gene.Conclusion The silencing of hTERT gene may affect the proliferation and migration of breast cancer cells and decrease the expression of COX-2 protein,so as to improve the prognosis of patients with breast cancer.

breast cancer;hTERT gene;gene silencing;COX-2

1007-4287(2016)11-1817-05

R737.9

A

于宏建，32歲，男，病原生物學碩士，主管檢驗師，研究方向：病原生物學。

2015-08-15)