AMHR2在人子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及相關(guān)研究

劉 磊，蘆小單，林秀英，孫牧男，付建華，譚 巖，方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

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AMHR2在人子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及相關(guān)研究

劉 磊，蘆小單，林秀英，孫牧男，付建華，譚 巖，方艷秋*

(吉林省人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

目的 探討抗苗勒氏管激素Ⅱ型受體(AMHR2))在IVF-ET患者的子宮內(nèi)膜組織著床窗口期的表達(dá)及意義。方法 采用免疫組織熒光染色檢測(cè)AMHR2在IVF-ET患者黃體期子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況。分離培養(yǎng)原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，用HCG處理細(xì)胞48 h，熒光定量PCR檢測(cè)HCG處理前后AMHR2基因表達(dá)情況；細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)HCG處理前后AMHR2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 AMHR2在黃體中期人子宮內(nèi)膜組織表達(dá)；HCG處理后子宮內(nèi)膜細(xì)胞中AMHR2的基因和蛋白水平均顯著升高。結(jié)論 AMHR2在著床窗期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)，HCG可以增加其表達(dá)量，AMHR2可能作為預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性的參考指標(biāo)。

抗苗勒氏管激素Ⅱ型受體；子宮內(nèi)膜容受性；體外受精移植技術(shù)

(ChinJLabDiagn,2016,20:1856)

子宮內(nèi)膜容受性缺陷占導(dǎo)致ART技術(shù)著床失敗原因的2/3，尋找子宮內(nèi)膜容受窗期特異性表達(dá)的標(biāo)志分子，診斷和治療子宮內(nèi)膜容受性異常具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[1-3]?？姑缋展芗に?anti-Mullerian hormone,AMH)屬于TGF-β超家族成員，在卵泡發(fā)育的啟動(dòng)和選擇性生長(zhǎng)中發(fā)揮了重要作用，AMH的效應(yīng)主要通過(guò)其Ⅱ型受體AMHR2發(fā)揮作用[4,5]。通過(guò)對(duì)VEGF調(diào)節(jié)雌性生殖器官中基因表達(dá)譜的生物信息學(xué)研究[6，7],我們發(fā)現(xiàn)AMHR2在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平與小鼠生殖能力的密切相關(guān)。本研究通過(guò)分析AMHR2在IVF周期患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)的情況，探討AMHR2參與子宮內(nèi)膜容受性的可能機(jī)制，為提高IVF妊娠率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月-2015年1月吉林省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF-ET助孕患者32例，納入標(biāo)準(zhǔn)：基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常；近3個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)任何激素類(lèi)藥物及無(wú)宮腔操作史；B超檢測(cè)子宮內(nèi)膜無(wú)異?；芈?；輸卵管無(wú)積水；排除染色體異常及傳染病活動(dòng)期等。

1.2 儀器和實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶( Gibco 公司)、小牛血清(杭州四季青生物材料公司)；人重組VEGF (R&D公司)；總RNA 提取TRIZOL 試劑盒；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和熒光定量PCR相關(guān)試劑(Promega公司)；7500 Fast型熒光定量PCR 儀(ABI公司)；兔抗人AMHR2單克隆抗體(Santa Cruz公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(中國(guó)Tanon公司)。

1.3 子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本獲取 均于黃體期行預(yù)移植時(shí)采用一次性子宮內(nèi)膜取樣器，進(jìn)行子宮內(nèi)膜機(jī)械刺激，留取子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本。子宮內(nèi)膜組織分成兩份，1份以4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后用于免疫熒光染色；1份用于原代培養(yǎng)分離間質(zhì)細(xì)胞。

1.4 組織切片免疫熒光染色 石蠟切片貼附于多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片上，烘片，二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，1M枸櫞酸液修復(fù)，0.3%TritonX-100透膜劑透膜，滴加封閉血清，一抗4℃孵育過(guò)夜，滴加熒光二抗室溫避光孵育2 h，滴加DAPI避光孵育2 min，含抗熒光淬滅劑的封片，并在熒光顯微鏡下立即觀察。

1.5 人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 采用酶消化和離心法在體外分離、純化和培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，4%臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)和觀察細(xì)胞活力；用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定hCG(100 ng/ml)處理細(xì)胞48 h前后子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞AMHR2表達(dá)情況。

1.6 熒光定量PCR測(cè)定基因表達(dá)水平 應(yīng)用TRZOL試劑盒提取子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列為AMHR2 forward:GATTTGAGGCCTGACAGCAG,reverse:GCCAGGTGGATGGGATGTAG;18 s forward:CATTCGAACGTCTGCCCTAT,reverse:GATGTGGTAGCCGTTTCTCA。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃終延伸10 min。根據(jù)2-△△CT方法計(jì)算基因表達(dá)水平差異。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖采用GraphPad Prism5軟件，兩組間參數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05標(biāo)記為差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 AMHR2在子宮內(nèi)膜著床窗期的表達(dá) AMHR2主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞胞膜，部分表達(dá)于腺體上皮細(xì)胞膜表面，見(jiàn)圖1。

2.2 HCG對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)AMHR2的影響

分離培養(yǎng)原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，用人促絨腺素HCG(100 ng/ml)處理細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)AMHR2基因表達(dá)水平顯著增加，免疫組化結(jié)果顯示AMHR2表達(dá)較對(duì)照組顯著增加，見(jiàn)圖2，圖3。

綠色熒光為AMHR2，藍(lán)色熒光為DAPI染色細(xì)胞核

圖1 AMHR2在人子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)×200

圖2 MHR2基因在體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)

圖3 細(xì)胞化學(xué)染色AMHR2表達(dá)體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)

3 討論

胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性是影響IVF-ET技術(shù)妊娠率的關(guān)鍵因素。子宮內(nèi)膜容受性的建立需要卵巢性激素、子宮內(nèi)膜局部分子以及胚胎及其分泌的胚胎性因子等共同參與，篩選和驗(yàn)證對(duì)子宮容受性有診斷和治療具有潛力的生物標(biāo)記物具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[8-10]。

AMH-AMHR2信號(hào)通路在卵巢中參與卵泡發(fā)育的2個(gè)關(guān)鍵性步驟，一是抑制始基卵泡的起始募集，阻止其進(jìn)入生長(zhǎng)卵泡池；通過(guò)降低卵泡對(duì)FSH的敏感性抑制竇前卵泡和小竇狀卵泡的生長(zhǎng)。AMH-AMHR2信號(hào)通路參與子宮內(nèi)膜容受性的建立過(guò)程鮮有報(bào)道。

在應(yīng)用新一代RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)VEGF可逆抑制轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究中我們發(fā)現(xiàn)， VEGF對(duì)AMHR2等基因在子宮表達(dá)的差異狀況與小鼠生殖能力密切相關(guān)，AMH-AMHR2信號(hào)通路可能參與宮內(nèi)膜容受性的建立過(guò)程。由此我們對(duì)進(jìn)行IVF-ET助孕患者黃體中期子宮內(nèi)膜AMHR2免疫組化結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，AMHR2主要分布在間質(zhì)細(xì)胞和部分子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞細(xì)胞膜。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞對(duì)HCG的反應(yīng)性的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，HCG具有顯著提高間質(zhì)細(xì)胞AMHR2基因和蛋白的表達(dá)水平。HCG是一種早期胚胎滋養(yǎng)球細(xì)胞和胎盤(pán)滋養(yǎng)層合體細(xì)胞分泌的糖蛋白激素，在胚胎發(fā)育、早期妊娠黃體功能維持和胚胎種植與胎盤(pán)形成過(guò)程中發(fā)揮著不可缺少的生物學(xué)作用[11-13]。臨床應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)，hCG宮腔灌注可以增加母-胎間血液供應(yīng)、延遲子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程和影響母-胎免疫過(guò)程提高輔助生殖技術(shù)臨床妊娠率[14,15]。由此，我們推測(cè)AMHR2是一種具有評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性的重要分子標(biāo)志物，其參與子宮內(nèi)膜容受性建立的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

[1]Andersen AN，Goossens V，Bhattacharya S，et al．Assisted reproductive technology and intrauterine inseminations in Europe，2005:results generated from European registers by ESHRE[J].Hum Reprod，2009，24(6) :1267．

[2]張平貴，馮云.子宮內(nèi)膜容受性的研究進(jìn)展[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，32(8)：1014.

[3]Altm S,Martínez-Conejero JA,Salumets A,et al.Endometrial gene expression analysis at the time of embryo implantation in women with unexplained infertility[J].Mol Hum Reprod,2010,16(3):178.

[4]Gruijters MJ,Visser JA,Durlinger AL,et al.Anti-Müllerian hormone and its role in ovarian function[J].Mol Cell Endocrinol，2003,211(1-2):85.

[5]Elgindy EA,El-Haieg DO,El-Sebaey A.Anti-Miillerianhormone:correlation of early follicular,ovulatory and midluteal levels with ovarian response and cycle outcome in intracytoplasmic sperm injection patients[J].Fertil Steril,2008 ,89:1670.

[6]Fang Y,Lu X,Liu L,et al.VEGF induces anti-Mullerian hormone receptor 2 overexpression in ovarian granulosa cells of IVF/ICSI patients[J].Mol Med Rep,2016,13(6):5157.

[7]蘆小單,方艷秋,紀(jì) 艷,等.可逆抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) 表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠子宮基因轉(zhuǎn)錄譜分析[J].生殖與避孕,2015,7:446.

[8]魏麗坤，張 雷，王藹明.子宮內(nèi)膜容受性的評(píng)價(jià)及其改善措施[J] .生殖與避孕,2008,28(5):298.

[9]武 澤,李 蓉,喬 杰.輔助生殖技術(shù)治療中子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志變化的研究進(jìn)展[J].生殖與避孕，2011，31(8):538.

[10]Hasegawa E,Ito H,Hasegawa F,et al.Expression of leukemia inhibitory factor in the endome-trium in abnormal uterine cavities during the implantation window[J].Fertil Steril,2012,97(4):953.

[11]Tsampalas M,Gridelet V,Berndt S,et al.Human chorionic gonadotropin:a hormone with immunological and angiogenic properties[J].J Reprod Immunol,2010,85(1):93.

[12]Banerjee P,Fazleabas AT.Endometrial responses to embryonic signals in the primate[J].Int JDev Biol,2010,54:295.

[13]Schumacher A,Brachwitz N,Sohr S,et al.Human chorionic gonadotropin attracts regulatory T cells into the fetal-maternal interface during early human pregnancy[J].J Immunol,2009,182(9):5488.

[14]王會(huì)妍，張 帥，張?jiān)粕?胚胎移植前宮腔內(nèi)灌注hCG在IVF-ET中的應(yīng)用及hCG提高種植率和妊娠率的有關(guān)機(jī)制[J].生殖與避孕,2012,32(9):593.

[15]Santiba ez A,García J,Pashkova O，et al.Effect of intrauterine injection of human chorionic gonadotropin before embryo transfer on clinical pregnancy rates from in vitrofertilisation cycles:a prospective study[J].Reprod Biol Endocrinol,2014,12:9.

The expression and correlation studies of Anti?Müllerian hormone receptor 2 in endometrium undergoing IVF

LIULei,LUXiao-dan,LINXiu-ying,etal.

(ReproductiveMedicalCenter,JilinProvincePeople'sHospital,Changchun130021,China)

Objective To investigate the expression and significance of AMHR2 in the endometrium during the implantation window period of the patients with IVF-ET.Methods The expression of AMHR2 in the endometrium of IVF-ET patients during the phase of corpus phase was detected by immunofluorescence staining.The endometrial stromal cells were isolated and cultured,and the cultured cells were treated by hCG for48h.The expression of AMHR2 was detected by method of PCR and Immunohistochemical analysis.Results The expression of AMHR2 were detected in endometrial implantation window,and the levels of AMHR2 gene and protein in endometrial cells were significantly increased after HCG treatment.Conclusion AMHR2 was detected in the endometrium during the implantation window of women,and level of AMHR2 were affected by HCG.AMHR2 might be a reference index to predict endometrial receptivity.

Anti-Mullerian hormone receptor 2，Endometrial receptivity，IVF-ET

吉林省科技廳項(xiàng)目(20160414021GH ，20150414023GH，20150520038JH)；吉林省衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目(2013Q009)

1007-4287(2016)11-1856-03

R335.5

A

2016-01-14)

*通訊作者