Bcl-2抑制劑S1通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞移植瘤生長抑制作用

李亞平，吳 瑤，顏曉羽，薛亞楠，路圣垚，蘇 靜*

(1.吉林省人民醫(yī)院 皮膚科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)系，吉林 長春130021)

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Bcl-2抑制劑S1通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞移植瘤生長抑制作用

李亞平1，吳 瑤2，顏曉羽2，薛亞楠2，路圣垚2，蘇 靜2*

(1.吉林省人民醫(yī)院 皮膚科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)系，吉林 長春130021)

目的 建立小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞移植瘤模型，探討B(tài)cl-2抑制劑S1對其生長的影響及其作用機制。方法 將小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞種植至小鼠腋下，14天后開始用藥物治療，隔天給藥。實驗分為對照組、S1組(0.6 mg/kg)，28天后處死。測量移植瘤的重量。并采用免疫組化法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡相關(guān)蛋白等蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果 與對照組相比，S1處理組能夠明顯降低移植瘤體積、重量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；應(yīng)用S1后移植瘤中Caspase3表達(dá)增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-凋亡相關(guān)蛋白CHOP表達(dá)水平明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 小分子化合物S1可以抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞移植瘤的生長，其作用途徑可能同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號通路相關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；Bcl-2抑制劑

(ChinJLabDiagn,2016,20:1805)

黑色素瘤是臨床上較為常見的皮膚粘膜和色素膜惡性腫瘤，傳統(tǒng)放療、化療療效不佳，患者預(yù)后極差，亟待尋找新的治療方法以及有效藥物靶點[1,2]。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia2，Bcl2)家族蛋白分為抗凋亡Bcl-2蛋白和促凋亡Bcl-2蛋白，Bcl-2蛋白家族不僅參與調(diào)控線粒體途徑的凋亡，而且可能還參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡[3]。前期研究表明Bcl-2小分子抑制劑S1能夠通過線粒體途徑誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞凋亡[4]，但S1在體內(nèi)是否能夠?qū)谏亓鼍哂幸种谱饔蒙形磮蟮?。本文以小鼠黑素色素瘤移植瘤為研究對象，觀察Bcl2抑制劑S1對其生長速度、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平以及凋亡相關(guān)蛋白的影響，探討S1對于小鼠黑色素瘤體內(nèi)移植瘤的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/C 小鼠購自吉林大學(xué)動物實驗中心，雄性，平均體重18g；S1 由大連理工大學(xué)精細(xì)化工國家重點實驗室設(shè)計并提供；anti-GRP78 抗體、anti-Bcl-2抗體、anti-Caspase3抗體、anti-CHOP抗體購自美國 Santa Cruz公司；羊抗鼠 IgG-HRP 和羊抗兔IgG-HRP 購自碧云天公司。B16細(xì)胞由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系保存，含 10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞皮下移植瘤模型的建立

將對數(shù)生長期的B16細(xì)胞與生理鹽水混合，制成單細(xì)胞懸液，按每只1×107個細(xì)胞注入小鼠腋下，共20只。14天后，出現(xiàn)可觸摸的質(zhì)硬腫塊。待移植瘤生長至約 0.3 cm2，隨機分為2組，每組10只。對照組腹腔注射生理鹽水， 治療組(給藥組) 腹腔S1注射(生理鹽水稀釋，濃度0.6 mg/kg)。28天后結(jié)束實驗，麻醉處死小鼠，手術(shù)切除腫瘤組織。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定

應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法，對石蠟包埋的病理切片進(jìn)行特異性抗體標(biāo)記染色。免疫組化染色以細(xì)胞胞漿內(nèi)和/或核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性，陽性細(xì)胞范圍分為0-3級：無陽性細(xì)胞為0；1%-10%為1；11%-50%為2；51%以上為3；染色強度分為0-3級，陰性為0，弱陽性為1，中度陽性為2，強陽性為3。兩者之和即為某蛋白表達(dá)的免疫組化評分。

2 結(jié)果

2.1 S1對小鼠黑色素瘤移植瘤生長的影響

接種小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞后，20只小鼠均存活并有腫瘤形成，成瘤率100%。隨機分組時，對照組和治療組腫瘤體積大致相同。處死后稱重，對照組和治療組瘤重分別為(5.36±0.49)g和(3.41±0.37) g，兩者相比，有顯著性差異(P<0.05)。治療組同對照組相比，腫瘤生長明顯受抑制，S1對小鼠黑色素B16移植瘤的生長有抑制作用。

2.2 S1對小鼠黑色素瘤移植瘤凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)法檢測對照組和S1治療組移植瘤組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Caspase3表達(dá)的水平。結(jié)果顯示，蛋白在對照組的表達(dá)評分的平均分為2.35±0.30，在治療組的表達(dá)評分為4.63±0.47。治療組的Caspase3蛋白的表達(dá)同對照組相比，表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 免疫組化檢測移植瘤組織Caspase3蛋白表達(dá)(×400)

2.3 S1對抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

免疫組織化學(xué)法檢測對照組和S1治療組移植瘤組織內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的水平。結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白在對照組的表達(dá)評分為5.36±0.52，在治療組的表達(dá)評分為2.16±0.39。治療組的Bcl2蛋白表達(dá)同對照組相比，表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 免疫組化檢測移植瘤組織Bcl-2蛋白表達(dá)(×400)

2.4 S1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP的表達(dá)水平的影響

免疫組織化學(xué)法檢測對照組和S1治療組移植瘤組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP蛋白表達(dá)的水平。GRP78、CHOP蛋白在對照組的表達(dá)評分分別為2.76±0.58，2.82±0.43，在治療組的表達(dá)評分為5.25±0.67，4.69±0.36。 治療組的GRP78、CHOP蛋白表達(dá)同對照組相比，表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 免疫組化檢測移植瘤組織GRP78、CHOP蛋白表達(dá)(×400)

3 討論

黑色素瘤是常見的皮膚腫瘤，放化療效果差，患者預(yù)后不佳。尋找有效治療黑色素瘤的靶點可能是黑色素瘤治療的突破點[5]。小分子抑制劑S1是大連理工大學(xué)精細(xì)化工國家重點實驗室自主設(shè)計的靶向藥物，研究表明S1能夠通過線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑以及自噬通路等多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其對卵巢癌細(xì)胞、惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞均具有抑制作用。另有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過PERK-ATF4-CHOP/Bim 以及IRE1a-ASK1-JNK-AP-1/HSF1-HSP70通路在抗腫瘤藥物誘導(dǎo)黑色素瘤的凋亡中發(fā)揮作用[6,7]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有多種管家功能(housekeeping functions)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶Bip，GRP78(78-kDa glucose-regulated protein)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)下同PERK、IREK1、ATF6等結(jié)合，使其失活[8]；當(dāng)缺氧饑餓感染等狀態(tài)，能夠誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時GRP78同這些感受因子解離使其進(jìn)一步活化下游分子，由PERK、IREK1、ATF6等感受因子以及JNK(c-Jun N-terminal kinase 1)及其下游轉(zhuǎn)錄因子XBP1、ATF4、CHOP等信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控并發(fā)揮作用。輕度應(yīng)激狀態(tài)下這些蛋白能夠修復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，但是在長期激烈刺激存在，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡。此外有報道表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時GRP78蛋白表達(dá)能夠上調(diào)，通過Bcl-2家族蛋白(Bim，Noxa，Puma)誘導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞死亡[9]。

本研究中應(yīng)用靶向抗腫瘤藥物BH3-only蛋白模擬物S1，以小鼠黑色素移植瘤為研究對象，探討其抗腫瘤作用及其機制[10]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，S1能夠明顯抑制B16移植瘤的生長速度和體積大小，免疫組化染色結(jié)果顯示S1能夠引起移植瘤中Caspase3蛋白表達(dá)增高，提示S1對移植瘤的抑制作用可能是由凋亡引起的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)S1能夠使黑色素移植瘤中的Bcl2蛋白表達(dá)下降，表明S1能夠誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡；而同對照組相比，應(yīng)用S1治療組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP等蛋白表達(dá)增加，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與S1誘導(dǎo)的小鼠黑色素瘤移植瘤細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤生長作用。

[1]中國黑色素瘤診治指南(2011版)[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2012,2:159.

[2]郭 軍.黑色素瘤治療研究進(jìn)展[J].科技導(dǎo)報,2014,26:15.

[3]Wang X,Olberding KE,White C,et al.Bcl-2 proteins regulate ER membrane permeability to luminal proteins during ER stress-induced apoptosis[J].Cell Death and Differentiation,2011,18:38.

[4]周翔宇,劉 寧,閆 珊,等.S1通過線粒體途徑誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞凋亡[J].中國老年學(xué)雜志,2014,01:122.

[5]練 煉,馬德亮,陶 敏.惡性黑色素瘤的分子靶向治療進(jìn)展[J].實用腫瘤雜志,2010,02:109.

[6]Selimovic D,Badura HE,El-Khattouti A,et al.Vinblastine-induced apoptosis of melanoma cells is mediated by Ras homologous A protein (Rho A) via mitochondrial annonmitochondrial-dependent mechanisms[J].Apoptosis,2013，18:980.

[7]Selimovic D,Porzig BB,El-Khattouti A,et al.Bortezomib/proteasome inhibitor triggers both apoptosis and autophagydependent pathways in melanoma cells[J].Cell Signal ,2013，25:308.

[8]Wang W,Groenendyk J,Michalak M.Endoplasmic reticulum stress associated responses in cancer[J].Biochim Biophys Acta，2014，1843(10):2143.

[10]Pl tz M,Eberle J.BH3-only proteins: possible proapoptotic triggers for melanoma therapy[J].Exp Dermatol,2014 ,23(6):375.

Inhibitory Effects of Bcl-2 inhibitor S1 on Growth of mouse melanoma B16 Cell Xenografts mediated by Endoplasmic Reticulum Stress

LIYa-ping,WUYao,YANXiao-yu,etal.

(People’sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China)

Objective This study was to establish tranplanted mouse melanoma models and investigate the inhibitory effects of Bcl-2 inhibitor S1 on them.Methods Mouse melanoma B16 cells were implanted into the mice under the armpit.The mice were treated with S1 every two days after 14 days,and were killed 28 days latter.Tumor volume and weight were measured.The experssion of proteins involed in Endoplasmic Reticulum Stress(ERS) and apoptosis were observed by immunohistochemistry.Results Compared with the control group，the average tumor volume was smaller and the average tumor weight were lighter in S1 group;the average experssion of Capase3 was higher,the experssion of Bcl-2 was lower,the experssion of proteins relating with ERS-GRP78 and CHOP were higher.Conclusion S1 inhibits the growth of B16 cells xenografts in mice,ERS may be related to the process.

Endoplasmic Reticulum Stress;apoptosis;Bcl-2 inhibitor

國家自然科學(xué)基金面上項目(81472419,81272876)

1007-4287(2016)11-1805-04

R392

A

2016-03-21)

*通訊作者