利用RNA-seq技術(shù)分析棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星特征

姜玉松， 樊汶樵， 徐敬明

(1. 重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶 402160； 2. 重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究中心，重慶 402168)

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利用RNA-seq技術(shù)分析棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星特征

姜玉松1， 樊汶樵1， 徐敬明2*

(1. 重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶 402160； 2. 重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究中心，重慶 402168)

棘腹蛙Paaboulengeri的遺傳研究和基因組信息比較匱乏，致使可有效利用的分子標(biāo)記非常有限。以棘腹蛙RNA-seq高通量測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行微衛(wèi)星分子標(biāo)記的大規(guī)模發(fā)掘和特征分析，結(jié)果顯示：在121.6 Mb的棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列中發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星位點(diǎn)3165個(gè)，包含于3034條Contig序列中。在篩選到的1～6堿基重復(fù)核心的微衛(wèi)星中，單堿基重復(fù)核心的比例最高，之后為三堿基、二堿基、四堿基、六堿基和五堿基重復(fù)核心，分別占29.0%、25.2%、21.7%、10.0%、10.0%和3.0%。其中A/T、AC/GT、AGG/CCT、ACAT/ATCT、AAAAT/ATTTT和AAAAAG/CTTTTT分別是單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基重復(fù)類(lèi)型中對(duì)應(yīng)的優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元。棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星多為重復(fù)長(zhǎng)度小于24 bp的短序列，長(zhǎng)度大于24 bp的微衛(wèi)星僅占總數(shù)的0.92%。對(duì)編碼區(qū)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列分析發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星側(cè)翼序列的GC含量顯著低于轉(zhuǎn)錄組整體GC含量，且在含有微衛(wèi)星上下游側(cè)翼序列的Contig中，71.9%的序列可以設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增出含有微衛(wèi)星序列的位點(diǎn)。研究結(jié)果為棘腹蛙的遺傳研究和分子系統(tǒng)地理學(xué)研究提供了豐富的序列信息和標(biāo)記資源。

高通量測(cè)序；棘腹蛙；微衛(wèi)星

棘腹蛙Paaboulengeri又名石坑、石蛙等，隸屬于兩棲綱Amphibia無(wú)尾目Anura蛙科Ranidae，廣泛分布于我國(guó)四川、重慶等地(費(fèi)梁等，2005)，是我國(guó)特有的大型野生蛙類(lèi)。近年來(lái)，由于水體污染、生態(tài)環(huán)境破壞等因素，野生棘腹蛙資源日趨匱乏，種群規(guī)模不斷縮小，已被《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)》列為易危物種(趙爾宓，2000)。保護(hù)現(xiàn)存的野生種群，采取科學(xué)的繁殖配對(duì)措施以避免近交衰退和遺傳多樣性丟失，已成為目前棘腹蛙保護(hù)和養(yǎng)殖中面臨的關(guān)鍵問(wèn)題。

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)又稱(chēng)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR),突變率高、多態(tài)性強(qiáng)，是研究種群遺傳多樣性、近交衰退、種群遺傳結(jié)構(gòu)和適應(yīng)潛力、分類(lèi)和系統(tǒng)進(jìn)化等的有力工具(曾聰?shù)龋?013)。微衛(wèi)星普遍存在于原核、真核生物基因組中，其側(cè)翼序列比較保守，核心區(qū)以1～6個(gè)堿基組成串聯(lián)重復(fù)序列(Mrazeketal.，2007)。傳統(tǒng)的微衛(wèi)星序列獲取主要有3種途徑：一是利用其他物種已有的標(biāo)記進(jìn)行直接克隆，這種方法在中國(guó)魚(yú)類(lèi)群體遺傳結(jié)構(gòu)研究中較常見(jiàn)，如利用鯉Cyprinuscarpio標(biāo)記分析鰱魚(yú)Hypophthalmichthysmolitrix、鳙Aristichthysnobilis、草魚(yú)Ctenopharynodonidellus等的研究都有報(bào)道(Tongetal.，2002；廖小林等，2005；Zhengetal.，2007)。然而，這種方法工作量大、效率低，而且高度依賴(lài)于側(cè)翼序列的保守性；二是構(gòu)建富含微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因組文庫(kù)(Changetal.，2005)，通過(guò)雜交篩選出含有微衛(wèi)星序列的陽(yáng)性克隆，但是篩選過(guò)程較復(fù)雜，篩選效率低，需要大量的人力和資金的投入；三是基于“生物素-磁珠”富集的微衛(wèi)星序列克隆技術(shù)(Kijasetal.，1994)，該技術(shù)使微衛(wèi)星這一共顯性標(biāo)記能夠高效快速地克隆，因此很快用于種質(zhì)鑒定和育種研究之中。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為微衛(wèi)星測(cè)序帶來(lái)了革命性的變化，可實(shí)現(xiàn)一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，使得從基因組和轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)一個(gè)物種進(jìn)行全面分析成為可能。目前已經(jīng)在草魚(yú)、鰱魚(yú)、團(tuán)頭魴Megalobramaamblycephala、斑馬魚(yú)Daniorerio、中國(guó)對(duì)蝦Fenneropenaeuschinensis等數(shù)百個(gè)物種中進(jìn)行了大規(guī)模測(cè)序和微衛(wèi)星分布特征分析(曾聰?shù)龋?013)。這些結(jié)果為遺傳多樣性分析、連鎖圖譜制作、疾病連鎖分析和品種鑒定等方面提供了可能。

本研究利用RNA-seq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)棘腹蛙進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并分析其微衛(wèi)星序列組成及特征，旨在了解棘腹蛙微衛(wèi)星的特征，繼而為微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

棘腹蛙采自重慶酉陽(yáng)，生長(zhǎng)在本實(shí)驗(yàn)室的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中。隨機(jī)挑選健康的2齡成蛙6只，采集皮膚、肝臟、腎臟、肌肉、腦、心臟組織，立即用液氮冷凍，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取

總RNA提取參照Trizol試劑盒(Invitrogen，美國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RNA的完整性通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，濃度用紫外分光光度計(jì)(Amersham，美國(guó))檢測(cè)。各組織RNA經(jīng)檢測(cè)后等量混合，基于Illumina公司的Hiseq 2000進(jìn)行RNA測(cè)序。

1.3 Contig序列的獲取

以FastQC軟件(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc)評(píng)估轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量，利用Trim_galore腳本(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/trim_galore)去除低質(zhì)量序列和接頭序列，獲得Clean Reads數(shù)據(jù)。

Clean Reads用Trinity軟件包(https://trinityrnaseq.github.io)進(jìn)行denovo組裝，使用cd-est-hit軟件(http://weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit)進(jìn)行序列聚類(lèi)，去除冗余。

1.4 微衛(wèi)星分析

微衛(wèi)星位點(diǎn)的搜索及分析，采用Misa腳本(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)從Contig轉(zhuǎn)錄本中查找1～6堿基重復(fù)核心的微衛(wèi)星位點(diǎn)，微衛(wèi)星的查找標(biāo)準(zhǔn)為不同重復(fù)核心的微衛(wèi)星總重復(fù)序列長(zhǎng)度不低于18個(gè)核苷酸(1～18，2～9，3～6，4～5，5～4，6～3)，2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的間隔最大為10 bp(Kofleretal.，2008)。側(cè)翼序列的查找通過(guò)自編Perl腳本，對(duì)微衛(wèi)星核心序列上游100 nt和下游100 nt(剔除上下游序列少于50 nt的Contig)進(jìn)行GC含量分析，用Blastn程序?qū)ξ⑿l(wèi)星側(cè)翼序列比對(duì)分析，其中E值設(shè)置為1.0 E-5。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序及拼接結(jié)果

利用Illumina Solax測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)Trim_galore腳本去除低質(zhì)量序列和接頭序列，獲得76 891 848對(duì)長(zhǎng)度為100 bp的Clean Reads。經(jīng)Trinity軟件包拼接及cd-hit-est聚類(lèi)后獲得94 108條無(wú)冗余的Contig序列，平均長(zhǎng)度1293 bp，最大長(zhǎng)度17 335 bp，共121.6 Mb的棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列(表1)，其中AT比例為52.33%，GC比例為47.67%。

2.2 微衛(wèi)星序列的查找

微衛(wèi)星按重復(fù)序列結(jié)構(gòu)的不同，可分為完整型微衛(wèi)星(Perfect)、不完整型微衛(wèi)星(Imperfect)以及復(fù)合型微衛(wèi)星(Compound)。完整型微衛(wèi)星是由1種重復(fù)單元以不間斷的重復(fù)方式構(gòu)成單一重復(fù)類(lèi)型的微衛(wèi)星；不完整型微衛(wèi)星是指2個(gè)或2個(gè)以上的同類(lèi)型重復(fù)單元被3個(gè)或3個(gè)以下的非重復(fù)堿基分隔；復(fù)合型微衛(wèi)星指2個(gè)或2個(gè)以上的不同重復(fù)單元序列被3個(gè)或者3個(gè)以上連續(xù)的非重復(fù)堿基所間隔(Weber，1990)。本研究通過(guò)Misa腳本對(duì)棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組Contig序列進(jìn)行微衛(wèi)星查找，從總長(zhǎng)為121 644 048 bp的94 108條Contig序列中發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星位點(diǎn)3165個(gè)，包含于3034條Contig序列中，其中完整型微衛(wèi)星、不完整型微衛(wèi)星以及復(fù)合型微衛(wèi)星分別為3023個(gè)、112個(gè)和15個(gè)(表2)。

表1 棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝質(zhì)量評(píng)估

表2 棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列微衛(wèi)星預(yù)測(cè)

2.3 微衛(wèi)星豐度分析

棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組Contig數(shù)據(jù)庫(kù)中，單堿基重復(fù)的微衛(wèi)星含量最多，約占總數(shù)的29.0%，其次為三堿基(25.2%)、二堿基(21.7%)、四堿基(10.0%)、六堿基(10.0%)、五堿基(3.0%)(表3)。從棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星分布的密度來(lái)看，平均每Mb堿基中出現(xiàn)26.01個(gè)微衛(wèi)星，不同重復(fù)類(lèi)型微衛(wèi)星數(shù)量和密度有明顯差異(表3)。

表3 不同重復(fù)類(lèi)型微衛(wèi)星所占比例及分布密度

2.4 優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元堿基在棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星中的組成

每種堿基重復(fù)單元包含不同種類(lèi)的堿基，其中單堿基微衛(wèi)星由2種不同的重復(fù)單元堿基組成，二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基微衛(wèi)星分別由3種、10種、23種、38種和83種組成，復(fù)合型微衛(wèi)星由21種不同重復(fù)單元組成。對(duì)棘腹蛙不同類(lèi)型微衛(wèi)星中各重復(fù)單元數(shù)量的變化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)單堿基重復(fù)微衛(wèi)星中，A/T為最主要的重復(fù)單元，共863個(gè)，占93.3%；在二堿基重復(fù)類(lèi)型中，AC/GT重復(fù)的數(shù)量最多，共436個(gè)，占60.4%；在三堿基重復(fù)類(lèi)型中，AGG/CCT為最主要的重復(fù)單元，占22.8%，其次為ATC/ATG(18.7%)、AAT/ATT(17.9%)、ACC/GGT(12.3%)、AGC/CTG(12.3%)，其他重復(fù)堿基類(lèi)型則相對(duì)較少；在四堿基重復(fù)類(lèi)型中，ACAT/ATCT數(shù)量最多，占31.6%，五堿基重復(fù)類(lèi)型中，AAAAT/ATTTT重復(fù)的數(shù)量最多，共36個(gè)，占21.6%，其他的重復(fù)類(lèi)型較少；六堿基重復(fù)類(lèi)型中，AAAAAG/CTTTTT和AAGCTC/AGCTTG的重復(fù)數(shù)量最多，分別占11.4%和10.1%。

2.5 棘腹蛙微衛(wèi)星長(zhǎng)度分布及變異分析

根據(jù)Misa腳本的查找結(jié)果，棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星的平均長(zhǎng)度為20.4 bp，最長(zhǎng)為136 bp，以18～24 bp為主，長(zhǎng)度大于24 bp的微衛(wèi)星僅占0.92%(圖1)。為了解不同長(zhǎng)度重復(fù)單元微衛(wèi)星長(zhǎng)度的變異情況，對(duì)不同重復(fù)類(lèi)型微衛(wèi)星的相對(duì)豐度與重復(fù)次數(shù)的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明棘腹蛙微衛(wèi)星相對(duì)豐度隨著重復(fù)次數(shù)的增加而減少，但不同長(zhǎng)度重復(fù)單元微衛(wèi)星的下降速度不同。單堿基核心重復(fù)次數(shù)超過(guò)24(數(shù)據(jù)未顯示)、二堿基超過(guò)12、三堿基超過(guò)8、四堿基超過(guò)6、五堿基超過(guò)5、六堿基超過(guò)4后相對(duì)豐度接近于0。從重復(fù)次數(shù)變化看出，三堿基核心微衛(wèi)星長(zhǎng)度的變化次數(shù)最高，二堿基和四堿基核心次之，六堿基核心次數(shù)最少(表4)。

圖1 棘腹蛙微衛(wèi)星長(zhǎng)度分布及不同長(zhǎng)度微衛(wèi)星頻率

2.6 棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星側(cè)翼序列分析

利用perl腳本截取微衛(wèi)星序列上下游各100 nt的側(cè)翼序列進(jìn)行GC含量分析，結(jié)果顯示棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星上游序列的GC含量主要集中在38%左右(圖2：A)，下游序列的GC含量主要在41%左右(圖2：B)，均顯著低于轉(zhuǎn)錄組整體GC含量(47%)(圖2：C)。利用本地Blastn程序?qū)Τ蓪?duì)存在的上下游側(cè)翼序列(1160對(duì))與組裝的棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)上下游側(cè)翼序列的查詢(xún)覆蓋率均為100%，其中834對(duì)側(cè)翼序列為單拷貝，326對(duì)側(cè)翼序列查詢(xún)?yōu)槎嗫截?，特異性比例?1.9%。

表4 不同重復(fù)單元微衛(wèi)星長(zhǎng)度變異分析

3 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記是了解種群結(jié)構(gòu)、種群動(dòng)態(tài)和基因流等分子生態(tài)學(xué)問(wèn)題的重要工具之一(Roweetal.，2000)。近年來(lái)，該技術(shù)在兩棲動(dòng)物分子生態(tài)學(xué)的研究中日趨增多，但相對(duì)于其他脊椎動(dòng)物的研究仍處于初級(jí)階段，可能與兩棲動(dòng)物基因組中存在大量的重復(fù)序列，導(dǎo)致較低的微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選成功率有關(guān)(Garner，2002；Jehle & Arntzen，2002；Yuanetal.，2015)。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了棘腹蛙總長(zhǎng)為121 644 048 bp 的編碼區(qū)序列，獲得了3165個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(表2)，豐富了棘腹蛙微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)，為后續(xù)棘腹蛙不同群體的鑒定及地理生態(tài)學(xué)的研究提供了基礎(chǔ)資料。

棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組中單堿基(A/T)重復(fù)是最豐富的一類(lèi)微衛(wèi)星，占編碼區(qū)微衛(wèi)星總量的27.3%，屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)類(lèi)型。然而，考慮到本研究是基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行的挖掘，單堿基(A/T)重復(fù)的高豐度可能與mRNA的poly(A/T)結(jié)構(gòu)有關(guān)。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，我們統(tǒng)計(jì)了位于Contig序列3’或者5’端的微衛(wèi)星數(shù)量，結(jié)果顯示88.2%的A/T核心重復(fù)微衛(wèi)星位于Contig序列的3’或者5’端(數(shù)據(jù)未顯示)，說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到的微衛(wèi)星標(biāo)記，尤其是以A/T為重復(fù)核心的微衛(wèi)星標(biāo)記存在較多的假陽(yáng)性，在微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)該加以區(qū)分。

圖2 微衛(wèi)星側(cè)翼序列及轉(zhuǎn)錄組GC含量分析

A. 微衛(wèi)星上游側(cè)翼序列GC含量The GC content of upstream flanking sequences of microsatellite, B. 微衛(wèi)星下游側(cè)翼序列GC含量The GC content of downstream flanking sequences of microsatellite, C. 轉(zhuǎn)錄組序列GC含量The GC content of transcriptomic sequences.

目前已在小樹(shù)蛙Dendropsophusminutus、高山倭蛙Nanoranaparkeri、鳙、巖原鯉Procyprisrabaudi、長(zhǎng)江江豚Neophocaenaphocaenoidesasiaeorientalis等物種中分離出大量的微衛(wèi)星分子標(biāo)記(魯翠云等，2005；袁慧等，2008；鄭勁松等，2008；Wangetal.，2013；Oyamaguchietal.，2015)，主要以二堿基核苷酸核心序列為主，然而在棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列中，三堿基重復(fù)類(lèi)型是僅次于單堿基重復(fù)的類(lèi)型(表3)。Kijas等(1997)在有關(guān)于堿基重復(fù)類(lèi)型的研究中指出，三堿基和四堿基重復(fù)單元比二堿基重復(fù)單元具有更高的遺傳穩(wěn)定性。但由于三堿基、四堿基核苷酸在真核生物基因組重復(fù)較少，傳統(tǒng)的分離方法效率較低，能夠獲得的序列有限，而高通量測(cè)序的應(yīng)用完美地解決了這個(gè)難題。曾曉蕓等(2015)通過(guò)Mi-Seq篩選裸體異鰾鰍Xenophysogobionudicorpa的微衛(wèi)星標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)三堿基重復(fù)類(lèi)型中優(yōu)勢(shì)類(lèi)型是AAT。而本實(shí)驗(yàn)中卻是AGG，原因可能是通過(guò)編碼區(qū)篩選到的微衛(wèi)星與基因組篩選微衛(wèi)星存在差異(周小龍等，2013)。棘腹蛙二核苷酸重復(fù)類(lèi)型中AC/GT重復(fù)最多，與中國(guó)對(duì)蝦、雜色鮑Haliotisdiversicolor和刺參Apostichopusjaponicus等大多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物的研究結(jié)果相一致(孫國(guó)華等，2010)，推測(cè)這可能與不同編碼基因的堿基組成偏好及體內(nèi)甲基化酶活性有關(guān)。在四堿基、五堿基、六堿基重復(fù)中，重復(fù)單元種類(lèi)分別有23種、38種和83種，重復(fù)類(lèi)型豐富，但分布相對(duì)分散，說(shuō)明堿基偏倚性不太明顯。從棘腹蛙微衛(wèi)星的單元重復(fù)次數(shù)和長(zhǎng)度來(lái)看，主要集中在6次重復(fù)，約20 bp(圖1，表4)。通常認(rèn)為微衛(wèi)星重復(fù)單元長(zhǎng)度的變化與選擇壓力密切相關(guān)，重復(fù)單元長(zhǎng)度越長(zhǎng)，所受的選擇壓力越大，拷貝數(shù)就越少，因此基因組中長(zhǎng)度較短的微衛(wèi)星變異速率較快，而較長(zhǎng)的重復(fù)單元變異速率較慢，相對(duì)較為穩(wěn)定(Samadietal.，1998)。

微衛(wèi)星DNA均由中間的核心區(qū)和外圍的側(cè)翼區(qū)兩部分構(gòu)成(Mrazeketal.，2007)。核心區(qū)為串聯(lián)在一起的重復(fù)序列，重復(fù)單元數(shù)目多樣，串聯(lián)重復(fù)單元的上下游序列為側(cè)翼區(qū)。對(duì)棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星側(cè)翼序列的分析發(fā)現(xiàn)，上游與下游側(cè)翼區(qū)GC含量均低于轉(zhuǎn)錄組整體(圖2)，這在一定程度上說(shuō)明側(cè)翼序列對(duì)AT的偏好性。利用本地Blastn程序?qū)Τ蓪?duì)存在的1160對(duì)上下游側(cè)翼序列與所測(cè)的棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)834對(duì)側(cè)翼序列位于單一微衛(wèi)星的兩側(cè)，為單拷貝，根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)引物能夠特異擴(kuò)增出含有相應(yīng)微衛(wèi)星序列的位點(diǎn)；另有326對(duì)側(cè)翼序列不僅僅出現(xiàn)在微衛(wèi)星的兩側(cè)，同時(shí)也出現(xiàn)在非微衛(wèi)星區(qū)域，為多拷貝，因此根據(jù)這些側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物不能特異性地?cái)U(kuò)增出微衛(wèi)星位點(diǎn)。在常規(guī)的微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)中，通常利用試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行篩選，工作耗時(shí)又存在誤差。本研究中利用序列比對(duì)分析，可以為后期微衛(wèi)星引物的開(kāi)發(fā)提供一種可靠而快速的方法。

盡管轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星標(biāo)記在揭示遺傳多樣性方面要低于基因組微衛(wèi)星標(biāo)記，但是由于轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星代表了編碼基因表達(dá)的信息，能為功能基因提供“絕對(duì)”標(biāo)記(張瓊等，2010；周小龍等，2013)，而且轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星標(biāo)記的種間通用性較好，從而更有利于分子生態(tài)學(xué)的研究。因此，本研究微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)對(duì)棘腹蛙的親子譜系分析、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、圖譜構(gòu)建以及分子輔助育種等研究方面具有重要參考和利用價(jià)值。

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四川鳥(niǎo)類(lèi)新紀(jì)錄——黑翅鳶

2015年3月28日09∶30左右，在攀枝花市鹽邊縣紅格鎮(zhèn)新農(nóng)村境內(nèi)(26°28′28.08″N，101°53′25.86″E，海拔1234 m)發(fā)現(xiàn)2只鷹科鳥(niǎo)類(lèi)，經(jīng)相機(jī)拍攝和雙筒望遠(yuǎn)鏡觀察確認(rèn)為黑翅鳶Elanuscaeruleus。發(fā)現(xiàn)時(shí)該鳥(niǎo)停歇于農(nóng)田和果園附近的電線上，一段時(shí)間后，2只黑翅鳶突然起飛并4爪抓握，在空中進(jìn)行翻騰和旋轉(zhuǎn)。該鳥(niǎo)體長(zhǎng)30～35 cm，全身以白、黑、藍(lán)灰色為主基調(diào)。眼先及眼上部呈黑色，虹膜呈血紅色，喙黑色。前額至頭頸部為白灰色，后頸、背、腰、尾上覆羽、初級(jí)飛羽、次級(jí)飛羽及初級(jí)覆羽呈藍(lán)灰色。小覆羽和中覆羽呈黑色。除初級(jí)飛羽下表面呈黑色外，整個(gè)腹面和翅下覆羽為白灰色。趾和跗跖呈深黃色，爪黑色，跗跖一半被羽，一半裸露。平尾，尾羽中間略凹。

黑翅鳶隸屬于隼形目Falconiformes鷹科Accipitridae黑翅鳶屬Elanus，為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)鳥(niǎo)類(lèi)，現(xiàn)已被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ(2015)。其主要分布于非洲、亞洲南部、歐洲西南部和美洲(高瑋，2002；Karaka，2012)，在國(guó)內(nèi)見(jiàn)于云南、廣西、浙江、河北、海南、廣東、福建、香港、臺(tái)灣、江西、山東、天津、北京(史海濤，1998；高育仁等，2002；林清閑等，2004；單凱等，2005；王鳳琴等，2006；聞丞等，2013)，近年來(lái)有向北擴(kuò)散的趨勢(shì)(單凱等，2005；王鳳琴等，2006；聞丞等，2013)。

此前西昌的薛敏先生(網(wǎng)名：美文兄)于2013年11月14日在西昌邛海曾拍攝到2只黑翅鳶，但已有文獻(xiàn)資料(李桂垣等，1985；李桂垣，1993；張俊范，2007；徐雨等，2008；鄭光美，2011)及觀鳥(niǎo)記錄中尚無(wú)該鳥(niǎo)在四川分布的正式報(bào)道。因此，此次發(fā)現(xiàn)的黑翅鳶應(yīng)為四川鳥(niǎo)類(lèi)新紀(jì)錄。

黑翅鳶Elanus caeruleus (王平 攝)

王疆評(píng)1, 王平2, 劉洋1, 孫治宇1, 鐘光輝2

(1. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院，成都610081； 2. 宜賓學(xué)院，四川宜賓644000)

E-mail：31696343@qq.com

Analysis of Microsatellite Composition inPaaboulengeriusing RNA-seq

JIANG Yusong1, FAN Wenqiao1, XU Jingming2*

(1. College of Life Science & Forestry, Chongqing University of Art & Science, Chongqing 402160, China;2. Chongqing Research Centers of Conservation & Development on Rare & Endangered Aquatic Resources, Chongqing 402168, China)

The genetic and genomic information ofPaaboulengeriwas relatively lacking, which have caused a limited number of effective DNA markers. Based on the RNA-seq database, microsatellite markers inP.boulengeriwere analyzed by the Misa program. A total of 3165 microsatellite loci that occurred in 3034 Contig sequences were identified in a total of 121.6 Mb nucleotides. Mononucletide repeats was the major types, followed by the trinucleotide, dinucleotide, tetranucleotide, hexanucleoide and pentanucleotide, accounting for 29.0%, 25.2%, 21.7%, 10.0%, 10.0% and 3.0%, respectively. A/T, AC/GT, AGG/CCT, ACAT/ATCT, AAAAT/ATTTT and AAAAAG/CTTTTT were the most frequent motifs in mon-, din-, tri-, tetra-, penta- and hexa-nucleotide repeats, and all of them were rich in A or T. The average length of microsatellites in the coding region ofP.boulengeriwas 18-24 bp, and the length more than 24 bp only accounted for 0.92%. In addition, we found that the GC content of the flanking sequences was significantly lower than that of transcriptomic sequences. For the Contig sequences with paired flanking sequences longer than 50 nt, 71.9% of them contained the sequences corresponding to the predicted microsatellite loci as determined by PCR. These results provided abundant sequences and microsatellite markers for molecular phylogeography and genetic research onP.boulengeri.

high-throughput sequencing;Paaboulengeri; microsatellite

10.11984/j.issn.1000-7083.20150147

2015-04-24 接受日期：2015-10-10 基金項(xiàng)目:重慶文理學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(R2014LX07，R2013LS13); 重慶市前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究(一般)項(xiàng)目(cstc2014jcyjA80042); 重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃(cstc2012gg-yyjs80004)

姜玉松(1984—), 博士, 講師, 主要從事基因的分子生物學(xué)研究, E-mail:jysong@126.com

*通信作者Corresponding author， 博士, 教授, 主要從事兩棲動(dòng)物的分子系統(tǒng)地理學(xué)研究, E-mail:proteomics@163.com

Q78; Q959.5

A

1000-7083(2016)01-0024-07

全國(guó)第二次陸生野生動(dòng)物調(diào)查——金沙江雅礱江切割山地