蘆竹屬新材料綠洲3號的愈傷組織誘導(dǎo)

林志魁，羅宗志，梅 蘭，劉宏偉，吳金壽，林占熺

(1.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

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蘆竹屬新材料綠洲3號的愈傷組織誘導(dǎo)

林志魁1,2，羅宗志2,3，梅 蘭1,2，劉宏偉1,2，吳金壽2，林占熺2

(1.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

為了誘導(dǎo)愈傷組織，本研究以綠洲3號(Arundo)為試驗(yàn)材料，分別以NaClO(商品名為安替福民)和HgCl2(升汞)對其莖段進(jìn)行消毒，然后取無菌莖段及從無菌莖段長出來的幼芽和幼葉為外植體，利用不同濃度的激素及1.0 g·L-1聚乙烯吡咯烷酮對外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。結(jié)果表明,以0.1% HgCl2溶液消毒18 min的消毒效果最佳，污染率為13%；而NaClO不能有效地消毒，且對莖段有一定的毒害作用。以MS+0.5 mg·L-16-BA+1.0 g·L-1PVP+3.0 mg·L-12,4-D培養(yǎng)基配方的誘導(dǎo)效果最佳，且3種外植體中愈傷組織最難誘導(dǎo)的為幼葉，其次是莖段，最易誘導(dǎo)的為幼芽。其中，1.0 g·L-1PVP能顯著促進(jìn)芽誘導(dǎo)率，使得出愈率達(dá)到100%。

綠洲3號；莖段；愈傷組織；安替福民；PVP

綠洲3號(Arundo)原取于福建省福州市永泰縣，是一種單子葉禾本科蘆竹屬植物，未確定其種，植株高大直立，根系發(fā)達(dá)，為多年生叢生草本植物。由國家菌草工程技術(shù)研究中心引進(jìn)該草，可作為栽培靈芝、猴頭菇和杏鮑菇等多種食用菌的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)料，而目前較多應(yīng)用在園林綠化以及制備生物質(zhì)材料和植物纖維板材料，且是防風(fēng)治沙的優(yōu)良草種。2013年5月17日將其與巨菌草相結(jié)合用于內(nèi)蒙古阿拉善防沙固沙，成效顯著。其莖桿直立、挺拔、中空，株高通常為7 m，莖粗約3 cm，葉長68.0～73.5 cm，葉寬6.6～8.0 cm，可分枝，每個(gè)節(jié)均能長芽。蘆竹被稱為低洼鹽堿地的“先鋒植物”，因其耐寒、耐旱、耐鹽堿，且在貧瘠的土壤里具有一定的忍耐力[1-2]，可以在鹽沼、沙地、后備土地及廢棄礦場進(jìn)行種植，從而一定程度上緩解我國耕地面積緊張的狀況。蘆竹主要分布于我國的12個(gè)省(區(qū))，北起遼寧、安徽，南至福建、臺灣、廣西等，已經(jīng)形成了一定規(guī)模的生產(chǎn)地區(qū)，主要分布于江蘇省及沿海等地區(qū)。蘆竹用途廣泛，根莖是很好的中藥材，具有止嘔生津、清熱瀉火的功效[3]；枝葉細(xì)嫩多汁，是牲畜的良好青貯飼料[4]；莖稈是優(yōu)質(zhì)造紙?jiān)蟍5]和良好的管樂簧片材料，并可編織用具和制造人造絲[4]。此外，蘆竹對Ni、Cd、Hg和Pb等重金屬有良好的吸附作用，可用于改善和修復(fù)土壤的重金屬污染[6-7]。國內(nèi)關(guān)于蘆竹的研究較多的集中在濕地中的生理和生態(tài)特征及對重金屬的富集和耐性等方面[7-10]。除已見報(bào)道的關(guān)于蘆竹腋芽萌發(fā)、增殖及生根培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化[11]外，近年來，對于蘆竹快繁體系建立的報(bào)道并不多見。在2015年，中國保護(hù)黃河基金會(huì)已批準(zhǔn)設(shè)立“菌草工程技術(shù)保護(hù)黃河流域?qū)ｍ?xiàng)基金”。由于綠洲3號在抗寒性、防止水土流失和荒漠化上成效顯著，所以未來5年將在黃河沿岸大面積種植綠洲3號，在這之前急需解決綠洲3號的快繁體系和相關(guān)技術(shù)問題。本研究對綠洲3號的愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行初步探索，以期為綠洲3號組織培養(yǎng)體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為綠洲3號的推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

綠洲3號是蘆竹屬植物，未確定其種，由國家菌草工程技術(shù)研究中心提供，是試驗(yàn)中的新材料，取其分枝的枝條為外植體。

1.2 方法

1.2.1 獲得無菌外植體

無菌莖段的制備:以單節(jié)綠洲3號的莖段為外植體，將莖段去掉葉片剪成2～3 cm長的小段，每個(gè)莖段保留一個(gè)節(jié)。剪取新鮮植物材料后，放入洗衣粉中漂洗30 min，用流水沖洗1 h，在超凈工作臺上用無菌水沖洗3次，用75%的乙醇浸泡30 s，以不同濃度的 HgCl2(升汞)和NaClO(商品名安替福民)分別浸泡不同的時(shí)間，再用無菌水沖洗3遍。其中，HgCl2濃度分別為0.1%、0.5%和1.0%，浸泡時(shí)間為6、12、18 min；NaClO濃度分別為10%、30%和60%，浸泡時(shí)間為10、20、30 min。放入無菌濾紙上吸干表面的水分[12]。將經(jīng)過消毒剪切的莖段放入MS培養(yǎng)基上，各設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理8瓶，每瓶接種4個(gè)，3次重復(fù)。 25 ℃光照條件下培養(yǎng)，7 d后統(tǒng)計(jì)污染率和發(fā)芽率，比較消毒效果。

無菌芽制備:以綠洲3號無菌莖段長出的芽為外植體，將無菌芽切成0.5～0.8 cm，放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，設(shè)8個(gè)處理，每個(gè)處理8瓶，每瓶接種4個(gè)，3次重復(fù)。在25 ℃條件下暗培養(yǎng)，30 d后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率。

無菌幼葉制備:以綠洲3號無菌莖段長出的幼葉為外植體，取無菌苗的幼葉切成大小0.5～1.0 cm放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，設(shè)8個(gè)處理，每個(gè)處理8瓶，每瓶接種4個(gè)，3次重復(fù)。在25 ℃條件下暗培養(yǎng)，30 d后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 將外植體接種到MS基本培養(yǎng)基上，并附加不同濃度的6-BA和2,4-D組合。將外植體材料接種含2,4-D濃度分別為0.5、2、3 mg·L-1的MS+0.5 mg·L-16-BA+1.0 g·L-1PVP培養(yǎng)基中，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理接種32瓶，3次重復(fù)，接種30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

污染率=(污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

發(fā)芽率=(發(fā)芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體/接種的外植體總數(shù)×100%。

取以上各處理3次重復(fù)的平均值為結(jié)果數(shù)據(jù)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖段消毒

2.1.1 HgCl2對綠洲3號莖段的消毒效果 利用不同濃度的HgCl2對外植體進(jìn)行不同時(shí)間的消毒試驗(yàn)，結(jié)果表明(表1),A1處理的污染率最高，達(dá)到了19%，A2和A3差異不顯著(P>0.05)，而從A5到A9均未發(fā)現(xiàn)污染，但是發(fā)芽率都低于40%，特別是A8和A9的發(fā)芽率僅約為6%。發(fā)芽率除A2、A3之間，A9、A8之間差異不顯著外，其它各處理間差異顯著(P<0.05)。隨著HgCl2處理濃度的升高與消毒時(shí)間的延長，污染率下降，除A1、A2和A3外發(fā)芽率也呈下降趨勢。但是，使用0.1% HgCl2為消毒劑時(shí)，隨時(shí)間的延長，污染率下降，而發(fā)芽率卻逐漸上升，與其它處理濃度所表現(xiàn)出的結(jié)果相反，具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用升汞對綠洲3號莖段進(jìn)行消毒的最佳條件為0.1%升汞消毒18 min。

2.1.2 NaClO對綠洲3號莖段的消毒效果 NaClO消毒外植體的發(fā)芽率在0～23%，且消毒10、20 min外植體的污染率在84%～99%，消毒30 min外植體污染率在45%～60%(表2)。B6、B7、B8和B9處理的發(fā)芽率為0。從B1到B5處理中B3處理的污染率顯著低于另外4個(gè)處理(P<0.05)，因此，10%NaClO消毒30 min的處理效果最佳。

表1 不同濃度的HgCl2對綠洲3號莖段的消毒效果Table 1 The disinfection effect of different HgCl2 concentrations on stems of Lvzhou No.3

注：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lower case letters within the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same below.

表2 不同濃度的NaClO對綠洲3號莖段的消毒效果Table 2 The disinfection effect of different NaClO concentrations on stems of Lvzhou No.3

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

2.2.1 6-BA和2,4-D對綠洲3號幼葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響 分別以MS+0.5 mg·L-16-BA和MS+2.0 mg·L-16-BA作為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的2,4-D，共8個(gè)處理，在以綠洲3號幼葉為外植體中，隨著2,4-D濃度的增加，經(jīng)1個(gè)月培養(yǎng)均未產(chǎn)生愈傷組織。加入不同濃度2,4-D后，綠洲3號幼葉出愈率仍為0。

2.2.2 2,4-D對綠洲3號莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響 試驗(yàn)兩周后在部分莖段上長出芽(圖1)，部分長出愈傷組織(圖2)。以MS+0.5 mg·L-16-BA為基本培養(yǎng)基時(shí)，2,4-D從0.5～3.0 mg·L-1，4個(gè)濃度梯度間發(fā)芽率沒有顯著差異(P>0.05)，為49.660%～54.440%(表3)。出愈率隨著2,4-D濃度的增高呈先上升后下降再上升的趨勢。而以MS+2.0mg·L-16-BA為基本培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)芽率隨著2,4-D濃度的增高呈下降趨勢，處理D5和D6的發(fā)芽率較高，分別為77.300%和76.910%，顯著高于其它處理(P<0.05)。出愈率隨著2,4-D濃度的增高呈先升后降再上升的趨勢。綜合比較，出愈率在以MS+0.5 mg·L-16-BA+3.0 mg·L-12,4-D時(shí)達(dá)到最高水平，此時(shí)出愈率為38.899%，顯著高于其它濃度(P<0.05)。

表3 不同濃度的6-BA和2,4-D組合對綠洲3號莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Influence of different concentrations combination of 6-BA and 2,4-D on stems of Lvzhou No.3. callus induction

圖1 綠洲3號芽圖Fig.1 Lvzhou No.3 buds

圖2 綠洲3號莖段愈傷組織Fig.2 Lvzhou No.3 stems callus

2.2.3 2,4-D對綠洲3號芽愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以芽為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)愈傷組織見圖3，出愈率都隨著2,4-D濃度的升高呈現(xiàn)出先減少后增大的趨勢，6-BA濃度為0.5和2.0 mg·L-1時(shí)，出愈率均在2,4-D濃度為2.0mg·L-1時(shí)達(dá)到最低水平，為0，顯著低于其它處理(P<0.05)。出愈率在MS+0.5 mg·L-16-BA+3.0 mg·L-12,4-D時(shí)達(dá)到最高水平，此時(shí)出愈率為86.111%(表4)。

圖3 綠洲3號芽愈傷組織Fig.3 Lvzhou No.3 buds callus

2.2.4 PVP對綠洲3號芽愈傷組織誘導(dǎo)的影響 從出愈率來看，以MS+0.5 mg·L-16-BA+1.0 g·L-1PVP作為基本培養(yǎng)基，不同濃度處理中的2,4-D對綠洲3號幼葉、莖段和芽的愈傷組織誘導(dǎo)出愈率各不相同(表5)。不同濃度2,4-D對幼葉的誘導(dǎo)，出愈率均為0，對莖段的誘導(dǎo)出愈率分別為12.222%、12.778%和35.000%，而對芽的誘導(dǎo)出愈率差異均達(dá)極顯著(P<0.01)，為75.000%～100%。綜合出愈率，以MS+0.5 mg·L-16-BA+1.0 g·L-1PVP其中，誘導(dǎo)出愈率表現(xiàn)為芽>莖段>幼葉。

表4 不同濃度的6-BA和2,4-D組合對綠洲3號 芽愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 4 Influence of different concentrations combination of 6-BA and 2,4-D on bud of Lvzhou No.3. callus induction

表5 PVP和不同濃度的生長素對綠洲3號愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 5 Influence of different concentrations combination of auxin and PVP on Lvzhou No.3 callus induction

注：同列不同大寫字母表示不同處理間差異極顯著(P<0.01)。

Note: Different capital letters within the same column indicate significant difference at 0.01 level.

3 討論與結(jié)論

植物愈傷組織培養(yǎng)中，外植體污染是阻礙其成功的最常見問題之一[13]。用自來水較長時(shí)間沖洗外植體，是獲得有效消毒的重要環(huán)節(jié)之一[14-15]，由于酒精溶液穿透力很強(qiáng)，消毒時(shí)間不宜過長[16]，所以研究中75%酒精消毒時(shí)間為30 s。當(dāng)消毒劑超過一定濃度或消毒時(shí)間超過一定范圍時(shí)會(huì)對植物的各種組織造成損傷甚至致死，且導(dǎo)致外植體污染率下降和死亡率上升[17]。本研究中HgCl2的消毒效果優(yōu)于NaClO。用不同濃度的NaClO溶液對綠洲3號莖段進(jìn)行不同時(shí)間消毒，其發(fā)芽率最優(yōu)的僅為25%，且研究中細(xì)菌和霉菌污染嚴(yán)重。而對于同一種外植體莖段，用HgCl2進(jìn)行消毒發(fā)芽率最佳可達(dá)到66%左右?？梢?，NaClO對綠洲3號外植體的消毒不夠徹底，消毒效果不理想。綠洲3號外植體消毒宜選用0.1% HgCl2溶液。這與其它植物的外植體消毒溶液的選擇基本一致，分別使用多種消毒劑進(jìn)行消毒時(shí)發(fā)現(xiàn)，HgCl2溶液消毒效果較好[18-20]。

愈傷組織誘導(dǎo)中細(xì)胞分裂素和生長素是必不可少的[21]，且低濃度的細(xì)胞分裂素與中、低濃度的生長素能更好地誘導(dǎo)愈傷組織[22-23]。這與本研究結(jié)果基本一致，細(xì)胞分裂素6-BA濃度為0.5 mg·L-1的誘導(dǎo)率明顯高于2.0 mg·L-1的誘導(dǎo)率。在眾多禾本科植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)中，2,4-D被公認(rèn)為誘導(dǎo)愈傷組織效果最好[24-28]。2,4-D濃度在0.5～3.0 mg·L-1的范圍內(nèi)莖段和幼芽都可以誘導(dǎo)出愈傷組織，但出愈率差異明顯，并且幼葉無愈傷組織。本研究表明，3.0 mg·L-1是最佳濃度，這與前人對禾本科的組織培養(yǎng)研究的最佳濃度基本一致[29-31]。

愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)1.0 g·L-1PVP能有效促進(jìn)綠洲3號芽愈傷組織的誘導(dǎo)，而對莖段和幼葉的作用不顯著。在使用某一濃度范圍內(nèi)的PVP對愈傷組織誘導(dǎo)率有一定的促進(jìn)作用，這與肖莉杰等[32]證實(shí)1.0 g·L-1PVP能促進(jìn)玉米(Zeamays)成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)基本一致。

綜上，綠洲3號莖段消毒中，NaClO對綠洲3號莖段有一定的毒害作用，消毒后使莖段發(fā)黃和軟化而致死。為盡量降低污染率，又保持較高發(fā)芽率，用0.1% HgCl2溶液消毒18 min效果最佳。綠洲3號愈傷組織誘導(dǎo)中，以芽、幼葉和莖段為外植體，最佳誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+1.0 g·L-1PVP+3.0 mg·L-12,4-D，其中以芽的出愈率最高為100%。在綠洲3號芽誘導(dǎo)中加入1.0 g·L-1PVP能顯著促進(jìn)誘導(dǎo)率。

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(責(zé)任編輯 武艷培)

Study on callus inductions of Lvzhou No.3 ——a new material ofArundo

Lin Zhi-kui1,2, Luo Zong-zhi2,3, Mei Lan1,2, Liu Hong-wei1,2, Wu Jin-shou2, Lin Zhan-xi2

(1.School of life sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;2.China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology, Fuzhou 350002, China;3.College of Animal Science, Fujian Agriculture and Foresty University, Fuzhou 350002, China)

In order to induce callus, the experiment was conducted to study the sterilization effects of NaClO (or Antiformin) and HgCl2on stems respectively by using Lvzhou No.3 as materials. We took the sterile stems, germs and young leaves derived from the sterile stems as explants, different concentrations of hormones and 1.0 g·L-1PVP were used for callus induction. The results showed that the best sterilization effect is to use 0.1% HgCl2to sterilize for 18 min and the pollution rate was 13%. While NaClO cannot be sterilized effectively, and it also has toxic effect on stem segment. The culture mediums with best induction effect were MS+0.5 g·L-16-BA, 1.0 g·L-1PVP and 3.0 g·L-12,4-D. In three kinds of explants, the order of induction rate was germs>stems>young leaves. 1.0 g·L-1PVP can be used to promote the induction rate of buds significantly, making 100% callus formation.

Lvzhou No.3; stem; callus inductions; NaClO; PVP

Lin Zhan-xi E-mail:371093941@qq.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0186

2016-04-12 接受日期：2016-08-30

國家林業(yè)局公益性行業(yè)專項(xiàng)“渾善達(dá)克沙地疏林型植被建設(shè)技術(shù)研究”(201504412);國家林業(yè)局引進(jìn)國外技術(shù)、管理人才項(xiàng)目(示范項(xiàng)目)“萊索托綠洲一號引種及繁育栽培技術(shù)推廣示范”(K43NA901A)第一作者：林志魁(1990-)，男，福建東山人，在讀碩士生，主要從事植物遺傳轉(zhuǎn)化研究。E-mail:371093941@qq.com

林占熺(1943-)，男，福建連城人，研究員，博導(dǎo)，博士，主要從事菌草技術(shù)的研究、推廣和教學(xué)工作。E-mail:lzxjuncao@163.com

S567.23+9

A

1001-0629(2016)10-2012-07*

林志魁,羅宗志,梅蘭,劉宏偉,吳金壽,林占熺.蘆竹屬新材料綠洲3號的愈傷組織誘導(dǎo).草業(yè)科學(xué),2016,33(10)：2012-2018.

Lin Z K,Luo Z Z,Mei L,Liu H W,Wu J S,Lin Z X.Study on callus inductions of Lvzhou No.3——a new material ofArundo.Pratacultural Science，2016,33(10)：2012-2018.